猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)提取優(yōu)化及抗氧化研究

何晉浙，沈　強(qiáng)

(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014)

猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)提取優(yōu)化及抗氧化研究

何晉浙，沈強(qiáng)

(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：為了提高猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率，通過(guò)酶解和酸解關(guān)鍵技術(shù)對(duì)猴頭菌菌絲體進(jìn)行前處理，再通過(guò)溶劑回流提取方法進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化；為了研究猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)的抗氧化性能，采用體外抗氧化活性法測(cè)定萜類(lèi)物質(zhì)的超氧陰離子、DPPH·和ABTS+·自由基清除能力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：酶解和酸解相結(jié)合的前處理，夠顯著提高猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)的提取率；通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法(RSM)實(shí)驗(yàn)，得到優(yōu)化的回流提取工藝條件為料液比1∶36 g/mL，提取溫度63 ℃，提取時(shí)間92 min，猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)小分子活性物質(zhì)的提取率從1.80%提高到3.39%；萜類(lèi)物質(zhì)清除超氧陰離子的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50=0.926 mg/mL；清除DPPH·自由基的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50=1.206 mg/mL；清除ABTS+·自由基的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50=0.403 mg/mL.該研究可為猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)的工業(yè)提取和應(yīng)用提供新的參考.

關(guān)鍵詞：萜類(lèi)物質(zhì)；酶解和酸解；響應(yīng)面分析；抗氧化活性

猴頭菌在分類(lèi)學(xué)上隸屬菌物界，擔(dān)子菌門(mén)，擔(dān)子菌綱，猴菌目，猴菌科，猴菌屬[1-2].猴頭菌的藥效成分主要有多糖、低聚糖、甾醇、脂肪酸等，具有降血糖、增強(qiáng)人體免疫力、保肝護(hù)胃、保護(hù)神經(jīng)、抗氧化和抗癌等功效[3-5].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從猴頭菌菌絲體提取分離出來(lái)的猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)其主要組成為猴頭菌素[6-7]，具有刺激神經(jīng)生長(zhǎng)因子、抗氧化和抗菌效用等藥理學(xué)作用，尤其對(duì)阿爾茨海默病(老年癡呆癥)的治療、外圍神經(jīng)細(xì)胞再生起到重要促進(jìn)作用[8-12]，目前對(duì)于治療老年癡呆癥的食用天然產(chǎn)物的研究已成為國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)[13].由于猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率極低，如文獻(xiàn)報(bào)道采用的溶劑回流提取、微波提取、超聲提取和超臨界提取率均小于2.4%[8-12]，且提取成本高，使猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)進(jìn)一步提取與開(kāi)發(fā)利用成為瓶頸.

針對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率低這一關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)，采用了纖維素酶酶解和酸水浸泡的關(guān)鍵技術(shù)，通過(guò)破壞猴頭菌菌絲體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，再進(jìn)行溶劑回流提取猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)；采用體外抗氧化活性法測(cè)定萜類(lèi)物質(zhì)的超氧陰離子、DPPH·及ABTS+·自由基的清除能力，評(píng)價(jià)其抗氧化活性.

1材料與方法

1.1材料與試劑

猴頭菌菌絲體粉末60目，北京福爾康生物技術(shù)研究所.

乙醇(體積分?jǐn)?shù)為95%)、鹽酸、乙酸、硫酸、香蘭素、無(wú)水乙醇、高氯酸、石油醚和乙酸乙酯等均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶(1.8×104 U/g)，和氏璧微生物技術(shù)有限公司；野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH) 、ABTS，美國(guó)Sigma 公司.

1.2主要儀器設(shè)備

UV-7504紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海信森實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AL-104電子天平，METTLER TOLEDO有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮盛華儀器廠.

1.3提取工藝流程與方法

1.3.1工藝流程

猴頭菌菌絲體粉末→稱(chēng)量→纖維素酶酶解→高溫滅酶→酸水浸泡24 h→蒸干水分→溶劑回流提取→過(guò)濾→定容→紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD值(紫外分光光度法).

