嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001 cpxR基因敲除突變株的構(gòu)建及其抑菌活性研究

湯　倩,張淑靜,郭薔薇,王永宏,張　興

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心/陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌712100)

嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001cpxR基因敲除突變株的構(gòu)建及其抑菌活性研究

湯倩,張淑靜,郭薔薇,王永宏,張興

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心/陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌712100)

[摘要]【目的】 通過(guò)同源重組技術(shù)敲除嗜線蟲(chóng)致病桿菌(Xenorhabdus nematophila) YL001中cpxR基因，為進(jìn)一步研究CpxR調(diào)節(jié)子調(diào)控抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的機(jī)理奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?通過(guò)融合PCR技術(shù)，將cpxR基因的上、下游同源片段及質(zhì)粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3個(gè)片段連接，克隆到自殺載體pDM4中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1λpir中，經(jīng)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入嗜線蟲(chóng)致病桿菌內(nèi)，通過(guò)同源重組敲除cpxR基因；采用瓊脂擴(kuò)散法和抑制菌絲生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定突變菌株對(duì)枯草芽孢桿菌和番茄灰霉病菌的抑制作用?！窘Y(jié)果】 從X.nematophila YL001基因組中成功敲除cpxR基因，得到了ΔcpxR突變菌株；ΔcpxR突變菌株對(duì)枯草芽孢桿菌和番茄灰霉病菌的抑制作用較野生菌株分別提高了1.4和1.7倍。【結(jié)論】 CpxR負(fù)向調(diào)控嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生。

[關(guān)鍵詞]嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001；cpxR基因；基因敲除；抗菌活性

嗜線蟲(chóng)致病桿菌存在于昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)腸道內(nèi)，與斯氏線蟲(chóng)(Steinernema)共生，屬腸桿菌科革蘭氏陰性細(xì)菌[1]，其在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種具有生物活性的抗生素類(lèi)物質(zhì)，如細(xì)菌素、幾丁質(zhì)酶、假肽類(lèi)、二硫吡咯類(lèi)等[2]。這些代謝產(chǎn)物不僅具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上具有廣泛的生物活性，如抗細(xì)菌、抗真菌、殺蟲(chóng)、殺線蟲(chóng)、抗?jié)儭⒖鼓[瘤和抗病毒活性等。這些化合物結(jié)構(gòu)新穎，生物活性高，具備開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥的潛質(zhì)。

