雞組織中泰拉霉素殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測

徐曹燕，李　琳，湯春蓮，阮祥春，曾明華

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2 安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽 合肥 230091)

雞組織中泰拉霉素殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測

徐曹燕1，李琳1，湯春蓮2，阮祥春1，曾明華1

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2 安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽 合肥 230091)

[摘要]【目的】 建立雞血漿、肌肉、肝臟、腎臟中泰拉霉素殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測方法。【方法】 制備雞血漿、肌肉、肝臟、腎臟泰拉霉素加標(biāo)樣品，經(jīng)乙腈提取，SCX固相萃取小柱凈化后，40 ℃氮氣吹干，用乙腈-1 mL/L甲酸水溶液(體積比為1∶1)定容，Luna C18(2)色譜柱分離，以乙腈-1 mL/L甲酸水溶液(體積比為90∶10)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，通過質(zhì)譜分析進(jìn)行外標(biāo)法定量，再通過試驗確定HPLC-MS/MS的檢出限和定量限，并對血漿和肌肉、肝臟、腎臟分別進(jìn)行10，20，50 μg/L 和10，20，50 μg/kg 3個水平的泰拉霉素添加回收試驗?！窘Y(jié)果】 在5～200 μg/L血漿樣品和 5～200 μg/kg肌肉、肝臟、腎臟樣品中，泰拉霉素含量與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R>0.99)，血漿和肌肉、肝臟、腎臟樣品中的泰拉霉素檢出限依次為0.8 μg/L和0.5，0.8，0.5 μg/kg，定量限依次為2.0 μg/L和1.0，2.0，1.0 μg/kg。添加回收試驗的平均回收率為80.3%～104.4%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%～9.2%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～12.7%?！窘Y(jié)論】 HPLC-MS/MS方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于雞組織中泰拉霉素藥物殘留的確證和定量檢測。

[關(guān)鍵詞]雞；泰拉霉素；殘留檢測；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

泰拉霉素(Tulathromycin)是一種新型的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其因藥效高而逐漸取代了市場上廣泛使用卻已出現(xiàn)不同程度耐藥性的其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物。泰拉霉素給藥后具有藥物吸收迅速、半衰期長、生物利用度高等優(yōu)點[1-3]，該藥于2004年在歐盟和美國上市，我國農(nóng)業(yè)部在2008年第957號公告中首次允許在動物生產(chǎn)中使用[4]，因此加強該藥物的殘留檢測，對保障動物源性食品安全具有重要意義。

目前，大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的檢測方法有氣質(zhì)聯(lián)用法[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[7-8]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[9]。因泰拉霉素結(jié)構(gòu)中不含發(fā)色基團(tuán)，因此不能采用常規(guī)的高效液相色譜-紫外或熒光檢測器測定[10]，而UPLC-MS/MS法尚未普及，對雞組織中泰拉霉素殘留檢測的HPLC-MS/MS方法也尚未見報道。為此，本試驗用乙腈提取樣品，SCX小柱凈化后采用HPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測法檢測雞組織泰拉霉素的殘留情況，以期為雞肉中泰拉霉素殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于96%，由南京森貝伽生物科技有限公司進(jìn)口分裝；Oasis LC-SCX柱，WATERS公司產(chǎn)品；甲酸、甲醇、正己烷均為色譜純試劑，購自德國Merck KGaA Chemicals公司；氨水，國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

MS3 Basic 型渦漩混合器、RV 10 Control旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，均購自德國IKA公司；CR22G型高速冷凍離心機，購自日本HITACHI公司；MULTIVAP118型氮氣吹干儀，美國Organomation 公司；AM-6型高速勻漿機，購自NISSEI精機制作所；液質(zhì)聯(lián)用儀，由Agilent 1100型液相系統(tǒng)和API 2000型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀串聯(lián)而成。

1.1.2試驗動物1日齡羅曼蛋雞，購自安徽省長豐縣安禽禽業(yè)有限公司，于25 ℃左右的實驗動物房內(nèi)飼養(yǎng)，飼喂不含藥物的飼料，自由采食飲水，飼養(yǎng)至21日齡用于試驗。