1.3.2不同方法對(duì)猴頭菌菌絲體粉末中萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

1) 乙醇回流提取法

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥猴頭菌菌絲體粉末10 g(精確到0.000 1 g)，轉(zhuǎn)移到500 mL圓底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇100 mL，在回流提取裝置中回流提取(提取料液比1∶ 20 g/mL，提取時(shí)間60 min，提取溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%,)，過(guò)濾，乙醇定容至250 mL.

2) 酶解前處理乙醇回流提取法

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥猴頭菌菌絲體粉末10 g(精確到0.000 1 g)，置于250 mL燒杯中，加水100 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH到4.5，加入0.1 g纖維素酶，恒溫水浴鍋內(nèi)50 ℃酶解90 min，煮沸滅活10 min.轉(zhuǎn)移到500 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇100 mL，溶劑回流提取(提取料液比1∶20 g/mL，提取時(shí)間60 min，提取溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%)，過(guò)濾，乙醇定容至250 mL.

3) 酸水浸提前處理乙醇回流提取法

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥猴頭菌菌絲體粉末10 g(精確到0.000 1 g)，置于250 mL燒杯中，加水100 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2，浸泡24 h，轉(zhuǎn)移到500 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇100 mL，溶劑回流提取(提取料液比1∶20 g/mL，提取時(shí)間60 min，提取溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%)，過(guò)濾，乙醇定容至250 mL.

4) 酶解加酸水浸提前處理乙醇回流提取法

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥猴頭菌菌絲體粉末10 g(精確到0.000 1 g)，置于250 mL燒杯中，加水100 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4.5，加入0.1 g纖維素酶，50 ℃酶解90 min，煮沸滅活10 min.用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2，浸泡24 h，轉(zhuǎn)移到500 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇100 mL，溶劑回流提取(提取料液比1∶20 g/mL，提取時(shí)間60 min，提取溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%)，過(guò)濾，乙醇定容至250 mL.

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS18.0軟件對(duì)四種不同前處理對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.4猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)定性鑒定

取乙醇提取液進(jìn)行薄層色譜分析，展開(kāi)劑為乙酸乙酯和石油醚體系，顯色分別為萜類(lèi)物質(zhì)通用指示劑硫酸乙醇和香蘭素硫酸乙醇.硅膠板上顯示出紫紅色斑點(diǎn)，說(shuō)明提取液中含有猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)[14].

取乙醇提取液1 mL至具塞試管中，揮發(fā)掉溶劑，加入0.4 mL 冰醋酸-香草醛溶液(5 g香草醛溶于冰醋酸，定容到100 mL)和1.5 mL高氯酸，70 ℃水浴15 min后，加入5 mL無(wú)水乙醇，充分震蕩后，用無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，在400～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全掃描.在540 nm附近若出現(xiàn)最大吸收峰，說(shuō)明提取液中含有猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)[15-17].

1.5萜類(lèi)成分的測(cè)定和提取率計(jì)算

采用紫外分光光度法測(cè)定猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率[18-20].

以野黃芩苷為標(biāo)準(zhǔn)品，分別用溶劑無(wú)水乙醇配制質(zhì)量濃度分別為4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，在210 nm處進(jìn)行紫外測(cè)定，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作.

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示.回歸方程:y=0.080 1x-0.033 3，R2=0.999 8，表明野黃芩苷在4～20 μg /mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

圖1　野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Calibration plot of scutellarin

猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率=(萜類(lèi)小分子質(zhì)量濃度×體積×稀釋倍數(shù))/原料質(zhì)量×100%.

1.6單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度及提取時(shí)間為單因素，對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取進(jìn)行研究[21].

1.6.1料液比條件控制

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥猴頭菌菌絲體粉末10 g(精確到0.000 1 g)，置于250 mL燒杯中，加水100 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4.5，加入0.1 g纖維素酶，50 ℃酶解90 min，煮沸滅活10 min.用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2，浸泡24 h，轉(zhuǎn)移到500 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，采用不同料液比(1∶ 10，1∶ 20，1∶ 30，1∶ 40，1∶ 50 g/mL)提取，回流提取設(shè)定條件：提取時(shí)間60 min，提取溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%.

