• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001 cpxR基因敲除突變株的構(gòu)建及其抑菌活性研究

    2016-07-02 02:58:01張淑靜郭薔薇王永宏
    關(guān)鍵詞:線蟲(chóng)菌落質(zhì)粒

    湯 倩,張淑靜,郭薔薇,王永宏,張 興

    (西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心/陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心,陜西 楊凌712100)

    嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001cpxR基因敲除突變株的構(gòu)建及其抑菌活性研究

    湯倩,張淑靜,郭薔薇,王永宏,張興

    (西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心/陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心,陜西 楊凌712100)

    [摘要]【目的】 通過(guò)同源重組技術(shù)敲除嗜線蟲(chóng)致病桿菌(Xenorhabdus nematophila) YL001中cpxR基因,為進(jìn)一步研究CpxR調(diào)節(jié)子調(diào)控抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的機(jī)理奠定基礎(chǔ)?!痉椒ā?通過(guò)融合PCR技術(shù),將cpxR基因的上、下游同源片段及質(zhì)粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3個(gè)片段連接,克隆到自殺載體pDM4中,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1λpir中,經(jīng)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入嗜線蟲(chóng)致病桿菌內(nèi),通過(guò)同源重組敲除cpxR基因;采用瓊脂擴(kuò)散法和抑制菌絲生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定突變菌株對(duì)枯草芽孢桿菌和番茄灰霉病菌的抑制作用?!窘Y(jié)果】 從X.nematophila YL001基因組中成功敲除cpxR基因,得到了ΔcpxR突變菌株;ΔcpxR突變菌株對(duì)枯草芽孢桿菌和番茄灰霉病菌的抑制作用較野生菌株分別提高了1.4和1.7倍。【結(jié)論】 CpxR負(fù)向調(diào)控嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生。

    [關(guān)鍵詞]嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001;cpxR基因;基因敲除;抗菌活性

    嗜線蟲(chóng)致病桿菌存在于昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)腸道內(nèi),與斯氏線蟲(chóng)(Steinernema)共生,屬腸桿菌科革蘭氏陰性細(xì)菌[1],其在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種具有生物活性的抗生素類(lèi)物質(zhì),如細(xì)菌素、幾丁質(zhì)酶、假肽類(lèi)、二硫吡咯類(lèi)等[2]。這些代謝產(chǎn)物不僅具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu),而且在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上具有廣泛的生物活性,如抗細(xì)菌、抗真菌、殺蟲(chóng)、殺線蟲(chóng)、抗?jié)儭⒖鼓[瘤和抗病毒活性等。這些化合物結(jié)構(gòu)新穎,生物活性高,具備開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥的潛質(zhì)。

    XenorhabdusnematophilaYL001是從陜西楊凌篩選昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)中分離鑒定的1株共生菌,前期研究發(fā)現(xiàn), YL001 的發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抑菌活性,對(duì)番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)等病原真菌和細(xì)菌均具有不同程度的拮抗作用[3],具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。

    近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,細(xì)菌、線蟲(chóng)和昆蟲(chóng)之間相互作用的分子基礎(chǔ)得到了廣泛而深入的研究。在X.nematophila中,3個(gè)主要調(diào)控子Lrp (Leucine responsive regulatory protein)、LrhA (LysR-type regulator)和CpxR(Two-component system CpxRA中一種反應(yīng)調(diào)節(jié)子) 單獨(dú)或協(xié)同形成級(jí)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而調(diào)控X.nematophila生活史的3個(gè)階段(侵染、繁殖及轉(zhuǎn)移)中細(xì)菌、線蟲(chóng)和昆蟲(chóng)之間相互作用所需基因的表達(dá)[4]。其中, Lrp作為一種主要的調(diào)控子,位于復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂端,負(fù)向調(diào)控nilABC基因的表達(dá),調(diào)控共生菌與線蟲(chóng)的共生關(guān)系,通過(guò)激活 Lrh 調(diào)控共生菌對(duì)寄主昆蟲(chóng)的致病性[5],同時(shí)Lrp對(duì)共生菌的細(xì)胞功能(營(yíng)養(yǎng)與能量代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)與分泌及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))也有廣泛影響[6]。LrhA 可激活共生菌與毒性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),包括鞭毛的合成,毒素、溶血素、蛋白酶和酯酶的產(chǎn)生,還可以正向調(diào)控鞭毛主調(diào)控子 FlhDC 的表達(dá)[7-8]。CpxRA 正向調(diào)控lrhA、運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因、酯酶和相關(guān)定植因子基因的表達(dá),負(fù)向調(diào)控溶血素、蛋白酶、 抗生素和菌毛蛋白的產(chǎn)生,從而影響共生菌的致病性和共生性[9-11]。雖然CpxRA調(diào)控某一基因的功能已經(jīng)明確,但其具體調(diào)控抗生素產(chǎn)生的機(jī)理還不清楚,抗菌活性的提高是基因沉默后重新表達(dá)而產(chǎn)生新的抗生素還是原有抗生素含量有所提高,尚有待進(jìn)一步研究。因此,本研究擬構(gòu)建嗜線蟲(chóng)致病桿菌cpxR基因缺失突變菌株,以期進(jìn)一步研究cpxR基因失活提高X.nematophila殺菌活性的機(jī)理,并為嗜線蟲(chóng)致病桿菌其他基因的敲除提供可行性依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1菌株與質(zhì)粒供試菌株嗜線蟲(chóng)致病桿菌(Xenorhabdusnematophila) YL001(氨芐抗性)、大腸桿菌(Escherichilacoli) DH5α、大腸桿菌(Escherichilacoli) S17-1λpir、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea),以及質(zhì)粒pJCV53、自殺質(zhì)粒pDM4(氯霉素抗性),均由本實(shí)驗(yàn)室保存。本研究中如無(wú)特殊說(shuō)明,抗生素使用質(zhì)量濃度為:氨芐青霉素(Amp)150 μg/mL,氯霉素(Cm) 25 μg/mL,卡那霉素(Km) 50 μg/mL。