XenorhabdusnematophilaYL001是從陜西楊凌篩選昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)中分離鑒定的1株共生菌，前期研究發(fā)現(xiàn)， YL001 的發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)等病原真菌和細(xì)菌均具有不同程度的拮抗作用[3]，具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)菌、線蟲(chóng)和昆蟲(chóng)之間相互作用的分子基礎(chǔ)得到了廣泛而深入的研究。在X.nematophila中，3個(gè)主要調(diào)控子Lrp (Leucine responsive regulatory protein)、LrhA (LysR-type regulator)和CpxR(Two-component system CpxRA中一種反應(yīng)調(diào)節(jié)子) 單獨(dú)或協(xié)同形成級(jí)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而調(diào)控X.nematophila生活史的3個(gè)階段(侵染、繁殖及轉(zhuǎn)移)中細(xì)菌、線蟲(chóng)和昆蟲(chóng)之間相互作用所需基因的表達(dá)[4]。其中， Lrp作為一種主要的調(diào)控子，位于復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂端，負(fù)向調(diào)控nilABC基因的表達(dá)，調(diào)控共生菌與線蟲(chóng)的共生關(guān)系，通過(guò)激活 Lrh 調(diào)控共生菌對(duì)寄主昆蟲(chóng)的致病性[5]，同時(shí)Lrp對(duì)共生菌的細(xì)胞功能(營(yíng)養(yǎng)與能量代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)與分泌及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))也有廣泛影響[6]。LrhA 可激活共生菌與毒性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，包括鞭毛的合成，毒素、溶血素、蛋白酶和酯酶的產(chǎn)生，還可以正向調(diào)控鞭毛主調(diào)控子 FlhDC 的表達(dá)[7-8]。CpxRA 正向調(diào)控lrhA、運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因、酯酶和相關(guān)定植因子基因的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控溶血素、蛋白酶、 抗生素和菌毛蛋白的產(chǎn)生，從而影響共生菌的致病性和共生性[9-11]。雖然CpxRA調(diào)控某一基因的功能已經(jīng)明確，但其具體調(diào)控抗生素產(chǎn)生的機(jī)理還不清楚，抗菌活性的提高是基因沉默后重新表達(dá)而產(chǎn)生新的抗生素還是原有抗生素含量有所提高，尚有待進(jìn)一步研究。因此，本研究擬構(gòu)建嗜線蟲(chóng)致病桿菌cpxR基因缺失突變菌株，以期進(jìn)一步研究cpxR基因失活提高X.nematophila殺菌活性的機(jī)理，并為嗜線蟲(chóng)致病桿菌其他基因的敲除提供可行性依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒供試菌株嗜線蟲(chóng)致病桿菌(Xenorhabdusnematophila) YL001(氨芐抗性)、大腸桿菌(Escherichilacoli) DH5α、大腸桿菌(Escherichilacoli) S17-1λpir、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，以及質(zhì)粒pJCV53、自殺質(zhì)粒pDM4(氯霉素抗性)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。本研究中如無(wú)特殊說(shuō)明，抗生素使用質(zhì)量濃度為：氨芐青霉素(Amp)150 μg/mL，氯霉素(Cm) 25 μg/mL，卡那霉素(Km) 50 μg/mL。

1.1.2培養(yǎng)基NBTA鑒別培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，瓊脂粉14 g，氯化三苯基四氮唑0.04 g，溴麝香百里酚藍(lán)0.025 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

NB 培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

NA 培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 15 g，蒸餾水1 000 mL。

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

LB固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加15 g瓊脂。

1.1.3主要試劑試驗(yàn)所用dNTPs、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、ExTaq、PrimeSTAR高保真酶，購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物(膠)回收試劑盒，購(gòu)自天根公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，購(gòu)自NEB公司。其他生化試劑(分析純)均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)。

1.1.4引物設(shè)計(jì)與合成本研究所用到的引物均由Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)(表1)。由上海生物工程有限公司合成。

1.2cpxR突變菌株的構(gòu)建、篩選及驗(yàn)證

1.2.1基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建以嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001基因組DNA 為模板，分別用上、下游引物cpxR-up-F/cpxR-up-R、cpxR-down-F/cpxR-down-R進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增cpxR的上、下游片段U和D；同時(shí)以質(zhì)粒pJCV53為模板,用引物Km-F/Km-R進(jìn)行PCR,擴(kuò)增卡那抗性基因。各片段擴(kuò)增的反應(yīng)條件如表2所示。擴(kuò)增完畢使用PCR產(chǎn)物(膠)回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。

表 1　cpxR基因突變株構(gòu)建及鑒定所用的引物

注：黑體標(biāo)記的堿基為保護(hù)堿基，橫線標(biāo)記的堿基為酶切位點(diǎn)。

Note:Black letters: protective base;Horizontal line marked letters represent restriction enzyme cutting sites.