1.6.2乙醇體積分?jǐn)?shù)條件控制

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥猴頭菌菌絲體粉末10 g(精確到0.000 1 g)，置于250 mL燒杯中，加水100 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4.5，加入0.1 g纖維素酶，50 ℃酶解90 min，煮沸滅活10 min.用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2，浸泡24 h，轉(zhuǎn)移到500 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用不同提取乙醇體積分?jǐn)?shù)(45%，55%，65%，75%，85%，95%)提取，回流提取設(shè)定條件：料液比1∶30 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間60 min.

1.6.3溫度條件控制

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥猴頭菌菌絲體粉末10 g(精確到0.000 1 g)，置于250 mL燒杯中，加水100 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4.5，加入0.1 g纖維素酶，50 ℃酶解90 min，煮沸滅活10 min.用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2，浸泡24 h，轉(zhuǎn)移到500 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用不同溫度(50，60，70，80，90 ℃)提取，回流提取設(shè)定條件：提取時(shí)間60 min，料液比1∶30 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%.

1.6.4時(shí)間條件控制

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥猴頭菌菌絲體粉末10 g(精確到0.000 1 g)，置于250 mL燒杯中，加水100 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4.5，加入0.1 g纖維素酶，50 ℃酶解90 min，煮沸滅活10 min.用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2，浸泡24 h，轉(zhuǎn)移到500 mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用不同提取時(shí)間(30，60，90，120，150 min)提取，回流提取設(shè)定條件：料液比1∶30 g/mL，提取溫度70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%.

1.7Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，試驗(yàn)輔助軟件采用Design Expert8.0.6，選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率影響顯著的三個(gè)因素， 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)因素水平及編碼如表1所示.

表1　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼及水平

1.8抗氧化活性的測(cè)定

參照邵芬娟等[22]的方法，配置與樣品濃度相應(yīng)的不同濃度的BHT和PG溶液作為對(duì)照.

1.8.1清除超氧陰離子自由基能力測(cè)定

在弱堿性條件下，鄰苯三酚自氧化，O2-·清除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在λ=325 nm吸收峰處受抑制[23].

分別取3 mL TRIS-HCL緩沖溶液(50 mmol/L，pH=8.2)于試管中，25 ℃水浴中預(yù)熱20 mim，取出后立即加入2 mL樣品溶液和1 mL的5 mmol/L鄰苯三酚，混勻后25 ℃水浴保溫40 min，在325 nm下測(cè)吸光值.清除率為

C=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

式中：A0為未加樣液的鄰苯三酚的吸收值；A1為待測(cè)樣品吸收值；A2為未加鄰苯三酚的樣液吸收值.

1.8.2對(duì)自由基DPPH·的清除作用

DPPH是一種比較穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有有一強(qiáng)吸收峰，自由基清除劑的存在使其褪色.

移取1 mL樣品溶液于試管中，加入2 mL用無(wú)水乙醇配制的0.1 mmol/L DPPH溶液，搖勻后室溫放置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值.清除率為

C=[1-(A1-A0)/A2]×100%

式中：A2為2 mL DPPH·溶液與2 mL乙醇溶液混合后的吸光度；A1為2 mL樣品溶液與2 mL DPPH·溶液混合后的吸光度；A0為2 mL樣品溶液與 2 mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度.

1.8.3清除ABTS+·自由基的測(cè)定

ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基ABTS+·，抗氧化物質(zhì)與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，這種自由基在734 nm處有最大吸光度，在734 nm處測(cè)定吸光度便可以定量分析樣品的抗氧化能力[24].

移取1 mL樣品溶液于試管中，加入3 mL ABTS+·工作液(7 mmol/L ABTS二銨鹽溶液和4.9 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液1∶1混合均勻，避光反應(yīng)12 h，1∶50的比例稀釋)，搖勻后靜置1 h，在734 nm處測(cè)吸光值.清除率為

C=[1-(A1-A0)/A2]×100%

式中：A2為2 mL ABTS+· 溶液與2 mL乙醇混合后的吸光度；A0為2 mL乙醇溶液與2 mL樣品液的吸光度；A1為2 mL ABTS+·溶液與2 mL樣品溶液混合后的吸光度.