1.2泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

精確稱取泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.005 21 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃保存。精密吸取儲備液1 mL于100 mL棕色容量瓶，用乙腈-1 mL/L甲酸水溶液(體積比1∶1)定容，得質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3樣品前處理

1.3.1血漿采集健康雞血液，制備血漿(空白樣品)，于-20 ℃冰箱保存，使用時自然解凍，搖勻。取0.5 mL空白血漿樣品置于2.0 mL離心管中，加入一定量的泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制成含10，20和50 μg/L泰拉霉素的血漿樣品，于渦旋混合器上混合2 min；加0.5 mL乙腈，于旋渦混合器上混合2 min；14 000 r/min高速離心5 min，吸取上清液，過0.22 μm纖維濾膜至進(jìn)樣瓶，供HPLC-MS/MS分析。

1.3.2肌肉樣品取健康雞的肌肉(空白樣品)于絞肉機中絞成肉泥狀，于-20 ℃冰箱保存，使用時自然解凍。準(zhǔn)確稱取(2±0.02) g空白肌肉樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入一定量的泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制成含10，20和50 μg/kg泰拉霉素的肌肉樣品，于旋渦混合器上混合2 min；加入10 mL提取液，渦旋1 min，超聲5 min，5 000 r/min離心10 min；上清液移入另一離心管中，向沉淀中加入8 mL提取液重提一次。合并2次上清液，于50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入5 mL溶解液，2 000 r/min渦旋1 min，再加入8 mL正己烷脫脂，2 500 r/min渦旋1 min，靜置3 min，棄去正己烷層，再加入6 mL正己烷重復(fù)脫脂一次。下層液直接過預(yù)先用5 mL甲醇活化并用5 mL水平衡的SPE柱(流速約為1 mL/min)，5 mL水洗滌柱子，負(fù)壓抽干后用5 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液于40 ℃水浴氮氣吹干。用1 mL溶解液溶解，過0.22 μm纖維素膜后上機檢測。

1.3.3肝臟、腎臟樣品分別準(zhǔn)確稱取(1±0.01) g肝臟、腎臟樣品(空白樣品)，進(jìn)行前處理，處理步驟與肌肉樣品一致。

1.3.4肌肉、肝臟、腎臟樣品處理條件的優(yōu)化為達(dá)到篩選肌肉、肝臟、腎臟樣品最優(yōu)的泰拉霉素提取條件，本試驗選取溶解液(A)、固相萃取柱(B)、提取液(C)和洗脫液(D)4個關(guān)鍵因素，每個因素設(shè)3個水平進(jìn)行L9(34)正交試驗，具體的因素水平見表1。通過比較在肌肉、肝臟、腎臟樣品中添加10 μg/kg泰拉霉素后各因素、各水平下的平均回收率，確定最佳提取條件。

表 1　泰拉霉素提取條件正交優(yōu)化試驗的因素與水平

1.4HPLC-MS/MS分析條件

1.4.1色譜條件色譜柱：采用美國Phenomenex公司的Luna C8與Luna C18柱，二者規(guī)格(150 mm×2.00 mm，5 μm)相同；流動相:A相+B相，分別為乙腈+2 mmol/L乙酸銨溶液(含1 mL/L甲酸)、乙腈(含1 mL/L甲酸)+2 mmol/L乙酸銨溶液(含1 mL/L甲酸)、乙腈+2 mL/L甲酸水以及乙腈+1 mL/L甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表2；流速：300 μL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表 2　HPLC-MS/MS分析的梯度洗脫程序

1.4.2質(zhì)譜條件對1.0 μg/mL的泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，掃描質(zhì)量范圍為100～900 amu，時間為1～2 min，使用默認(rèn)值和推薦值設(shè)定主要參數(shù)的初始值，在電噴霧離子源(ESI)、正離子檢測模式及多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)條件下，分別對電噴霧電壓(IS)、離子化溫度(TEM)、氣簾氣(CUR)流速、霧化氣流速、輔助氣流速、聚焦電壓(FP)、碰撞室射出電壓(CXP)、碰撞氣(CAD)、碰撞能量(CE)、離子對、保留時間、去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化。待測的母離子明顯比周圍的噪音離子高，通過改變DP、GS1觀察離子的增減，選擇適當(dāng)?shù)腄P、GS1值，使噴霧平穩(wěn)有效，以確定母離子和子離子。根據(jù)所確定的母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描，選擇豐度較高、干擾較小的2個子離子為定性離子，以豐度最高的離子作為定量離子，改變碰撞能量(CE)值使母離子的豐度為子離子的1/3～1/4最佳。