表 2　目的片段擴(kuò)增的反應(yīng)條件及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.2融合PCR反應(yīng)將純化后的cpxR基因上、下游同源片段及卡那抗性基因3個(gè)片段按 1∶1∶1混合，不添加引物，用PrimeSTAR高保真酶進(jìn)行互補(bǔ)融合，形成全長(zhǎng)的融合PCR產(chǎn)物。PCR程序?yàn)?95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，10個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，以上述產(chǎn)物為模板進(jìn)行融合片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增，引物對(duì)為cpxR-up-F/cpxR-down-R。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。最終切膠回收純化PCR產(chǎn)物并將該片段克隆至T載體，進(jìn)行菌落PCR鑒定，選取正確的陽(yáng)性克隆測(cè)序。

分別以限制性內(nèi)切酶SphⅠ和SacⅠ對(duì)pDM4質(zhì)粒和融合片段進(jìn)行雙酶切，并用試劑盒純化回收，將酶切后的質(zhì)粒和片段按適當(dāng)?shù)谋壤旌?，加入T4連接酶于16 ℃過(guò)夜連接，再將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌S17-1λpir感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在37 ℃、200 r/min條件下活化1 h后，取100 μL涂布于LB平板(含25 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素)上，37 ℃倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。通過(guò)PCR鑒定和測(cè)序分析，篩選出含有融合片段且測(cè)序正確無(wú)誤的重組質(zhì)粒pDM4cpxR-up-Km-cpxR-down，鑒定引物為cpxR-up-F/cpxR-down-R。

1.2.3接合轉(zhuǎn)移及突變菌株的鑒定將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌 S17-1λpir以1%接種量轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)基(含Km 50 μg/mL，Cm 25 μg/mL)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600為0.4～0.6。同時(shí)將受體菌嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001于28 ℃過(guò)夜活化后以1%接種量轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至A600為0.4～0.6。將大腸桿菌和嗜線蟲(chóng)致病桿菌等體積混合，室溫、4 000 r/min離心3 min收集菌體，再用100～200 μL不加抗生素的LB液體懸浮。將所有菌懸液鋪在一張孔徑為0.45 μm的硝酸纖維素膜上，待菌液被充分吸收后將其緊貼在LB平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)8 h左右，進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移的第一輪重組。然后用LB液體培養(yǎng)基洗滌濾膜，洗下的菌懸液涂布于LB平板(含Amp 150 μg/mL，Km 50 μg/mL)上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，進(jìn)行第一輪重組接合子的篩選。計(jì)算接合轉(zhuǎn)移頻率：接合轉(zhuǎn)移頻率=接合子數(shù)/供體菌數(shù)。

在供體菌大腸桿菌與受體菌嗜線蟲(chóng)致病桿菌的比例為2∶1的條件下，將接合時(shí)間設(shè)為2，4，6，8，10，12，14 h共7個(gè)處理，研究接合時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)移頻率的影響。

挑取第一輪重組接合成功的接合子，接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，將菌液稀釋1 000倍后取100 μL涂布于含5%蔗糖、50 μg/mL Km的LB平板上，28 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，該單菌落即為第二輪重組成功的克隆(即卡那霉素抗性基因Kmr成功置換cpxR基因)，該克隆即為cpxR基因敲除的突變株ΔcpxR。通過(guò)cpxR基因內(nèi)部引物對(duì)NB-F/NB-R以及外部引物對(duì)WB-F/WB-R對(duì)該菌落進(jìn)行PCR鑒定。

1.3突變菌株發(fā)酵液的抑菌活性測(cè)定

1.3.1對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性采用生長(zhǎng)速率法[12-13]測(cè)定突變株發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。將發(fā)酵液以10%的比例接入冷卻至40～50 ℃的PDA培養(yǎng)基中，制成平板，以加無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的PDA為對(duì)照。從培養(yǎng)5 d的供試病原菌菌落邊緣，用打孔器取直徑4 mm的菌塊，置于平板中央，于 25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，5 d后測(cè)量菌落的直徑，計(jì)算抑制率。計(jì)算公式為：