2結(jié)果與討論

2.1不同前處理對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

不同前處理對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響，如表2所示.

表2不同前處理對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

Table 2Comparison of the yield of small molecule terpenoids active substances with different pretreatment

方法1)提取率/%乙醇回流提取法1.793±0.017酶解前處理乙醇回流提取法2.579±0.025酸水浸提前處理乙醇回流提取法2.789±0.030酶解加酸水浸提前處理乙醇回流提取法3.193±0.033

注：1) 乙醇的體積分?jǐn)?shù)為95%.

結(jié)果得出酶解加酸水浸提前處理后再用溶劑提取與直接溶劑提取兩者間的提取率差異達(dá)到顯著水平(P<0.05).

2.2單因素試驗(yàn)分析

2.2.1料液比對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取的影響

由圖2可看出：猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率隨著料液比的增大先增大后趨于平穩(wěn)，當(dāng)料液比超過(guò)1∶30 g/mL時(shí)，再增大料液比，提取率趨于穩(wěn)定.可能因?yàn)?∶30 g/mL溶劑已將萜類(lèi)物質(zhì)溶出完全，綜合考慮萜類(lèi)物質(zhì)提取率、溶劑用量和能量損耗等因素，故選擇料液比1∶30 g/mL為宜.

圖2　溶劑回流提取法中料液比對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取的影響Fig.2　Effect of material liquid ratio on yield of terpenoids substances from hericium erinaceum by heating in water bath

2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取的影響

由圖3可看出：45%乙醇對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率相對(duì)不高，而高體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)于猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率影響并不是很大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，萜類(lèi)物質(zhì)提取率略高于其他乙醇體積分?jǐn)?shù)提取率，由此認(rèn)為，溶劑回流提取猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)的乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%左右為宜.

圖3　溶劑回流提取法中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on yield of terpenoids substances from hericium erinaceum by heating in water bath

2.2.3溫度對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取的影響

由圖4可看出：隨著溫度的升高，猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率先增大后減小，當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，萜類(lèi)物質(zhì)的提取率達(dá)到最大.可能的原因是在50～70 ℃的溫度范圍內(nèi)，升高溫度能有效加快分子運(yùn)動(dòng)，增大細(xì)胞壁的摩擦力，破壁效應(yīng)增強(qiáng)，利于萜類(lèi)物質(zhì)的提取，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，高溫會(huì)破壞提取液中的部分萜類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致提取率的下降，因此，選擇70 ℃為較佳的提取溫度.

圖4　溶劑回流提取法中溫度對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取的影響Fig.4　Effect of temperature on yield of terpenoids substances from hericium erinaceum by heating in water bath

2.2.4時(shí)間對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取的影響

由圖5可看出：隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率先增大后趨于平穩(wěn)，當(dāng)時(shí)間為90 min左右時(shí)，萜類(lèi)物質(zhì)提取率達(dá)到最大值.其中的原因可能是當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，萜類(lèi)物質(zhì)的提取不完全，當(dāng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，使萜類(lèi)物質(zhì)完全被提取出來(lái)了，綜合考慮選擇90 min左右為宜.

圖5　溶劑回流提取法中時(shí)間對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取的影響Fig.5　Effect of time on yield of terpenoids substances from hericium erinaceum by heating in water bath

2.3響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合分析單因素，選取對(duì)猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)提取率影響較大的料液比、提取時(shí)間和提取溫度3 因素，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，如表3所示.

表3　響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

以3次實(shí)驗(yàn)所得猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率的平均值為響應(yīng)值(Y)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)中， 其中試驗(yàn)號(hào)1～12是析因?qū)嶒?yàn)， 試驗(yàn)號(hào)13～17是中心實(shí)驗(yàn)， 用來(lái)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差.Y對(duì)表3進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸方程Y=-8.682 27+0.082 295X1+0.271 70X2+0.051 078X3-2.085 75×10-3X12-2.478 25×10-3X22-3.286 94×10-4X32+7.600 10-4X1X2+2.166 67×10-5X1X3+1.341 67×10-4X2X3，各因素的方差分析見(jiàn)表4.

表4　二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

注：1) Prob>F.

