乳腺癌異常表達(dá)B7-H4對T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和凋亡的影響①

沈依帆　黃文煉　徐　曼　蘇新良　王　欣　汪　濤

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

乳腺癌異常表達(dá)B7-H4對T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和凋亡的影響①

沈依帆黃文煉徐曼蘇新良②王欣汪濤

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

[摘要]目的：探討B(tài)7-H4在乳腺癌中的表達(dá)及其對外周血T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及增殖、凋亡的影響。方法：應(yīng)用S-P免疫組化法檢測B7-H4在乳腺浸潤性癌、癌旁組織和纖維腺瘤的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)分析B7-H4對乳腺癌患者外周血活化T細(xì)胞增殖和凋亡的作用。ELISA芯片檢測T細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子的含量。結(jié)果：B7-H4在乳腺浸潤性癌的陽性表達(dá)率為84.62%(44/52)，顯著高于癌旁組織和纖維腺瘤組織(P<0.01，P<0.01 )。體外淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)結(jié)果顯示， 與空白組比較，B7-H4對乳腺癌患者外周血活化T細(xì)胞的增殖指數(shù)Ki67無明顯影響；但B7-H4誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡的作用強(qiáng)于CD4+T 細(xì)胞。B7-H4組FOXP3+T/CD4+T也高于空白組(P<0.05 )。B7-H4組較空白組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1、IL-17含量均顯著增高 (P<0.05，P<0.05)。結(jié)論：乳腺浸潤性癌異常表達(dá)B7-H4。B7-H4在體外能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞凋亡、促進(jìn)T細(xì)胞分泌TGF-β1 和IL-17。B7-H4在削弱乳腺癌微環(huán)境的抗腫瘤細(xì)胞免疫中發(fā)揮一定作用。

[關(guān)鍵詞]B7-H4；乳腺癌；CD8+T細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；TGF-β1；IL-17

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其在我國的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[1]。近年的研究表明，腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫抑制與負(fù)性共刺激分子B7家族成員表達(dá)上調(diào)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的募集以及 轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β )表達(dá)上調(diào)等因素有關(guān)[2]。負(fù)性共刺激分子B7家族成員包括B7-H1、B7-DC、B7-H4，它們能抑制T細(xì)胞活化、增殖從而負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[3-5]。B7-H4在體內(nèi)有兩種存在形式，一種為細(xì)胞膜蛋白，另一種為血清中的可溶性蛋白。B7-H4蛋白僅低水平表達(dá)于幾種正常組織，但在多種惡性腫瘤如肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌中異常表達(dá)[6，7]。研究表明B7-H4過度表達(dá)與腫瘤微環(huán)境的免疫抑制及患者預(yù)后差有關(guān)[7-9]。血清的可溶性B7-H4水平與腫瘤分級、患者預(yù)后差以及腫瘤病理類型相關(guān)[10]。腫瘤微環(huán)境中抑制性細(xì)胞因子水平增高也是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的原因之一[11，12]。腫瘤局部高水平的TGF-β可抑制或改變天然和獲得性免疫細(xì)胞(包括NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4+T和CD8+T細(xì)胞)的活化、成熟及分化[13，14]，從而有助于腫瘤細(xì)胞逃避患者體內(nèi)的免疫監(jiān)視[15]。白介素能促進(jìn)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移，以IL-17最為典型，它可通過招募髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)到腫瘤局部抑制抗腫瘤免疫 從而促進(jìn)腫瘤的生長[16]。為了探討B(tài)7-H4在浸潤性乳腺癌的表達(dá)及其對乳癌患者外周血T淋巴細(xì)胞的作用，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法觀察了B7-H4在乳腺癌組織中的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)和ELISA芯片檢測了B7-H4對乳腺癌患者外周血T淋巴細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞因子分泌情況的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料來源52例乳腺浸潤性癌患者及10例乳腺纖維腺瘤的手術(shù)切除標(biāo)本，均取自2012年～2014年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，術(shù)前未行放療或化療?；颊吣挲g30～76歲，平均(50.1±11.6歲)。10例乳腺癌患者外周血10～15 ml，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科收治的患者知情捐贈(zèng)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑兔抗人B7-H4購自北京博奧森生物公司；重組人B7-H4蛋白購自美國R&D公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊锕?；尼龍毛購自德國KISKER公司；Annexin V-PE/7-ADD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；ELISA定量抗體芯片購自廣州RayBiotech公司；鼠抗人Ki67-PE、抗人CD4-FITC、抗人CD8-FITC、抗人CD3-PE、抗人CD8-PE、抗人CD25-TRITC、抗人FOXP3-PE均購自美國eBioscience 公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1S-P免疫組化染色及結(jié)果判斷石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)微波抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷10 min，經(jīng)10%正常山羊血清封閉30 min后，加B7-H4(1∶100)4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30 min后加二抗孵育30 min，鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶孵育30 min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染后樹膠封片。以PBS代替一抗為陰性對照。結(jié)果判斷：B7-H4在胞膜、胞漿染色。細(xì)胞染色比例：無陽性細(xì)胞為0 分，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為1 分，11%～50%為2 分，51%～75%為3 分，>75%為4 分；細(xì)胞染色強(qiáng)度：無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果>3 分為陽性表達(dá)病例，≤3 分為陰性表達(dá)病例。