菌落生長(zhǎng)直徑(mm)=測(cè)量直徑-4.0(菌餅直徑)；

菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.3.2對(duì)病原細(xì)菌的抑制活性采用瓊脂擴(kuò)散法[14-15]測(cè)定突變株發(fā)酵液對(duì)供試枯草芽孢桿菌的抑菌活性。將熔化的NA培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃，加入體積分?jǐn)?shù)1.5%的供試病原細(xì)菌搖勻，每皿(直徑90 mm)倒入15 mL培養(yǎng)基，制成平板，在帶菌平板上打3個(gè)直徑7.5 mm 的孔，每孔加入70 μL發(fā)酵液，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)48 h，十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小。

2結(jié)果與分析

2.1cpxR基因敲除載體的構(gòu)建

用引物對(duì)cpxR-up-F/cpxR-up-R擴(kuò)增cpxR基因上游同源片段(1 105 bp)、Km-F/Km-R擴(kuò)增卡那抗性基因(973 bp)、cpxR-down-F/cpxR-down-R擴(kuò)增cpxR基因下游同源片段(1 192 bp)，擴(kuò)增后回收純化PCR產(chǎn)物。將回收純化后的3個(gè)片段按 1∶1∶1混合，首先不添加引物，用PrimeSTAR高保真酶進(jìn)行互補(bǔ)融合，形成融合PCR產(chǎn)物。之后利用引物對(duì)cpxR-up-F/cpxR-down-R，以上述所得產(chǎn)物為模板，進(jìn)行融合片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增，成功融合的片段大小為3 270 bp。PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示。

圖 1　目的片段及其融合片段的PCR擴(kuò)增

對(duì)融合片段與pDM4質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌S17-1λpir中，待長(zhǎng)出單菌落后，搖菌提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，用引物對(duì)cpxR-up-F/cpxR-down-R來(lái)鑒定陽(yáng)性克隆，可以擴(kuò)增出融合片段，其驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，說(shuō)明已成功構(gòu)建cpxR基因敲除重組載體pDM4cpxR-up-Km-cpxR-down。

2.2接合轉(zhuǎn)移及突變株鑒定

由于嗜線蟲(chóng)致病桿菌對(duì)卡那霉素敏感，同時(shí)含有同源重組載體的大腸桿菌S17-1λpir對(duì)氨芐霉素敏感，因此在氨芐霉素和卡那霉素雙重篩選壓力下生長(zhǎng)起來(lái)的菌落可以初步判斷為一次重組克隆。

在含有5%蔗糖的LB平板上挑取少量單克隆菌落作為模板，用位于cpxR基因編碼區(qū)的內(nèi)部引物對(duì)NB-F/NB-R及外部引物對(duì)WB-F/WB-R進(jìn)行PCR鑒定，并以嗜線蟲(chóng)致病桿菌YL001野生株基因組DNA為對(duì)照，結(jié)果(圖3)顯示，與陽(yáng)性對(duì)照相比，以突變株基因組DNA為模板，采用cpxR內(nèi)部引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，并無(wú)擴(kuò)增片段出現(xiàn)，而采用外部引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增產(chǎn)物比以野生株基因組DNA為模板時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物大約300 bp，說(shuō)明卡那抗性基因Kmr已成功替換了目標(biāo)基因cpxR，該克隆即為cpxR基因敲除后的突變株ΔcpxR。

圖 3cpxR基因敲除突變株的鑒定

A.cpxR基因內(nèi)部引物擴(kuò)增結(jié)果；B.cpxR基因外部引物擴(kuò)增結(jié)果;M.DL2000 Marker;1.野生菌株YL001;2.突變菌株ΔcpxR

Fig.3Identification ofXenorhabdusnematophilaYL001 ΔcpxR

A.PCR with internal primers;B.PCR with external primers;M.DL2000 Marker;1.Wild type strain YL001;2.Mutant strain