回歸方程也是高度顯著的，相關(guān)系數(shù)R2=99.23%， 說(shuō)明響應(yīng)值(提取率)的變化有99.23%來(lái)源于所選變量， 即提取溫度、料液比和提取時(shí)間.方差分析表明，方程模型極顯著P<0.000 1，失擬項(xiàng)不顯著P>0.05，表4說(shuō)明方程擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，其他因素對(duì)結(jié)果的影響較小.

由表4可以看出：各因素中一次項(xiàng)X2是高度顯著的， 其次是二次項(xiàng)X1X2.通過(guò)得出的模型，回流提取猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)最優(yōu)條件： 料液比1∶ 35.77 g/mL，提取溫度T=63 ℃， 提取時(shí)間t=92.06 min，提取率3.35%.考慮到實(shí)際操作的便利，猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)最佳提取工藝條件修正為料液比1∶ 36 g/mL，提取溫度63 ℃，提取時(shí)間為92 min.為了驗(yàn)證模型的有效性，在修正條件下提取，試驗(yàn)重復(fù)3次驗(yàn)證，平均得率為3.39%，與理論預(yù)測(cè)值相比相對(duì)誤差在1.2%左右.因此， 采用RSM法優(yōu)化得到的回流提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠， 具有實(shí)用價(jià)值.

對(duì)于三個(gè)因素，選取其中一個(gè)為固定值時(shí)，其他兩因素及其交互作用對(duì)吸光度影響的響應(yīng)曲面及等高線圖如圖 6～8 所示.直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響， 由等高線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處.比較三組圖可知:提取溫度(X2)對(duì)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響最為顯著， 表現(xiàn)為曲線較陡；而料液比(X1)與提取時(shí)間(X3)次之，現(xiàn)為曲線較為平滑， 且隨其數(shù)值的增加或減少， 響應(yīng)值變化較小.

圖6　料液比和提取溫度交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面Fig.6　The response surface for the effect of cross-interaction between material liquid ratio and extraction temperature on yield of terpenoids substances from hericium erinaceum

圖7　料液比和提取時(shí)間交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面Fig.7　The response surface for the effect of cross-interaction between material liquid ratioand extraction time on yield of terpenoids substances from hericium erinaceum

圖8　提取溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)吸光度影響的響應(yīng)面Fig.8　The response surface for the effect of cross-interaction between extraction temperature and extraction time on yield of terpenoids substances from hericium erinaceum

2.4猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)抗氧化性

2.4.1清除超氧陰離子自由基能力

由圖9可知：萜類(lèi)物質(zhì)具有一定的抗氧化能力，但是在低質(zhì)量濃度0.1～1.0 mg/mL與標(biāo)準(zhǔn)脂溶性抗氧化劑BHT、PG相比，它的抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于BHT和PG，隨著質(zhì)量濃度增加到1.5 mg/mL時(shí)，萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)于超氧陰離子的清除能力已趨于和BHT、PG等標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑相同.猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)清除超氧陰離子的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50=0.926 mg/mL.

圖9　萜類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度、BHT與PG對(duì)超氧陰離子的清除率的比較Fig.9　Superoxide anion scavenging rate of terpenoids substances, BHT and PG under different concentrations

2.4.2清除DPPH·自由基的活力

由圖10可知：萜類(lèi)物質(zhì)在低質(zhì)量濃度0.1～1.5 mg/mL條件下，對(duì)于DPPH·自由基子的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)脂溶性抗氧化劑BHT和PG，隨著質(zhì)量濃度增加到2 mg/mL時(shí)，萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)于DPPH·自由基的清除能力已和BHT、PG等標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑非常接近，可見(jiàn)猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH·自由基的清除能力較強(qiáng).猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)清除DPPH·自由基的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50=1.206 mg/mL.