1.2.2分離外周血T細(xì)胞與重組B7-H4蛋白共培養(yǎng)將乳癌患者的新鮮抗凝外周血用人淋巴細(xì)胞分離液梯度離心后獲得單個(gè)核細(xì)胞,再經(jīng)尼龍毛柱分離T細(xì)胞，將T細(xì)胞加入RPMI1640 (含10% 小牛血清)和PHA (5～10 μg/ml )于37℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞增殖、凋亡和FOXP3+T/CD4+T細(xì)胞。

1.2.2.1 FCM檢測T細(xì)胞增殖指數(shù)分別收集B7-H4組和空白對照組外周血活化T細(xì)胞，將抗CD4-FITC或抗CD8-FITC與抗Ki67-PE室溫孵育15 min后，檢測CD4+T或 CD8+T細(xì)胞Ki67陽性率。

1.2.2.2FCM檢測T細(xì)胞凋亡B7-H4組和空白對照組T細(xì)胞， 避光滴加Annexin V-PE/7-AAD及抗人CD4-FITC和(或)抗人CD8-PE(FITC)、抗人CD3-PE抗體孵育20 min 后，PBS 緩沖液洗2次，5 min/次，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2.3FCM檢測CD25+FOXP3+T/CD4+T細(xì)胞B7-H4組和空白對照T細(xì)胞， 避光滴加抗人CD25-TRITC、抗人FOXP3-PE、抗人CD4-FITC抗體孵育20 min后，PBS緩沖液洗3次后，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞比例。

1.2.2.4ELISA芯片檢測細(xì)胞因子含量收集上述各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的上清液,按說明書將每張芯片內(nèi)加入200 μl T細(xì)胞培養(yǎng)上清液，室溫?fù)u床孵育2 h； 加入洗液200 μl洗液Ⅰ搖床震蕩清洗3次，每次5 min;再用200 μl洗液Ⅱ 搖床震蕩清洗2次，每次5 min；棄去洗液后加入生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體室溫?fù)u床孵育2 h,如前清洗后與檢測液C和D的混合液500 μl室溫震蕩2 min后放入蛋白芯片檢測儀進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1B7-H4在乳腺浸潤性癌、癌旁組織和纖維腺瘤的表達(dá)乳腺纖維腺瘤、乳腺癌旁組織中，B7-H4在腺泡細(xì)胞的頂部和末梢導(dǎo)管上皮呈陰性或弱陽性表達(dá)，陽性率分別為20% (2/10) 和30%(3/10) 。在乳腺浸潤性癌癌細(xì)胞胞漿和胞膜的陽性表達(dá)率為84.62%(44/52)，顯著高于癌旁組織和纖維腺瘤組織(P<0.01，P<0.01 )；而乳腺纖維腺瘤和癌旁組織的表達(dá)無明顯差異(P>0.05 )(表1，圖1)。

2.2重組B7-H4對乳腺癌患者外周血T細(xì)胞增殖的影響重組B7-H4與乳腺癌患者外周血活化T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示乳腺癌患者B7-H4組CD4+T和CD8+T細(xì)胞的Ki67指數(shù)分別為(16.08±3.24%)和(9.81±1.58%) ，而空白對照組為(15.04±2.32%)和(11.24±2.72%)，兩組間無明顯差別(P>0.05，P>0.05) (圖2)。

表1B7-H4在乳腺浸潤性癌、癌旁組織和纖維腺瘤的表達(dá)

Tab.1B7-H4 expression in breast carcinomas, peri-carcinoma tissues and fibroadenomas

GroupsnB7-H4expression-+(%)χ2PBreastcarcinomas52844(84.62%)15.0701)0.0001)Pericarcinomatissues1073(30.00%)10.8252)0.0012)Fibroadenomas1082(20.00%)0.0003)1.0003)

Note：1)breast carcinomas and fibroadenomas; 2)breast carcinomas and peri-carcinoma tissues;3)peri-carcinoma tissues and fibroadenomas.