1.5檢測方法的線性范圍分析

準(zhǔn)確移取適量泰拉霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白組織提取液配成泰拉霉素質(zhì)量濃度分別為5，10，20，50，100，150，200 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機檢測后，以質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制曲線，求其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R)。以信噪比為3時的泰拉霉素質(zhì)量濃度為檢測限(LOD)，信噪比為10時的泰拉霉素質(zhì)量濃度為定量限(LOQ)，最終確定檢測限和定量限。

1.6回收率和精密度測定

血漿、肌肉、肝臟、腎臟 4種空白組織樣品按 1.3 的方法進(jìn)行處理，獲得空白提取液備用。添加泰拉霉素，對空白血漿樣品和肌肉、肝臟、腎臟分別設(shè)定10，20，50 μg/L 和10，20，50 μg/kg 3個水平進(jìn)行加標(biāo)試驗，每個水平6個平行，按1.3的方法進(jìn)行處理，上機測定后計算回收率。3個添加水平在1日內(nèi)重復(fù)測定3次，計算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后在1周內(nèi)連續(xù)測定3 d計算日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2結(jié)果與分析

2.1肌肉、肝臟和腎臟樣品處理條件的優(yōu)化

泰拉霉素提取條件的正交試驗結(jié)果見表3，通過比較表3極差(R)得到各因素對試驗結(jié)果影響的大小次序為提取液>洗脫液>固相萃取柱>溶解液；通過比較平均值k，并結(jié)合峰型得最佳提取組合為A2B3C3D2，即以乙腈為提取液，用乙腈-1 mL/L甲酸水溶液(體積比1∶1)作為旋蒸后的溶解液，用LC-SCX柱凈化，40 mL/L氨甲醇溶液洗脫。

表 3　雞肉組織中泰拉霉素提取條件的正交試驗優(yōu)化

注：K1、K2、K3分別為各因素各水平下平均回收率之和；k1、k2、k3為各因素各水平下平均回收率的均值；極差R=最大平均值-最小平均值。

Note:K1，K2andK3represent the average recovery rates of various factors at each level.k1，k2andk3represent the average value of average recovery rates at each level.R=max average value-min average value.

2.2色譜條件的優(yōu)化

色譜柱選用Luna C18柱(150 mm×2.00 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A相)+1 mL/L甲酸水溶液(B相)，按表2進(jìn)行梯度洗脫時，泰拉霉素的分離效果較好，檢測靈敏度較高，且峰型對稱良好，無拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

優(yōu)化的質(zhì)譜條件：電噴霧電壓(IS)為5 500 V，離子化溫度(TEM)為500 ℃，氣簾氣(CUR)流速為N250.0 L/min，霧化氣流速為N250.0 L/min，輔助氣流速為N250.0 L/min，聚焦電壓(FP)為400 V，碰撞室射出電壓(CXP)為13.0 V，碰撞氣(CAD)為高純氮氣。 在質(zhì)譜ESI模式和正離子檢測模式下，泰拉霉素響應(yīng)良好，可以確定該藥物的分子離子[M+H]+，再以[M+H]+作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描。選取干擾小、信號相對較強的2個碎片離子，與其母離子組成相應(yīng)的離子對，其中以豐度高、干擾小的2個子離子為定性離子，以豐度最高的離子作為定量離子[11]。試驗優(yōu)化確定的離子對、保留時間、去簇電壓及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表4。

表 4　泰拉霉素的保留時間和部分質(zhì)譜參數(shù)

注：帶*的離子對為定量分析離子對。

Note:* indicates quantitative analysis of ions.