圖10　萜類(lèi)物質(zhì)、BHT與PG對(duì)DPPH·的清除率的比較Fig.10　DPPH scavenging rate of terpenoids substances, BHT and PG under different concentrations

2.4.3清除ABTS+·自由基的活

由圖11可知：萜類(lèi)物質(zhì)在低質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/mL條件下，對(duì)于ABTS+·自由基自由基子的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)脂溶性抗氧化劑BHT、PG，隨著質(zhì)量濃度增加到1～2 mg/mL時(shí)，萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)于ABTS+·自由基的清除率達(dá)到80%左右，可見(jiàn)猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)ABTS+·自由基有一定程度的清除能力.猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)清除ABTS+·自由基的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50=0.403 mg/mL.

圖11　萜類(lèi)物質(zhì)、BHT與PG對(duì)ABTS+·自由基的清除率的比較Fig.11　ABTS scavenging rate of terpenoids substances, BHT and PG under different concentrations

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)發(fā)酵品種猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)的關(guān)鍵提取工藝技術(shù)的研究，可得出：利用纖維素酶水解和酸水解復(fù)合前處理可顯著提高猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)回流提取提取率.在單因素實(shí)驗(yàn)分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行料液比、溫度和時(shí)間的三因素三水平響應(yīng)面法(RSM)的回流提取工藝參數(shù)的優(yōu)化研究，得出：經(jīng)酶解和酸解復(fù)合處理后的猴頭菌菌絲體再經(jīng)乙醇回流提取，可使猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)的提取率從1.80%顯著提高到3.39%左右.猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取工藝影響因素影響大小依次是提取溫度>料液比>時(shí)間.其優(yōu)化工藝條件：料液比1∶36 g/mL，提取溫度63 ℃，提取時(shí)間為92 min.同時(shí)猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)的抗氧化實(shí)驗(yàn)證明：隨著萜類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度的增大，其清除自由基的能力增強(qiáng)，其清除超氧陰離子的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50=0.926 mg/mL；清除DPPH·自由基的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50=1.206 mg/mL；清除ABTS+·自由基的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50=0.403 mg/mL.猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，提高猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)提取率，將會(huì)使得資源得到充分利用和為猴頭菌菌絲體中萜類(lèi)物質(zhì)的工業(yè)制備提供了發(fā)展前景.猴頭菌菌絲體萜類(lèi)物質(zhì)表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，可以作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用在食品和保健品工業(yè)中.

參考文獻(xiàn)：

[1]袁勝東，羅霞，余夢(mèng)瑤，等.猴頭菌生物活性成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(15):8926-8928.

[2]李潔莉,邱建勇.猴頭菌及其提取物有關(guān)甾醇類(lèi)化合物初探[J].中國(guó)生化藥物雜志,2001,22(3):124-126.

[3]王曉玉,蔣秋燕,凌沛學(xué),等.猴頭菌活性成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志,2010(1):70-72.

[4]張鵬,圖力古爾,包海鷹.猴頭菌屬真菌化學(xué)成分及藥理活性研究概述[J].菌物研究,2011,9(1):54-62.

[5]王鴻,潘超,周峰,等.海洋真菌Penicillium citrinum MNP 12010101代謝產(chǎn)物的分離鑒定和活性研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,42(4):409-412.

[6]尚曉冬,王國(guó)艷,潘偉,等.猴頭菌小分子活性成分研究進(jìn)展[J].食用菌學(xué)報(bào),2012,19(1):79-91.

[7]麻兵繼,徐俊蕾,文春南,等.猴頭菌子實(shí)體化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2012,24(9):1165-1168.

[8]KAWAGISHI H, SHIMADA A, SHIRAI R, et al. Erinacines a, b and c, strong stimulators of nerve growth factor(NGF)-synthesis, from the mycelia of Hericium erinaceum[J]. Tetrahedron letters,1994,35(10):1569-1572.

[9]KAWAGISHI H, SHIMADA A, HOSOKAWA S, et al. Erinacines e, f, and g, stimulators of nerve growth factor(NGF)-synthesis, from the mycelia of Hericium erinaceum[J]. Tetrahedron letters,1996,37(41):7399-7402.

[10]KAWAGISHI H, MASUI A, TPOKOYAMA S, et al. Erinacines j and k from the mycelia of Hericium erinaceum[J]. Tetrahedron,2006,62(36):8463-8466.