    1.1.2培養(yǎng)基NBTA鑒別培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,瓊脂粉14 g,氯化三苯基四氮唑0.04 g,溴麝香百里酚藍(lán)0.025 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2~7.4。

    NB 培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,蒸餾水 1 000 mL,pH 7.2~7.4。

    NA 培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,瓊脂粉15 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2~7.4。

    PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂粉 15 g,蒸餾水1 000 mL。

    LB液體培養(yǎng)基:酵母提取物5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2~7.4。

    LB固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加15 g瓊脂。

    1.1.3主要試劑試驗(yàn)所用dNTPs、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、ExTaq、PrimeSTAR高保真酶,購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物(膠)回收試劑盒,購(gòu)自天根公司;限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶,購(gòu)自NEB公司。其他生化試劑(分析純)均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)。

    1.1.4引物設(shè)計(jì)與合成本研究所用到的引物均由Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)(表1)。由上海生物工程有限公司合成。

    1.2cpxR突變菌株的構(gòu)建、篩選及驗(yàn)證

    1.2.1基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建以嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001基因組DNA 為模板,分別用上、下游引物cpxR-up-F/cpxR-up-R、cpxR-down-F/cpxR-down-R進(jìn)行 PCR,擴(kuò)增cpxR的上、下游片段U和D;同時(shí)以質(zhì)粒pJCV53為模板,用引物Km-F/Km-R進(jìn)行PCR,擴(kuò)增卡那抗性基因。各片段擴(kuò)增的反應(yīng)條件如表2所示。擴(kuò)增完畢使用PCR產(chǎn)物(膠)回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。

    表 1 cpxR基因突變株構(gòu)建及鑒定所用的引物

    注:黑體標(biāo)記的堿基為保護(hù)堿基,橫線標(biāo)記的堿基為酶切位點(diǎn)。

    Note:Black letters: protective base;Horizontal line marked letters represent restriction enzyme cutting sites.

    表 2 目的片段擴(kuò)增的反應(yīng)條件及產(chǎn)物長(zhǎng)度

    1.2.2融合PCR反應(yīng)將純化后的cpxR基因上、下游同源片段及卡那抗性基因3個(gè)片段按 1∶1∶1混合,不添加引物,用PrimeSTAR高保真酶進(jìn)行互補(bǔ)融合,形成全長(zhǎng)的融合PCR產(chǎn)物。PCR程序?yàn)?95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,10個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后,以上述產(chǎn)物為模板進(jìn)行融合片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增,引物對(duì)為cpxR-up-F/cpxR-down-R。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,34個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。最終切膠回收純化PCR產(chǎn)物并將該片段克隆至T載體,進(jìn)行菌落PCR鑒定,選取正確的陽(yáng)性克隆測(cè)序。

    分別以限制性內(nèi)切酶SphⅠ和SacⅠ對(duì)pDM4質(zhì)粒和融合片段進(jìn)行雙酶切,并用試劑盒純化回收,將酶切后的質(zhì)粒和片段按適當(dāng)?shù)谋壤旌?,加入T4連接酶于16 ℃過(guò)夜連接,再將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1λpir感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在37 ℃、200 r/min條件下活化1 h后,取100 μL涂布于LB平板(含25 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素)上,37 ℃倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。通過(guò)PCR鑒定和測(cè)序分析,篩選出含有融合片段且測(cè)序正確無(wú)誤的重組質(zhì)粒pDM4cpxR-up-Km-cpxR-down,鑒定引物為cpxR-up-F/cpxR-down-R。

    1.2.3接合轉(zhuǎn)移及突變菌株的鑒定將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌 S17-1λpir以1%接種量轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)基(含Km 50 μg/mL,Cm 25 μg/mL)中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600為0.4~0.6。同時(shí)將受體菌嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001于28 ℃過(guò)夜活化后以1%接種量轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)至A600為0.4~0.6。將大腸桿菌和嗜線蟲(chóng)致病桿菌等體積混合,室溫、4 000 r/min離心3 min收集菌體,再用100~200 μL不加抗生素的LB液體懸浮。將所有菌懸液鋪在一張孔徑為0.45 μm的硝酸纖維素膜上,待菌液被充分吸收后將其緊貼在LB平板上,28 ℃倒置培養(yǎng)8 h左右,進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移的第一輪重組。然后用LB液體培養(yǎng)基洗滌濾膜,洗下的菌懸液涂布于LB平板(含Amp 150 μg/mL,Km 50 μg/mL)上,28 ℃培養(yǎng)2~3 d,進(jìn)行第一輪重組接合子的篩選。計(jì)算接合轉(zhuǎn)移頻率:接合轉(zhuǎn)移頻率=接合子數(shù)/供體菌數(shù)。

    在供體菌大腸桿菌與受體菌嗜線蟲(chóng)致病桿菌的比例為2∶1的條件下,將接合時(shí)間設(shè)為2,4,6,8,10,12,14 h共7個(gè)處理,研究接合時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)移頻率的影響。