2.4檢測方法的線性范圍及檢出限和定量限

為消除基質(zhì)效應(yīng)，以基質(zhì)加標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)見圖1。由圖1可知，各方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明在泰拉霉素含量水平為5～200 μg/kg(雞肉、肝臟、腎臟樣品)或5～200 μg/L(血漿樣品)時，泰拉霉素水平與峰面積線性關(guān)系良好。泰拉霉素在血漿和肌肉、肝臟、腎臟中的LOD分別為0.8 μg/L和0.5，0.8，0.5 μg/kg，LOQ分別為2.0 μg/L和1.0，2.0和1.0 μg/kg。

圖 1泰拉霉素在雞組織中的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

血漿中泰拉霉素含量的單位為μg/L；肌肉、肝臟、腎臟中泰拉霉素含量的單位為μg/kg

Fig.1Linear regression equations and correlation coefficients of Tulathromycin in chicken tissues

The Tulathromycin level in plasma has a unit of μg/L;The tulathromycin levels in muscle,liver and kidney of have a unit of μg/kg

2.5檢測方法的回收率和精密度

進(jìn)行3個泰拉霉素含量水平(10，20和50 μg/L的血漿及 10，20和50 μg/kg的雞肉、肝臟、腎臟)6個平行的雞組織樣品添加回收試驗，空白組織樣品提取液和空白組織加標(biāo)樣品(20 μg/kg)試驗的色譜結(jié)果顯示，空白組織樣品的響應(yīng)值很低，無目標(biāo)離子出現(xiàn)，說明空白組織樣品中無待測物；加標(biāo)組織樣品中，目標(biāo)藥物的定量離子對有明顯的色譜峰。由表5可知，4種雞組織的平均回收率為80.3%～104.4%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%～9.2%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%～12.7%，符合藥物殘留分析要求。泰拉霉素在4種雞組織3個添加水平下的平均回收率大小表現(xiàn)為肌肉>血漿>肝臟>腎臟。泰拉霉素在腎臟中的回收率最低，這可能與腎臟成分較復(fù)雜而不利于藥物的提取有關(guān)。

表 5　泰拉霉素在4種雞組織中的回收率和精密度(n=6)

注：血漿樣品的單位為μg/L；肌肉、肝臟、腎臟樣品的單位為μg/kg。

Note:The plasma sample has a unit of μg/L;The muscle,liver and kidney samples have a unit of μg/kg.

3討論

3.1樣品前處理

3.1.1血漿樣品經(jīng)有機溶劑提取后再經(jīng)SPE柱純化，是藥物殘留提取和純化的基本方法。但由于血漿與其他組織(肌肉、肝臟、腎臟)相比提取較容易，本研究前期試驗通過比較直接提取、直接過SPE柱、過SPE柱并氮吹3種方法對樣品回收率的影響發(fā)現(xiàn)，直接提取的回收率大于過SPE柱，過SPE柱并氮吹的回收率更低，可能因為在凈化和氮吹過程中，經(jīng)過溶液轉(zhuǎn)移、柱子保留、淋洗和洗脫等步驟，每一步都會造成一定損失。所以本試驗對血漿樣品采用乙腈提取，離心后直接進(jìn)行檢測，該方法較簡單又省時且回收率高。

3.1.2肌肉、肝臟、腎臟關(guān)于組織樣品的前處理有最關(guān)鍵的4個因素，包括提取液、SPE柱、 溶解液和洗脫液。對于提取液，本試驗分別以甲醇、1 mL/L 甲酸乙腈、乙腈作為提取溶劑進(jìn)行提取，其中乙腈能更有效地沉淀蛋白，減少雜質(zhì)干擾，同時也利于下一步利用固相萃取柱進(jìn)行凈化，因此選擇乙腈作為提取液，這與倪姮佳等[12]的研究結(jié)果一致。