圖1　B7-H4在乳腺浸潤性癌、癌旁組織和纖維腺瘤的表達(dá)Fig.1　B7-H4 expression in breast carcinomas,pericarci-noma tissues and fibroadenomasNote: A.Positive B7-H4 expression in breast carcinoma(IHC,×400);B.Weak B7-H4 expression in epithelium of peri-carcinoma tissue(IHC,×400);C.Negative B7-H4 expression in fibroadenoma(IHC,×100 ).

圖2　混合培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的Ki67指數(shù)Fig.2　Ki67 positive rates of co-cultured T cells

2.3重組B7-H4對乳腺癌患者外周血T細(xì)胞凋亡的影響重組B7-H4與乳腺癌患者外周血活化T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)48 h后，總T細(xì)胞凋亡率較空白組增高，分別是(17.6± 3.39)%和(14.8± 3.98)%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)B7-H4組和空白組CD8+T細(xì)胞凋亡率分別為(21.3±2.24)%和(10.2±1.36)%，兩組間差異顯著(P<0.05)，而B7-H4組CD4+T細(xì)胞的凋亡率較空白組低，凋亡率分別為(10.3±2.45)%和(13.1±2.37)%，但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05) (圖3)。

2.4重組B7-H4對乳癌患者FOXP3+T細(xì)胞的影響重組B7-H4與乳腺腺癌患者外周血T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)48 h后，CD25+FOXP3+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占的比例明顯高于空白對照組，分別為(52.07±5.48)%和(4.12±1.25)%(P<0.05) (圖4)。

2.5重組B7-H4對T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響重組B7-H4與乳腺癌患者外周血活化T細(xì)胞混合培養(yǎng)48 h后，定量ELISA芯片檢測到培養(yǎng)上清液中GM-CSF、IL-1β 、IL-6、IL-17F和IL-23的含量與空白對照組無明顯差異；但B7-H4組和空白組TGF-β1的含量分別為1 194.17±165.21和588.57±146.20；IL-17的含量分別為1 122.40± 221.79及555.17± 108.42。B7-H4組TGF-β1 和IL-17均顯著高于空白組(P<0.05，P<0.05)(圖5)。

圖3　乳腺癌患者外周血T淋巴細(xì)胞凋亡Fig.3　Apoptosis of peripheral blood T lymphocytes for breast cancer patient

圖4　B7-H4混合培養(yǎng)T細(xì)胞中的CD25+FOXP3+T細(xì)胞Fig.4　CD25+FOXP3+T cells in co-cultured T cells with B7-H4

圖5　T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液TGF-β1和IL-17含量Fig.5　Concentration of TGF-β1 and IL-17 in supernatant of cultured T lymphocytes

3討論

本實(shí)驗(yàn)觀察到B7-H4在84.62% 的乳腺浸潤性癌細(xì)胞異常高表達(dá)，在癌旁組織及乳腺纖維腺瘤中無表達(dá)或微弱表達(dá)。因腫瘤細(xì)胞的跨膜B7-H4蛋白不穩(wěn)定且可被誘導(dǎo)生成，文獻(xiàn)也報(bào)道腫瘤患者血清中可溶性B7-H4蛋白的水平與預(yù)后差有關(guān)[10]，因而我們將重組人B7-H4蛋白與乳腺浸潤性癌患者外周血經(jīng)PHA活化的T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)觀察到B7-H4組和空白對照組CD4+T、CD8+T細(xì)胞Ki67指數(shù)無明顯差別，提示B7-H4抑制T 細(xì)胞增殖的影響作用不明顯。Kristensen等[17]在對正常小鼠腸系膜淋巴結(jié)T細(xì)胞的研究也發(fā)現(xiàn)B7-H4對T細(xì)胞增殖無抑制作用；然而Wang等人發(fā)現(xiàn)B7-H4蛋白能抑制鼠CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖，通過干擾ERK、P38、JNK蛋白激酶的活性以及T細(xì)胞的AKT通路[18]，我們考慮出現(xiàn)上述差異性結(jié)果可能與B7-H4蛋白和T細(xì)胞的種系來源不同有關(guān)。在分析CD8+T和CD4+T細(xì)胞亞群的凋亡率時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)B7-H4對乳腺癌患者CD8+T細(xì)胞有明顯的促凋亡作用，但對CD4+T 細(xì)胞作用較小。CD4+T和CD8+T細(xì)胞是T細(xì)胞的兩個(gè)重要亞群，CD8+T細(xì)胞作為抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，其數(shù)量和功能決定著宿主腫瘤局部的抗腫瘤免疫水平。本研究結(jié)果證實(shí)B7-H4促進(jìn)CD8+T細(xì)胞凋亡，從而削弱了CD8+T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤作用。