    挑取第一輪重組接合成功的接合子,接種于LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期,將菌液稀釋1 000倍后取100 μL涂布于含5%蔗糖、50 μg/mL Km的LB平板上,28 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落,該單菌落即為第二輪重組成功的克隆(即卡那霉素抗性基因Kmr成功置換cpxR基因),該克隆即為cpxR基因敲除的突變株ΔcpxR。通過(guò)cpxR基因內(nèi)部引物對(duì)NB-F/NB-R以及外部引物對(duì)WB-F/WB-R對(duì)該菌落進(jìn)行PCR鑒定。

    1.3突變菌株發(fā)酵液的抑菌活性測(cè)定

    1.3.1對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性采用生長(zhǎng)速率法[12-13]測(cè)定突變株發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。將發(fā)酵液以10%的比例接入冷卻至40~50 ℃的PDA培養(yǎng)基中,制成平板,以加無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的PDA為對(duì)照。從培養(yǎng)5 d的供試病原菌菌落邊緣,用打孔器取直徑4 mm的菌塊,置于平板中央,于 25 ℃黑暗條件下培養(yǎng),5 d后測(cè)量菌落的直徑,計(jì)算抑制率。計(jì)算公式為:

    菌落生長(zhǎng)直徑(mm)=測(cè)量直徑-4.0(菌餅直徑);

    菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

    1.3.2對(duì)病原細(xì)菌的抑制活性采用瓊脂擴(kuò)散法[14-15]測(cè)定突變株發(fā)酵液對(duì)供試枯草芽孢桿菌的抑菌活性。將熔化的NA培養(yǎng)基冷卻至40~50 ℃,加入體積分?jǐn)?shù)1.5%的供試病原細(xì)菌搖勻,每皿(直徑90 mm)倒入15 mL培養(yǎng)基,制成平板,在帶菌平板上打3個(gè)直徑7.5 mm 的孔,每孔加入70 μL發(fā)酵液,以發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,28 ℃培養(yǎng)48 h,十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小。

    2結(jié)果與分析

    2.1cpxR基因敲除載體的構(gòu)建

    用引物對(duì)cpxR-up-F/cpxR-up-R擴(kuò)增cpxR基因上游同源片段(1 105 bp)、Km-F/Km-R擴(kuò)增卡那抗性基因(973 bp)、cpxR-down-F/cpxR-down-R擴(kuò)增cpxR基因下游同源片段(1 192 bp),擴(kuò)增后回收純化PCR產(chǎn)物。將回收純化后的3個(gè)片段按 1∶1∶1混合,首先不添加引物,用PrimeSTAR高保真酶進(jìn)行互補(bǔ)融合,形成融合PCR產(chǎn)物。之后利用引物對(duì)cpxR-up-F/cpxR-down-R,以上述所得產(chǎn)物為模板,進(jìn)行融合片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增,成功融合的片段大小為3 270 bp。PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示。

    圖 1 目的片段及其融合片段的PCR擴(kuò)增

    對(duì)融合片段與pDM4質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、連接,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1λpir中,待長(zhǎng)出單菌落后,搖菌提取質(zhì)粒,以質(zhì)粒為模板,用引物對(duì)cpxR-up-F/cpxR-down-R來(lái)鑒定陽(yáng)性克隆,可以擴(kuò)增出融合片段,其驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示,說(shuō)明已成功構(gòu)建cpxR基因敲除重組載體pDM4cpxR-up-Km-cpxR-down。

    2.2接合轉(zhuǎn)移及突變株鑒定

    由于嗜線蟲(chóng)致病桿菌對(duì)卡那霉素敏感,同時(shí)含有同源重組載體的大腸桿菌S17-1λpir對(duì)氨芐霉素敏感,因此在氨芐霉素和卡那霉素雙重篩選壓力下生長(zhǎng)起來(lái)的菌落可以初步判斷為一次重組克隆。

    在含有5%蔗糖的LB平板上挑取少量單克隆菌落作為模板,用位于cpxR基因編碼區(qū)的內(nèi)部引物對(duì)NB-F/NB-R及外部引物對(duì)WB-F/WB-R進(jìn)行PCR鑒定,并以嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001野生株基因組DNA為對(duì)照,結(jié)果(圖3)顯示,與陽(yáng)性對(duì)照相比,以突變株基因組DNA為模板,采用cpxR內(nèi)部引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),并無(wú)擴(kuò)增片段出現(xiàn),而采用外部引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),其擴(kuò)增產(chǎn)物比以野生株基因組DNA為模板時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物大約300 bp,說(shuō)明卡那抗性基因Kmr已成功替換了目標(biāo)基因cpxR,該克隆即為cpxR基因敲除后的突變株ΔcpxR。

    圖 3cpxR基因敲除突變株的鑒定

    A.cpxR基因內(nèi)部引物擴(kuò)增結(jié)果;B.cpxR基因外部引物擴(kuò)增結(jié)果;M.DL2000 Marker;1.野生菌株YL001;2.突變菌株ΔcpxR

    Fig.3Identification ofXenorhabdusnematophilaYL001 ΔcpxR

    A.PCR with internal primers;B.PCR with external primers;M.DL2000 Marker;1.Wild type strain YL001;2.Mutant strain

    當(dāng)供體菌(含有同源重組載體的大腸桿菌S17-1λpir)和受體菌(X.nematophilaYL001)接合時(shí)間為12 h時(shí),接合轉(zhuǎn)移頻率最大,為1×10-5(圖4)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是接合時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),供體菌的生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)高于受體菌,以至受體菌數(shù)目遠(yuǎn)小于供體菌,從而降低了接合轉(zhuǎn)移的頻率;而接合時(shí)間過(guò)短時(shí),因重組質(zhì)??赡芪赐耆M(jìn)入受體細(xì)菌而導(dǎo)致接合頻率不高。