對于SPE柱，由于泰拉霉素屬于極性化合物，并且其結(jié)構(gòu)中的叔胺基可以被離子化而帶上電荷，適合反相和離子交換保留機理的柱子。C18屬于反相保留機理柱，凈化過程中，柱中的液體不能流干否則會影響提取效率，因此只適用于小批量的樣品處理[13]，不適用于大批量樣品同時處理。另外，在C18柱上，樣品基質(zhì)中萃取的雜質(zhì)會與目標(biāo)物質(zhì)泰拉霉素同時被保留，因此對肝、腎等比較復(fù)雜的樣品凈化效果不理想。而樣品經(jīng)MCX柱處理后，去除雜質(zhì)的效果好，但是藥物回收率偏低，且需要在活化和淋洗后加入磷酸鹽緩沖液才能有效洗去雜質(zhì)并保留目標(biāo)物，操作比較復(fù)雜。LC-SCX萃取柱屬于陽離子交換萃取，適用于弱堿性的大環(huán)內(nèi)酯類的泰拉霉素，在凈化過程中無需加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值，且對于成分復(fù)雜的肝臟和腎臟凈化效果較好，回收率較高。

對于溶解液，當(dāng)選用乙腈-1 mL/L甲酸水溶液時，回收率較高，且峰型較好。這可能是因為弱酸性溶解液有利于弱堿性的泰拉霉素的離子化，而乙腈-2 mL/L甲酸水溶液因酸度過大而對其離子化表現(xiàn)出抑制作用。

對于洗脫液，大環(huán)內(nèi)酯類常使用純甲醇和氨甲醇，使用純甲醇和含5 mL/L甲酸的甲醇回收率較低且雜峰較多，這可能是因為泰拉霉素易溶于甲醇，高含量的甲醇在洗脫過程中將雜質(zhì)和樣品同時洗掉，因而回收率偏低。通過正交試驗，最終獲得最佳前處理組合方案為：以乙腈為提取液，用LC-SCX柱凈化，乙腈-1 mL/L甲酸水復(fù)溶，40 mL/L氨化甲醇洗脫。

基質(zhì)效應(yīng)是指分析測定中，色譜分離時的共洗脫物質(zhì)改變了待測成分的離子化效率，從而引起的信號減弱或增強。噴霧離子化方法容易受樣品基質(zhì)的影響，從而影響測定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。文獻(xiàn)[12]用空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液，可使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有相同的離子化條件，能消除或降低基質(zhì)效應(yīng)。因此本研究通過基質(zhì)加標(biāo)可使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有相同的離子化條件，從而消除了樣品基質(zhì)對離子化的抑制或促進(jìn)作用。比較溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，發(fā)現(xiàn)2種曲線的斜率有一定差異，說明空白基質(zhì)對泰拉霉素存在基質(zhì)效應(yīng)，肌肉基質(zhì)對泰拉霉素的離子化有促進(jìn)作用，血漿、肝臟、腎臟基質(zhì)對泰拉霉素的離子化有抑制作用。

3.2色譜分離條件的優(yōu)化

泰拉霉素是含有弱堿性叔胺基團(tuán)并具有脂溶性的極性化合物，在硅膠基固定相中易發(fā)生拖尾，因此測定中一般以高純硅膠為基質(zhì)并用端基經(jīng)封尾處理的C8或C18填料作固定相[14]。本試驗分別采用Luna C8與Luna C18 2種相同規(guī)格的色譜柱，分離效果無太大區(qū)別，但后者響應(yīng)值較高，與C8[15]相比峰型良好且較對稱，因此選用保留效果較好的C18色譜分離柱。堿性化合物的HPLC-MS/MS分析在酸性而且富含有機溶劑(甲醇、乙腈)的流動相條件下更有利于離子化，從而提高分析的靈敏度[16]。但由于甲醇分離效果不如乙腈好，因此選用乙腈作為流動相，然后通過調(diào)節(jié)流動相中緩沖溶液的pH值、離子強度和有機溶劑(乙腈)比例確定最佳流動相。本研究選用乙腈+2 mmol/L乙酸銨溶液(含1 mL/L 甲酸)、乙腈(含1 mL/L甲酸)+2 mmol/L乙酸銨溶液(含1 mL/L甲酸)、乙腈+2 mL/L甲酸水以及乙腈+1 mL/L甲酸水溶液4種流動相分別進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明，在正離子模式下，有機溶劑和水相中同時含1 mL/L甲酸及僅水相中含2 mL/L甲酸時，因酸度過高而對離子化有抑制作用，另外乙酸銨主要用于解決峰型不好[12]，而本研究中當(dāng)水相中僅含1 mL/L甲酸時，峰型良好對稱且無拖尾現(xiàn)象。與流動相中添加乙酸銨相比，操作簡單省時。因此最終選用響應(yīng)值高的乙腈(A相)+1 mL/L甲酸水溶液(B相)作為流動相。