FOXP3+Tregs 是重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，通過與細(xì)胞直接接觸或分泌TGF-β1及IL-10等抑制性細(xì)胞因子而抑制免疫細(xì)胞功能[19]，是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因子[20]。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)分析了B7-H4對乳腺癌患者外周血FOXP3+T/CD4+T 的影響，結(jié)果顯示B7-H4組FOXP3+T/CD4+T 顯著高于空白組，結(jié)合前期發(fā)現(xiàn)B7-H4組CD4+T細(xì)胞的Ki67指數(shù)略高于空白對照組，但凋亡率反而較空白對照組低，我們推測B7-H4可能直接或間接刺激Treg細(xì)胞增殖或抑制其凋亡，從而導(dǎo)致乳腺癌患者體內(nèi)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞增多。Kristensen等也發(fā)現(xiàn)B7-H4融合蛋白可增加小鼠體內(nèi)Tregs的功能活性[17]。

因T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可反映其免疫活性，我們用定量ELISA芯片檢測與B7-H4共培養(yǎng)的乳腺浸潤癌患者外周血T細(xì)胞上清液的細(xì)胞因子含量，發(fā)現(xiàn)B7-H4組T細(xì)胞分泌TGF-β1和IL-17的量明顯高于空白對照組。雖然TGF-β1和IL-17在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮的作用尚有爭議，但眾多研究結(jié)果支持兩者是免疫抑制細(xì)胞因子。TGF-β1不僅在誘導(dǎo)Tregs細(xì)胞分化過程中起重要作用[21]，還通過減少腫瘤微環(huán)境CD8+T、CD4+T和DCs浸潤數(shù)量、促進(jìn)血管生成來抑制免疫應(yīng)答，最終促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[2]。IL-17 可以上調(diào)單核細(xì)胞表面的共抑制分子B7-H1 從而抑制抗腫瘤細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答[21]，也可通過招募髓源性抑制細(xì)胞到腫瘤局部發(fā)揮免疫抑制作用，從而間接促進(jìn)腫瘤生長[16]。

總之，我們的研究結(jié)果表明B7-H4在乳腺浸潤性癌中異常高表達(dá)，并可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌免疫抑制細(xì)胞因子TGF-β1和IL-17。B7-H4在抑制乳腺癌微環(huán)境的抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，有可能成為新的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。

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[收稿2015-09-22]

(編輯張曉舟)

B7-H4 expression in human breast carcinoma and its role on cytokine secretion and apoptosis of peripheral blood T cells

SHEN Yi-Fan,HUANG Wen-Lian,XU Man,SU Xin-Liang,WANG Tao.

Department of Pathology,Molecular Medicine and Tumor Research Center of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

[Abstract]Objective:To explore B7-H4 expression in human invasive breast carcinomas and study the effect of recombinant human B7-H4 protein on the active peripheral blood T lymphocytes of the patients in vitro.Methods: B7-H4 expression was detected in 52 cases of breast cancer with immunohistochemistry staining.After the activated peripheral blood T lymphocytes of breast cancer patients were co-cultured with B7-H4,the proliferation,apoptosis and cell subtypes were tested by FCM,and the concentration of cytokines in the supernatant were detected by ELISA microarray.Results: B7-H4 was expressed in 84.62% (44/52) of invasive breast cancers,with the positive rates significantly higher than that of fibroadenomas and the adjacent tissues of breast cancers(P<0.01，P<0.01).There were no significant differences of Ki67 positive rates of T cells between B7-H4 groups and blank groups;however,B7-H4 played stronger role in promoting apoptosis of CD8+T cells than that of CD4+T cells.The rate of FOXP3+T/CD4+T cells in B7-H4 groups were higher than that of blank groups(P<0.05).The concentration of TGF-β1 and IL-17 in the supernatant of B7-H4 co-cultured T cells were significantly higher than that of blank groups(P<0.05，P<0.05) .Conclusion: B7-H4 overexpresses in invasive breast carcinomas.In vitro，B7-H4 promotes apoptosis of CD8+T cells,and the secretion of IL-17 and TGF-β1 by T cells .B7-H4 plays a role in weakening anti-tumor T cell immune response of the breast cancer microenviroment.

[Key words]B7-H4；Breast carcinoma；CD8+T;Apoptosis；TGF-β1；IL-17

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.021

作者簡介：沈依帆(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤病理與腫瘤免疫學(xué)研究，E-mail：shenyifan1990@126.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：徐曼(1964年-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理與腫瘤免疫學(xué)研究，E-mail：2402316007@qq.com。

中圖分類號R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0867-05

①本文為重慶市自然科學(xué)基金(CSTC2009BB5268)項(xiàng)目。

②重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌乳腺外科，重慶400016。