    圖 4接合時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)移頻率的影響

    Fig.4Effect of conjunction time on transfer frequency

    2.3ΔcpxR及野生菌株YL001對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

    圖5表明,野生菌株YL001發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌菌絲的抑制率為50.02%,突變菌株發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率為88.26%,是野生菌株的1.7倍。

    圖 5野生菌株YL001和ΔcpxR突變菌株發(fā)酵液

    對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用

    1.空白對(duì)照;2.野生菌株YL001;3.ΔcpxR突變菌株

    Fig.5Inhibitory effect of wild strain YL001 and

    ΔcpxRagasintBotrytiscinerea

    1.CK;2.Wild type strain YL001;3.Mutant strain ΔcpxR

    2.4ΔcpxR及野生菌株YL001對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

    圖6顯示,野生菌株YL001發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為23.17 mm,突變菌株發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為30.89 mm,是野生菌株的1.4倍。

    圖 6 野生菌株YL001和ΔcpxR突變菌株發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

    3討論

    嗜線蟲(chóng)致病桿菌是一種新型的生物防治資源,構(gòu)建無(wú)痕突變株對(duì)其產(chǎn)生抗生素相關(guān)基因的研究至關(guān)重要。本研究利用含反向篩選基因sacB的pDM4質(zhì)粒,通過(guò)同源重組技術(shù)構(gòu)建了cpxR基因缺失株。sacB基因編碼的果聚糖蔗糖酶能催化蔗糖水解成果聚糖,果聚糖對(duì)革蘭氏陰性菌都有致死作用,故含有sacB基因的細(xì)菌不能在蔗糖平板上生長(zhǎng)[16]。整合了pDM4質(zhì)粒的嗜線蟲(chóng)致病桿菌中,只有發(fā)生2次重組的突變株才能在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

    構(gòu)建重組DNA片段的傳統(tǒng)方法包括利用合適的限制性內(nèi)切酶連接重組和通過(guò)加連接子連接重組等,如Herbert等[11]利用酶切連接的方法將X.nematophilacpxR基因上游、鏈霉素抗性基因和cpxR基因下游3個(gè)片段連接在一起,克隆至自殺載體pKR100,構(gòu)成pKRcpxRStr重組質(zhì)粒。但上述2種方法不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且對(duì)于長(zhǎng)片段的連接有時(shí)難以找到合適的酶切位點(diǎn)。而使用融合PCR,將3個(gè)DNA片段放在同一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增,不需要限制性內(nèi)切酶消化和連接酶處理,為同源重組DNA片段的構(gòu)建提供了快速簡(jiǎn)捷的途徑[17-18]。本研究利用該方法,成功構(gòu)建重組自殺載體pDM4-up-Km-down,并對(duì)該片段進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與融合前基因片段序列完全一致,確保后續(xù)其與可以致病桿菌染色體基因組發(fā)生同源重組。

    由于在自然條件下還未鑒定出可獨(dú)立生活的X.nematophila,因此這些細(xì)菌在一般條件下比較脆弱,只有在溫和條件下才能較好生長(zhǎng)[19]。嗜線蟲(chóng)致病桿菌的脆弱性使其很難用電穿孔法進(jìn)行載體DNA的轉(zhuǎn)化,人們嘗試了很多條件下的電擊穿孔法但均未成功,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入致病桿菌細(xì)胞的最可靠方法是用大腸桿菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移[20]。本研究利用接合轉(zhuǎn)移成功構(gòu)建了cpxR基因缺失株,為致病桿菌其他基因的敲除提供了依據(jù)。

    在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行微生物培養(yǎng)時(shí),許多代謝物的生物合成基因保持沉默,使得一些有價(jià)值的化合物不能產(chǎn)生,而這些隱藏的生物合成途徑受到嚴(yán)格的控制,其僅在特殊條件下可被激活[21]。昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌基因組分析表明,發(fā)光桿菌的基因組中含有33個(gè)與次生代謝物合成有關(guān)的基因簇,嗜線蟲(chóng)致病桿菌中含有16個(gè)與次生代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的基因簇[22]。目前從發(fā)光桿菌和嗜線蟲(chóng)致病桿菌中分離鑒定的次生代謝產(chǎn)物的數(shù)量遠(yuǎn)少于其生物合成基因簇的數(shù)量,這種差異可能源于代謝調(diào)節(jié)控制。在細(xì)菌中總調(diào)控子通過(guò)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,其可控制小分子物質(zhì)的產(chǎn)生[23]。Kontnik等[24]研究了發(fā)光桿菌次生代謝物產(chǎn)生的下游調(diào)控,發(fā)現(xiàn)HexA(LysR類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子)基因失活突變可顯著提高一些小分子物質(zhì)的含量,且突變菌株可產(chǎn)生一些新的代謝產(chǎn)物。CpxR是CpxRA雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)蛋白,也是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。在大腸桿菌中,CpxR可調(diào)控100多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[25];在嗜線蟲(chóng)致病桿菌中,CpxR正向調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、酯酶活性及該菌與線蟲(chóng)共生所需相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,負(fù)向調(diào)控溶血素與蛋白酶的產(chǎn)生及抗菌活性[11]。因此,本研究構(gòu)建的cpxR基因缺失突變株為后續(xù)進(jìn)一步明確cpxR基因失活對(duì)提高嗜線蟲(chóng)致病桿菌殺菌活性的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]Thomas G M,Poinar G O.Xenorhabdusgen.nov,a genus of entomopathogenic nematophilia bacteria of the family Enterobacteriaceae [J].International Journal of Systematic Bacteriology,1979,29:352-360.