3.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入質(zhì)譜離子源，在正離子掃描模式下，分別進(jìn)行分子離子[M+H]+掃描、子離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)分析，掃描時間為150 ms。調(diào)節(jié)錐孔電壓DP值，通常DP值的優(yōu)化范圍為25～70 V，使分子離子對信號強度達(dá)到最大且穩(wěn)定；子離子掃描時，找出子離子產(chǎn)生響應(yīng)值較高的碎片離子對信息，改變碰撞能量(CE)值，當(dāng)分子離子的強度為子離子強度的1/3～1/4時，以此時的碰撞能量(CE)值為宜[11]。最后進(jìn)行MRM掃描，再次優(yōu)化DP、CE值和聚焦電壓 (FP)、射入電壓 (EP)、噴霧電壓(IS)及離子化溫度(TEM)等相關(guān)參數(shù)，以確定最佳的質(zhì)譜條件。

4結(jié)論

建立了雞體內(nèi)泰拉霉素殘留的HPLC-MS/MS檢測方法，泰拉霉素在雞血漿、肌肉、肝臟、腎臟中的添加回收率為80.3%～104.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%～12.7%，LOD分別為0.8 μg/L和0.5，0.8，0.5 μg/kg，LOQ分別為2.0 μg/L和1.0，2.0，1.0 μg/kg。該方法檢出限、準(zhǔn)確度和精密度均滿足殘留檢測要求，為雞體內(nèi)泰拉霉素殘留的檢測奠定了基礎(chǔ)。

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Determination of Tulathromycin residues in chicken using liquid chromatography-tandem mass spectrometry

XU Cao-yan1,LI Lin1,TANG Chun-lian2,RUAN Xiang-chun1,ZENG Ming-hua1

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036，China;2InstituteofAnhuiAnimalFeedandVeterinaryDrugControl,Hefei,Anhui230091,China)

Abstract:【Objective】 An analytical method based on liquid chromatography tandem mass spectrometry was developed for the determination of Tulathromycin residues in chicken tissues.【Method】 Samples were extracted with acetonitrile and cleaned-up SCX cartridge.The Tulathromycin were separated with luna C18 column by a gradient elution program with 1 mL/L acetonitrile and 1 mL/L formic acid-water as the mobile phase.The identification of Tulathromycin was carried out by positive electrospray ionization (ESI+) in multiple-reaction monitoring (MRM) mode.The quantitation was performed by the external standard method.Add and recovery experiment was also conducted with different Tulathromycin levels for plasma,muscle,liver and kidney.【Result】 There was a good linear relationship between Tara kanamycin concentration and peak area (R>0.99) in plasma (5-200 μg/L) and muscle,liver,and kidney (5-200 μg/kg).Recovery rates were 80.3% to 104.4% at three spiked levels of 10,20,50 μg/kg and the relative standard deviations (RSDs) were 5.0%-9.2% for intra-day and 5.2%-12.7% for inter-day determinations.Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of plasma,muscle,liver,and kidney samples were 0.8 μg/L and 0.5,0.8,0.5 μg/kg,and 2.0 μg/L and 1.0,2.0,1.0 μg/kg,respectively.【Conclusion】 The established method was simple,rapid,accurate and suitable for quantitative determination and confirmation of tulathromycin in real samples.

Key words:chicken;Tulathromycin;residue detection;high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.003

[收稿日期]2014-09-26

[基金項目]安徽省高校省級自然科學(xué)基金重點項目(KJ2012A115)

[作者簡介]徐曹燕(1989-),女，安徽阜陽人，在讀碩士，主要從事動物源性食品安全研究。E-mail:xucaoyan@126.com [通信作者]曾明華(1973-),男，安徽金寨人,副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)和動物毒理學(xué)研究。 E-mail：zmhzmh@ahau.edu.cn

[中圖分類號]S859.84

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0016-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.006.html