當(dāng)供體菌(含有同源重組載體的大腸桿菌S17-1λpir)和受體菌(X.nematophilaYL001)接合時(shí)間為12 h時(shí)，接合轉(zhuǎn)移頻率最大，為1×10-5(圖4)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是接合時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，供體菌的生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)高于受體菌，以至受體菌數(shù)目遠(yuǎn)小于供體菌，從而降低了接合轉(zhuǎn)移的頻率；而接合時(shí)間過(guò)短時(shí)，因重組質(zhì)?？赡芪赐耆M(jìn)入受體細(xì)菌而導(dǎo)致接合頻率不高。

圖 4接合時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)移頻率的影響

Fig.4Effect of conjunction time on transfer frequency

2.3ΔcpxR及野生菌株YL001對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

圖5表明，野生菌株YL001發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌菌絲的抑制率為50.02%，突變菌株發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌的抑制率為88.26%，是野生菌株的1.7倍。

圖 5野生菌株YL001和ΔcpxR突變菌株發(fā)酵液

對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用

1.空白對(duì)照;2.野生菌株YL001;3.ΔcpxR突變菌株

Fig.5Inhibitory effect of wild strain YL001 and

ΔcpxRagasintBotrytiscinerea

1.CK;2.Wild type strain YL001;3.Mutant strain ΔcpxR

2.4ΔcpxR及野生菌株YL001對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

圖6顯示，野生菌株YL001發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為23.17 mm，突變菌株發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為30.89 mm，是野生菌株的1.4倍。

圖 6　野生菌株YL001和ΔcpxR突變菌株發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

3討論

嗜線蟲(chóng)致病桿菌是一種新型的生物防治資源，構(gòu)建無(wú)痕突變株對(duì)其產(chǎn)生抗生素相關(guān)基因的研究至關(guān)重要。本研究利用含反向篩選基因sacB的pDM4質(zhì)粒，通過(guò)同源重組技術(shù)構(gòu)建了cpxR基因缺失株。sacB基因編碼的果聚糖蔗糖酶能催化蔗糖水解成果聚糖，果聚糖對(duì)革蘭氏陰性菌都有致死作用，故含有sacB基因的細(xì)菌不能在蔗糖平板上生長(zhǎng)[16]。整合了pDM4質(zhì)粒的嗜線蟲(chóng)致病桿菌中，只有發(fā)生2次重組的突變株才能在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

構(gòu)建重組DNA片段的傳統(tǒng)方法包括利用合適的限制性內(nèi)切酶連接重組和通過(guò)加連接子連接重組等，如Herbert等[11]利用酶切連接的方法將X.nematophilacpxR基因上游、鏈霉素抗性基因和cpxR基因下游3個(gè)片段連接在一起，克隆至自殺載體pKR100，構(gòu)成pKRcpxRStr重組質(zhì)粒。但上述2種方法不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且對(duì)于長(zhǎng)片段的連接有時(shí)難以找到合適的酶切位點(diǎn)。而使用融合PCR，將3個(gè)DNA片段放在同一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，不需要限制性內(nèi)切酶消化和連接酶處理，為同源重組DNA片段的構(gòu)建提供了快速簡(jiǎn)捷的途徑[17-18]。本研究利用該方法，成功構(gòu)建重組自殺載體pDM4-up-Km-down，并對(duì)該片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與融合前基因片段序列完全一致，確保后續(xù)其與可以致病桿菌染色體基因組發(fā)生同源重組。

由于在自然條件下還未鑒定出可獨(dú)立生活的X.nematophila，因此這些細(xì)菌在一般條件下比較脆弱，只有在溫和條件下才能較好生長(zhǎng)[19]。嗜線蟲(chóng)致病桿菌的脆弱性使其很難用電穿孔法進(jìn)行載體DNA的轉(zhuǎn)化，人們嘗試了很多條件下的電擊穿孔法但均未成功，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入致病桿菌細(xì)胞的最可靠方法是用大腸桿菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移[20]。本研究利用接合轉(zhuǎn)移成功構(gòu)建了cpxR基因缺失株，為致病桿菌其他基因的敲除提供了依據(jù)。