    [2]魏明敏,邱德文,曾紅梅,等.嗜線蟲(chóng)致病桿菌Xna基因同源重組載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 [J].生物技術(shù)通報(bào),2009(4):91-95.

    Wei M M,Qiu D W,Zeng H M,et al.Construction of homologous recombinant vector ofXnagene and establishment of genetic transformation system ofXenorhabdusnematophila[J].Biotechnology Bulletin,2009(4):91-95.(in Chinese)

    [3]方香玲.昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌的鑒定、培養(yǎng)及其抑菌活性研究 [D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

    Fang X L.Study on identification,culture and antimicrobial activity of entomopathogenic bacteria [D].Yangling,Shannxi:Northwest A&F University,2008.(in Chinese)

    [4]Richards G R,Goodrich-Blair H.Masters of conquest and pillage:Xenorhabdusnematophilaglobal regulators control transitions from virulence to nutrient acquisition [J].Cellular Microbiology,2009,11(7):1025-1033.

    [5]Cowles C E,Richards G R,Martens E C,et al.The global regulator Lrp contributes to mutualism,pathogenesis and phenotypic variation in the bacteriumXenorhabdusnematophila[J].Cellular Microbiology,2007,9(5):1311-1323.

    [6]Lu X J.Examining pathogenic and mutualistic regulatory netw-orks in the bacteriumXenorhabdusnematophila[D].Madison,USA:University of Wisconsin-Madison,2012.

    [7]Park D,Forst S.Co-regulation of motility,exoenzyme and ant-ibiotic production by the EnvZ-OmpR FlhDC-FliA pathway inXenorhabdusnematophila[J].Molecular Microbiology,2006,61(6):1397-1412.

    [8]Richards G R,Herbert E E,Park Y J,et al.Xenorhabdusnem-atophilalrhA is necessary for motility,lipase activity,toxin expression,and virulence inManducasextainsects [J].Journal of Bacteriology,2008,190(14):4870-4879.

    [9]Herbert E E,Goodrich-Blair H.CpxRA contributes toXenorh-abdusnematophilavirulence through regulation of lrhA and modulation of insect immunity [J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(12):3998-4006.

    [10]Herbert E E,Andersen A W,Goodrich-Blair H.CpxRA influencesXenorhabdusnematophilacolonization initiation and outgrowth inSteinernemacarpocapsaenematodes through regulation of thenillocus [J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(12):4007-4014.

    [11]Herbert E E,Cowles K N,Goodrich-Blair H.CpxRA regulates mutualism and pathogenesis inXenorhabdusnematophila[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(24):7826-7836.

    [12]許賢,王永宏,劉霞,等.昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌篩選及其發(fā)酵液抑菌活性初步研究 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,34(7):50-54.

    Xu X,Wang Y H,Liu X,el al.Screening of symbiotic bacteria of entomopathogenic nematode and the antimicrobial activity of its fermentation liquid [J].Journal of Northwest A&F University(Nat Sci Ed),2006,34(7):50-54.(in Chinese)

    [13]劉霞.昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌 YL001菌株的代謝物及其抑菌活性研究 [D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2006.(in Chinese)

    Liu X.Studies on the metabolite and antifungal activity ofXenorhabdusnematophilusYL001 from entomopathogenic nematodes [D].Yangling,Shaanxi:Northwest A&F University,2006.(in Chinese)

    [14]Dongjin D,Yi Y,Kang G H,et al.Identification of an antibacterial compound,benzylideneacetone fromXenorhabdusnematophilaagainst major plant-pathogenic bacteria [J].FEMS Microbiology Letters,2004,239(2):241-248.

    [15]王永宏,張興.2株昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌代謝物的抑菌作用 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,35(2):125-130.

    Wang Y H,Zhang X.Studies on antimicrobial activity of metabolites of symbiotic bacteria associated with entomopathogenic nematodes [J].Journal of Northwest A&F University (Nat Sci Ed),2007,35(2):125-130.(in Chinese)

    [16]劉霞,高鶴,楊琳,等.副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及應(yīng)用 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2011,19(3):188-192.

    Liu X,Gao H,Yang L,el at.Establishment of a suicide vector-based gene knockout method in studies ofVibrioparahaemolyticus[J].Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica,2011,19(3):188-192.(in Chinese)

    [17]王力華,付士紅,唐青,等.三重融合PCR法構(gòu)建感染性辛德畢斯嵌合病毒cDNA克隆 [J].病毒學(xué)報(bào),2006,22(2):107-113.

    Wang L H,Fu S H,Tang Q,el at.Construction of infectious chimeric cDNA clone of sindbis virus by triple fusion PCR [J].Journal of Virology,2006,22(2):107-113.(in Chinese)

    [18]李敏,楊謙.一種高效構(gòu)建同源重組DNA片段的方法:融合PCR [J].中國(guó)生物工程雜志,2007,27(8):53-58.

    Li M,Yang Q.A Rapid method for generation of homologous recombinant fragments:fusion PCR [J].China Biotechnology,2007,27(8):53-58.(in Chinese)

    [19]李宗澤.伯氏致病桿菌YL002的抗菌活性研究及其CpxRA基因的敲除 [D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2011.

    Li Z Z.Mutation ofCpxRAgene inXenorhabdusbovieniiYL002 and study on antimicrobial activity [D].Yangling,Shaanxi:Northwest A&F University,2011.(in Chinese)

    [20]Xu J,Hurlbert R E.Toxicity of irradiated media forXenorhabdussp. [J].Applied and Environmental Microbiology,1990,56(3):815-818.