[11]SAITOT, AOKI F, HIRAI H, et al. Erinacine e as a kappa opioid receptor agonist and its new analogs from a basidiomycete, Hericium ramosum[J]. The journal of antibiotics,1998,51(11):983-990.

[12]SHIMBO M, KAWAGISHI H, YOKOGOSHU H. Erinacine a increases catechola mine and nerve growth factor content in the central nervous system of rats[J]. Nutrition research,2005,25(6):617-623.

[13]路強(qiáng)強(qiáng).猴頭菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2013.

[14]姚乾元,賈元印.香草醛-濃硫酸薄層色譜顯色劑的改進(jìn)[J].中藥通報(bào),1986(7):25-47.

[15]劉海霞,趙雁武,王峰,等.植物甾醇中三萜類(lèi)化合物的含量測(cè)定[J].食品工業(yè)科技,2008(6):280-283.

[16]鄧韻,蔡妙顏,田野,等.溪黃草不同溶劑提取物中總二萜含量的測(cè)定[J].現(xiàn)代食品科技,2005,21(2):153-154.

[17]馬鳳森,劉丹,吳小娟,等.雷公藤總?cè)茰y(cè)定的方法學(xué)比較研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,43(3):293-297.

[18]杜永峰,周健,姚秉華.紫外分光光度法測(cè)定黃芩中黃芩苷的含量[J].化學(xué)分析計(jì)量,2008,17(5):43-45.

[19]成英,胡建平.紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定續(xù)隨子種子中大環(huán)二萜類(lèi)化合物[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(4):927-928.

[20]徐大光,陰志剛,侯曉強(qiáng),等.紫外-可見(jiàn)分光光度法在藥物分析中的應(yīng)用及進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志,2007,23(6):432-433.

[21]何榮軍,趙月鈞,趙瑞娜,等.?？庖呋钚远嗵堑拈W式提取工藝研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,43(4):389-392.

[22]邵芬娟,閆桂琴,張直峰,等.翅果油樹(shù)葉片中總生物堿抗氧化活性研究[J].西北植物學(xué)報(bào),2008,28(7):1339-1342.

[23]韓少華,朱靖博,王妍妍.鄰苯三酚自氧化法測(cè)定抗氧化活性的方法研究[J].中國(guó)釀造,2009,28(6):155-157.

[24]朱玉昌,焦必寧.ABTS法體外測(cè)定果蔬類(lèi)總抗氧化能力的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(8):77-80.

(責(zé)任編輯：陳石平)

Extracting technology and antioxidant activity of terpenoids substances from Hericium erinaceum

HE Jinzhe, SHEN Qiang

(College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:In order to increase the yield of terpenoids substances from hericium erinaceum, we developed a new method for the extraction of terpenoids substances from Hericium erinaceum with fermentation which was pretreated with enzymatic and acid hydrolysis and then optimized by the method of ethyl alcohol reflux extraction through mono-factorial experiment and response surface methodology (RSM). The antioxidant activities were measured by the superoxide action for the scavenging capacity of both DPPH· and ABTS+· radicals. The pretreatment with enzymatic and acid hydrolysis can significantly help increase the extraction yield of terpenoids substances from Hericium erinaceum mycelia material. The optimum process parameters for extraction process were obtained: ethanol concent ration 65%, liquid material ratio 1∶36 g/mL, extracting temperature 63 ℃ and extracting time 92 min. The yield of substances from hericium erinaceum was increased to 3.39% from 1.80%. The terpenoids substances showed significant antioxidant activities. The EC50of superoxide action, DPPH· and ABTS+· were 0.926 mg/mL, 1.206 mg/mL and 0.403 mg/mL, respectively. This work can provide a new perspective on the extraction of terpenoids from Hericium erinaceum mycelia material and also has a potential industrial application.

Keywords:active small molecules terpenoids substances; enzymatic and acid hydrolysis; response surface analysis;antioxidant activity

收稿日期：2015-11-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家863子項(xiàng)目(2014A，022205)

作者簡(jiǎn)介：何晉浙(1959—)，女，浙江諸暨人，副教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定，E-mail：hjzgd@zjut.edu.cn.

中圖分類(lèi)號(hào)：Q819

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-4303(2016)03-0326-08