在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行微生物培養(yǎng)時(shí)，許多代謝物的生物合成基因保持沉默，使得一些有價(jià)值的化合物不能產(chǎn)生，而這些隱藏的生物合成途徑受到嚴(yán)格的控制，其僅在特殊條件下可被激活[21]。昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌基因組分析表明，發(fā)光桿菌的基因組中含有33個(gè)與次生代謝物合成有關(guān)的基因簇，嗜線蟲(chóng)致病桿菌中含有16個(gè)與次生代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的基因簇[22]。目前從發(fā)光桿菌和嗜線蟲(chóng)致病桿菌中分離鑒定的次生代謝產(chǎn)物的數(shù)量遠(yuǎn)少于其生物合成基因簇的數(shù)量，這種差異可能源于代謝調(diào)節(jié)控制。在細(xì)菌中總調(diào)控子通過(guò)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，其可控制小分子物質(zhì)的產(chǎn)生[23]。Kontnik等[24]研究了發(fā)光桿菌次生代謝物產(chǎn)生的下游調(diào)控，發(fā)現(xiàn)HexA(LysR類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子)基因失活突變可顯著提高一些小分子物質(zhì)的含量，且突變菌株可產(chǎn)生一些新的代謝產(chǎn)物。CpxR是CpxRA雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)蛋白，也是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。在大腸桿菌中，CpxR可調(diào)控100多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[25]；在嗜線蟲(chóng)致病桿菌中，CpxR正向調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、酯酶活性及該菌與線蟲(chóng)共生所需相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，負(fù)向調(diào)控溶血素與蛋白酶的產(chǎn)生及抗菌活性[11]。因此，本研究構(gòu)建的cpxR基因缺失突變株為后續(xù)進(jìn)一步明確cpxR基因失活對(duì)提高嗜線蟲(chóng)致病桿菌殺菌活性的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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Construction ofcpxRgene deletion mutant strain ofXenorhabdusnematophilaYL001 and study of its antimicrobial activity

TANG Qian,ZHANG Shu-jing,GUO Qiang-wei,WANG Yong-hong,ZHANG Xing

(Research&DevelopmentCenterofBiorationalPesticide,NorthwestA&FUniversity/ShaanxiResearchCenterofBiopesticideEngineering&Technology,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract：【Objective】 The cpxR gene of nematode pathogenic bacteria Xenorhabdus nematophila YL001 was knocked out by allelic exchange to provide basis for researching regulatory mechanism of CpxR on production of antimicrobial substances.【Method】 In this study,the upstream and downstream flanking DNA fragments of target gene and the kanamycin resistant gene Kmr were fused by PCR before being cloned into the suicide vector pDM4.The recombinant plasmid was introduced into Escherichila coli strain S17-1λpir and transferred into X.nematophila by conjugation.Then,the inhibitory effect of the mutant strain against Bacillus subtilis and Botrytis cinerea was determined.【Result】 The ΔcpxR mutant strain was obtained successfully,and the antimicrobial activities of mutant strains against B.subtilis and B.cinerea were increased by 1.4 and 1.7 times compared with those of the wild strain.【Conclusion】 CpxR negatively regulates the production of antimicrobial substances of X.nematophila YL001.

Key words:Xenorhabdus nematophila YL001;cpxR;gene knockout;antimicrobial activity

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.018

[收稿日期]2014-11-21

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171910)；陜西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2014JZ004)；中央高?；究蒲许?xiàng)目(ZD2013003)

[作者簡(jiǎn)介]湯倩(1990-)，女，河南開(kāi)封人，在讀碩士，主要從事微生物源農(nóng)藥研究。E-mail:tangqian229@126.com [通信作者]王永宏(1968-)，男，陜西鳳翔人，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事生物源農(nóng)藥研究。 E-mail:yhwang@nwsuaf.edu.cn

[中圖分類(lèi)號(hào)]S482.2+92

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)06-0125-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.036.html