    [21]Scherlach K,Hertweck C.Triggering cryptic natural product biosynthesis in microorganisms [J].Organic and Biomolecular Chemistry,2009,7(9):1753-1760.

    [22]Duchaud E,Rusniok C,Frangeul L,et al.The genome sequen-ce of the entomopathogenic bacteriumPhotorhabdusluminescens[J].Nature Biotechnology,2003,21(11):1307-1313.

    [23]Martinez A A,Collado V J.Identifying global regulators in transcriptional regulatory networks in bacteria [J].Current Opinion in Microbiology,2003,6(5):482-489.

    [24]Kontnik R,Crawford J M,Clardy J.Exploiting a global regulator for small molecule discovery inPhotorhabdusluminescens[J].ACS Chemical Biology,2010,5(7):659-665.

    [25]Wulf D P,McGuire A M,Liu X,et al.Genome-wide profiling of promoter recognition by the two-component response regulator CpxR-P inEscherichiacoli[J].The Journal of Biological Chemistry,2002,277(29):26652-26661.

    Construction ofcpxRgene deletion mutant strain ofXenorhabdusnematophilaYL001 and study of its antimicrobial activity

    TANG Qian,ZHANG Shu-jing,GUO Qiang-wei,WANG Yong-hong,ZHANG Xing

    (Research&DevelopmentCenterofBiorationalPesticide,NorthwestA&FUniversity/ShaanxiResearchCenterofBiopesticideEngineering&Technology,Yangling,Shaanxi712100,China)

    Abstract:【Objective】 The cpxR gene of nematode pathogenic bacteria Xenorhabdus nematophila YL001 was knocked out by allelic exchange to provide basis for researching regulatory mechanism of CpxR on production of antimicrobial substances.【Method】 In this study,the upstream and downstream flanking DNA fragments of target gene and the kanamycin resistant gene Kmr were fused by PCR before being cloned into the suicide vector pDM4.The recombinant plasmid was introduced into Escherichila coli strain S17-1λpir and transferred into X.nematophila by conjugation.Then,the inhibitory effect of the mutant strain against Bacillus subtilis and Botrytis cinerea was determined.【Result】 The ΔcpxR mutant strain was obtained successfully,and the antimicrobial activities of mutant strains against B.subtilis and B.cinerea were increased by 1.4 and 1.7 times compared with those of the wild strain.【Conclusion】 CpxR negatively regulates the production of antimicrobial substances of X.nematophila YL001.

    Key words:Xenorhabdus nematophila YL001;cpxR;gene knockout;antimicrobial activity

    DOI:網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.018

    [收稿日期]2014-11-21

    [基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171910);陜西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2014JZ004);中央高?;究蒲许?xiàng)目(ZD2013003)

    [作者簡(jiǎn)介]湯倩(1990-),女,河南開(kāi)封人,在讀碩士,主要從事微生物源農(nóng)藥研究。E-mail:tangqian229@126.com [通信作者]王永宏(1968-),男,陜西鳳翔人,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事生物源農(nóng)藥研究。 E-mail:yhwang@nwsuaf.edu.cn

    [中圖分類(lèi)號(hào)]S482.2+92

    [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

    [文章編號(hào)]1671-9387(2016)06-0125-07

    網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.036.html

    猜你喜歡
    線蟲(chóng)菌落質(zhì)粒
    夏季蔬菜換茬期線蟲(chóng)防治要注意
    不同emm基因型化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類(lèi)
    地黃花對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:20:04
    朝鮮孢囊線蟲(chóng)——浙江省孢囊線蟲(chóng)新記錄種
    線蟲(chóng)共生菌Xenorhabdus budapestensis SN19次生代謝產(chǎn)物的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定
    食品微生物檢驗(yàn)中菌落總數(shù)測(cè)定的注意事項(xiàng)
    SPC在壓縮干糧菌落總數(shù)監(jiān)測(cè)過(guò)程中的應(yīng)用
    食品工程(2015年3期)2015-12-07 10:20:53
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    基于細(xì)菌菌落優(yōu)化算法含分布式電源的無(wú)功優(yōu)化
    亚洲国产av影院在线观看| 日本91视频免费播放| 久久精品国产综合久久久| 日本一区二区免费在线视频| 激情视频va一区二区三区| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 久久99热这里只频精品6学生| 大片电影免费在线观看免费| 国产高清国产精品国产三级| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产成人欧美在线观看 | 欧美激情高清一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 精品人妻在线不人妻| 深夜精品福利| 捣出白浆h1v1| 大陆偷拍与自拍| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 在线观看免费午夜福利视频| 桃花免费在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜福利视频精品| 在线 av 中文字幕| 超碰97精品在线观看| av天堂在线播放| 精品一区二区三卡| 18禁国产床啪视频网站| 色94色欧美一区二区| 欧美黄色片欧美黄色片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 啦啦啦免费观看视频1| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久久精品人妻al黑| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美xxⅹ黑人| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 日本一区二区免费在线视频| 大片免费播放器 马上看| 18禁观看日本| 久久亚洲国产成人精品v| 成年人午夜在线观看视频| 在线天堂中文资源库| 国产主播在线观看一区二区| 国产欧美日韩一区二区三 | 永久免费av网站大全| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲欧美激情在线| 国产精品免费视频内射| 精品国产一区二区久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲熟女毛片儿| 不卡一级毛片| 自线自在国产av| 国产视频一区二区在线看| 热re99久久精品国产66热6| 丰满少妇做爰视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 9热在线视频观看99| 欧美成狂野欧美在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 大香蕉久久成人网| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产精品 国内视频| 性色av乱码一区二区三区2| 99国产综合亚洲精品| 麻豆av在线久日| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产激情久久老熟女| 一级毛片女人18水好多| 一区二区三区激情视频| 午夜福利,免费看| 香蕉国产在线看| 欧美久久黑人一区二区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 啦啦啦 在线观看视频| 一区在线观看完整版| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产成人欧美| 国产av精品麻豆| 十分钟在线观看高清视频www| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲伊人色综图| 精品国产乱码久久久久久男人| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| www日本在线高清视频| 一区福利在线观看| 一级片免费观看大全| 亚洲欧洲日产国产| 蜜桃国产av成人99| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲avbb在线观看| 久热爱精品视频在线9| 人妻 亚洲 视频| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 十八禁网站免费在线| 久久香蕉激情| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品国产一区二区久久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 青春草视频在线免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲全国av大片| 亚洲成人国产一区在线观看| 最黄视频免费看| 日本av手机在线免费观看| 91字幕亚洲| 久久国产精品大桥未久av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 咕卡用的链子| 国产精品国产av在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩欧美国产一区二区入口| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲情色 制服丝袜| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美少妇被猛烈插入视频| 动漫黄色视频在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 午夜激情久久久久久久| 婷婷成人精品国产| 亚洲欧美精品自产自拍| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久精品国产a三级三级三级| 性色av乱码一区二区三区2| 一级毛片电影观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 韩国高清视频一区二区三区| 久久中文字幕一级| 久久影院123| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 制服人妻中文乱码| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲黑人精品在线| 窝窝影院91人妻| 丝袜喷水一区| 一区在线观看完整版| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美黑人精品巨大| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一二三四在线观看免费中文在| www.999成人在线观看| 性少妇av在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产日韩欧美视频二区| 成在线人永久免费视频| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲第一av免费看| 亚洲人成电影免费在线| 欧美日韩av久久| 深夜精品福利| 久久久国产一区二区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲人成77777在线视频| av网站在线播放免费| www日本在线高清视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产黄色免费在线视频| 成人手机av| 久久久久国产一级毛片高清牌| av在线播放精品| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 丝袜美腿诱惑在线| 日本av免费视频播放| 91九色精品人成在线观看| 考比视频在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 正在播放国产对白刺激| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 日本黄色日本黄色录像| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美成狂野欧美在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 97精品久久久久久久久久精品| 一区福利在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 老司机深夜福利视频在线观看 | 黑丝袜美女国产一区| 一进一出抽搐动态| 黄色a级毛片大全视频| 婷婷成人精品国产| 日本黄色日本黄色录像| 操出白浆在线播放| 中国国产av一级| 久久久久国产精品人妻一区二区| 蜜桃在线观看..| 人成视频在线观看免费观看| 国精品久久久久久国模美| 国产日韩欧美在线精品| 日韩有码中文字幕| 一本综合久久免费| 人妻一区二区av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲熟女毛片儿| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 丁香六月欧美| 国产欧美日韩一区二区三 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 大陆偷拍与自拍| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人黄色视频免费在线看| av不卡在线播放| 老汉色av国产亚洲站长工具| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品一区二区免费欧美 | 国产片内射在线| 老熟女久久久| 69精品国产乱码久久久| av不卡在线播放| 国产精品二区激情视频| 男女国产视频网站| 丝袜喷水一区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久精品成人免费网站| 国产精品熟女久久久久浪| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久ye,这里只有精品| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 天堂8中文在线网| 国产精品久久久av美女十八| 老司机午夜十八禁免费视频| 免费在线观看影片大全网站| 久久久久国内视频| 丝袜脚勾引网站| 色94色欧美一区二区| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜影院在线不卡| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲专区国产一区二区| 51午夜福利影视在线观看| 日日夜夜操网爽| 在线永久观看黄色视频| 国产激情久久老熟女| 麻豆国产av国片精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 99久久精品国产亚洲精品| 在线观看www视频免费| 免费观看人在逋| 久久久国产一区二区| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品 国内视频| 男男h啪啪无遮挡| 蜜桃在线观看..| 大码成人一级视频| 91成人精品电影| 成人黄色视频免费在线看| 曰老女人黄片| 欧美激情 高清一区二区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产av国产精品国产| 乱人伦中国视频| 在线看a的网站| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲欧美清纯卡通| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产成人精品在线电影| 日本av免费视频播放| 国精品久久久久久国模美| 国产视频一区二区在线看| av在线老鸭窝| 欧美激情高清一区二区三区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久热爱精品视频在线9| 99精品欧美一区二区三区四区| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲av片天天在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 国产黄频视频在线观看| 日本av手机在线免费观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 午夜影院在线不卡| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲五月色婷婷综合| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 欧美久久黑人一区二区| 两个人免费观看高清视频| 成人国产av品久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 大香蕉久久成人网| 丰满饥渴人妻一区二区三| 一级片免费观看大全| 热re99久久国产66热| 999精品在线视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 91成年电影在线观看| 国产97色在线日韩免费| 久热爱精品视频在线9| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲免费av在线视频| 欧美精品亚洲一区二区| av有码第一页| 777米奇影视久久| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久久国产精品麻豆| av网站在线播放免费| 亚洲精品中文字幕在线视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品 欧美亚洲| 黄色 视频免费看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 男女国产视频网站| 亚洲精品一区蜜桃| 一级片免费观看大全| 国产1区2区3区精品| 午夜福利乱码中文字幕| 后天国语完整版免费观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品国产国语对白av| 久久久精品免费免费高清| 成人手机av| 国产在视频线精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 69精品国产乱码久久久| 淫妇啪啪啪对白视频 | videos熟女内射| 亚洲性夜色夜夜综合| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 亚洲情色 制服丝袜| 久热这里只有精品99| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 女人精品久久久久毛片| 亚洲成人免费av在线播放| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲伊人色综图| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 丝瓜视频免费看黄片| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 啦啦啦免费观看视频1| 精品久久蜜臀av无| 国产淫语在线视频| 免费av中文字幕在线| 午夜免费观看性视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 在线永久观看黄色视频| 9色porny在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲av片天天在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 咕卡用的链子| 满18在线观看网站| 一二三四在线观看免费中文在| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲精品第二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 国产欧美日韩一区二区精品| 嫩草影视91久久| 国产一区二区在线观看av| 国产精品影院久久| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲国产看品久久| 国产片内射在线| 亚洲第一青青草原| 久久青草综合色| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 不卡av一区二区三区| 日本a在线网址| 曰老女人黄片| 大香蕉久久成人网| 18禁观看日本| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美精品高潮呻吟av久久| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产xxxxx性猛交| 大码成人一级视频| 另类亚洲欧美激情| 国产精品一区二区免费欧美 | 午夜日韩欧美国产| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲中文日韩欧美视频| 天堂中文最新版在线下载| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 超碰成人久久| a级毛片在线看网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 黄频高清免费视频| 美女福利国产在线| 亚洲av美国av| 国产精品一区二区免费欧美 | 亚洲国产欧美网| 黑丝袜美女国产一区| 国产成人a∨麻豆精品| 丝袜美腿诱惑在线| 国产亚洲精品一区二区www | 在线 av 中文字幕| 国产精品.久久久| 午夜久久久在线观看| 久久久久久人人人人人| 国产成人影院久久av| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产一区二区激情短视频 | 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品偷伦视频观看了| 不卡av一区二区三区| 久久国产精品大桥未久av| 久久久久久久精品精品| 国产精品国产av在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本一区二区免费在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 脱女人内裤的视频| 99国产综合亚洲精品| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久热在线av| 90打野战视频偷拍视频| 女性被躁到高潮视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 老汉色∧v一级毛片| 国产麻豆69| 在线观看一区二区三区激情| 国产高清国产精品国产三级| 性高湖久久久久久久久免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 最黄视频免费看| 下体分泌物呈黄色| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| av有码第一页| 成年女人毛片免费观看观看9 | 最近中文字幕2019免费版| 精品少妇久久久久久888优播| 精品人妻在线不人妻| 大片电影免费在线观看免费| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲免费av在线视频| 成年av动漫网址| 国产一区二区三区av在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 色老头精品视频在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 黑人操中国人逼视频| www.av在线官网国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 人妻一区二区av| 久久综合国产亚洲精品| 久久中文看片网| 国产高清国产精品国产三级| 久久久精品免费免费高清| 国产成人av激情在线播放| 天天添夜夜摸| 狂野欧美激情性bbbbbb| 免费在线观看黄色视频的| 欧美精品高潮呻吟av久久| 制服人妻中文乱码| 国产男女超爽视频在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 成人手机av| 欧美日韩黄片免| 亚洲熟女精品中文字幕| 999精品在线视频| 波多野结衣一区麻豆| 999精品在线视频| 国产精品成人在线| 久久人人爽人人片av| av网站免费在线观看视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 免费观看av网站的网址| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品一区二区免费欧美 | 久久久精品94久久精品| 免费在线观看完整版高清| 9191精品国产免费久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲伊人色综图| www.熟女人妻精品国产| 91成年电影在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 成年动漫av网址| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲av日韩在线播放| 国产一级毛片在线| 亚洲国产欧美在线一区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品熟女久久久久浪| 日本av免费视频播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲九九香蕉| 妹子高潮喷水视频| 各种免费的搞黄视频| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产欧美一区二区综合| 午夜精品国产一区二区电影| 久久久国产一区二区| 国产一区二区三区综合在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 久9热在线精品视频| 国产真人三级小视频在线观看| 人人澡人人妻人| 性色av乱码一区二区三区2| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 视频在线观看一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 成人免费观看视频高清| 国产免费一区二区三区四区乱码| 午夜福利免费观看在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产男女超爽视频在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲精品第二区| 69精品国产乱码久久久| 无遮挡黄片免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 啦啦啦视频在线资源免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 色老头精品视频在线观看| 又大又爽又粗| 国产成人欧美| 一区二区av电影网| 波多野结衣av一区二区av| 大片电影免费在线观看免费| 岛国毛片在线播放| 国产精品免费视频内射| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲久久久国产精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久久精品区二区三区| 人妻久久中文字幕网| www.av在线官网国产| 一级a爱视频在线免费观看| 女人精品久久久久毛片| www.999成人在线观看| a级毛片黄视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 黄片小视频在线播放| 女性被躁到高潮视频| 热99re8久久精品国产| 精品乱码久久久久久99久播| 岛国在线观看网站| 三级毛片av免费| 黄片小视频在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日本wwww免费看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲中文日韩欧美视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 99热全是精品| 最黄视频免费看| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国精品久久久久久国模美| 久久中文字幕一级| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日韩中文字幕欧美一区二区| 三级毛片av免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 中文字幕最新亚洲高清| 女人久久www免费人成看片| av不卡在线播放| 国产成人影院久久av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美黑人欧美精品刺激| 丰满少妇做爰视频|