• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于溶藻效果的溶藻細菌A21培養(yǎng)基成分優(yōu)化

    2017-04-05 18:19:40李文利傅以鋼劉征宇章忠輝
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年12期
    關(guān)鍵詞:響應(yīng)面分析藍藻培養(yǎng)基

    李文利++傅以鋼++劉征宇++章忠輝++陸雅雅

    摘要:藍藻“水華”的暴發(fā)對人體健康、水產(chǎn)養(yǎng)殖等造成了嚴重影響,微生物法是一種安全、有效的水華防治方法。通過碳源及氮源的單因素試驗、Plackett-Burman試驗設(shè)計、響應(yīng)面試驗分析對A21菌株的培養(yǎng)基進行優(yōu)化,最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。該培養(yǎng)基使A21菌株對銅綠微囊藻的葉綠素a(葉綠素a)清除效率提高了5.18%。

    關(guān)鍵詞:藍藻;溶藻細菌;培養(yǎng)基;優(yōu)化;Plackett-Burman試驗;響應(yīng)面分析

    中圖分類號: S182文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2016)12-0516-05

    收稿日期:2015-04-08

    基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:21277101);上海海洋大學(xué)橫向課題(編號:D-8006-13-0117)。

    作者簡介:李文利(1988—),女,江蘇徐州人,碩士,主要從事食品微生物研究。E-mail:1067349333@qq.com。

    通信作者:李曉暉,博士,副教授,主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail:xhli@shou.edu.cn。

    人為因素導(dǎo)致太湖水體富營養(yǎng)化進程加速,于2007年暴發(fā)了大規(guī)模“水華”,給當(dāng)?shù)鼐用駧砹丝只臶1]。近年來的監(jiān)測結(jié)果顯示,60%太湖水域的營養(yǎng)化水平處于中度污染以上,東萊水系等甚至達到重度污染,其余水域均為輕度污染[2-4]。微囊藻是太湖藍藻“水華”的優(yōu)勢藻類,銅綠微囊藻(Microcstis aeruginosa)是其代表藻株,其細胞內(nèi)含有多種色素蛋白,生長速度極快,并產(chǎn)生對人體有害的微囊藻毒素[5-6]。水體富營養(yǎng)化水平持續(xù)偏高帶來的“水華”現(xiàn)象令人堪憂,尋求一種高效、環(huán)保的抑藻物質(zhì)迫在眉睫。

    從“水華”暴發(fā)水體中分離安全、有效的溶藻細菌是一種有效的防治手段和途徑,為水污染治理提供了新的研究思路[7-9]。現(xiàn)已報道多株分離自太湖水域的溶藻細菌,為抑制藍藻“水華”現(xiàn)象提供了良好基礎(chǔ),但大多處于分離鑒定階段,對于抑藻物質(zhì)制備成本高、生物活性低且不穩(wěn)定、二次污染等生物安全性問題尚有待進一步研究,以期實現(xiàn)溶藻微生物在治理“水華”中的應(yīng)用[10]。

    本研究通過優(yōu)化溶藻菌株A21的培養(yǎng)基成分,提高對M. aeruginosa 905生物量的清除率。在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行Plackett-Burman(PB)設(shè)計,選擇出溶藻菌株A21溶藻效果的主要影響成分;根據(jù)PB試驗結(jié)果進行響應(yīng)面試驗設(shè)計(response surface methodology,RSM),建立預(yù)估模型,得到估算的最佳培養(yǎng)基配方;根據(jù)實際情況進行調(diào)整,得到溶藻菌株A21的最佳培養(yǎng)基配方。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1藻種和菌種

    銅綠微囊藻905(M. aeruginosa 905)購自中國科學(xué)院水生生物種質(zhì)庫淡水藻種庫,轉(zhuǎn)接至新鮮的BG11培養(yǎng)基中,于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h條件下培養(yǎng)[11]。溶藻菌株A21由筆者所在實驗室利用原位取樣法[12]從太湖暴發(fā)藍藻“水華”的水域分離得到,經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬。

    1.1.2主要試劑

    溶藻菌株A21的基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分為碳源5 g/L、氮源10 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L,采用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至70。營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯用于A21菌株的活化和培養(yǎng);魯格氏碘液用于藻細胞固定;丙酮用于銅綠微囊藻細胞葉綠素的提取。

    1.1.3主要儀器

    SPX-250PG型智能型光照培養(yǎng)箱(上海天恒醫(yī)療機械有限公司),SQ-UV2300型紫外可見分光光度計(北京宇艾奇電子科技有限公司),CX21型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS 奧林巴斯),藻類計數(shù)框(新科儀器,計數(shù)區(qū) 20 mm×20 mm,100個小格),TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機(湘潭湘儀儀器有限公司)等。

    1.2方法

    1.2.1溶藻試驗

    A21菌株經(jīng)營養(yǎng)瓊脂活化后接種在新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。將菌液以4 000 r/min離心10 min,取0.5 mL上清液與4.5 mL生長對數(shù)期的M. aeruginosa 905藻液進行混合,同時取0.5 mL滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)液與4.5 mL生長對數(shù)期的M. aeruginosa 905藻液混合作為對照組,置于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h條件下培養(yǎng)5 d。

    1.2.2碳源和氮源的單因素選擇

    根據(jù)微生物營養(yǎng)代謝方式的不同,選擇可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、乙酸鈉等為碳源,選擇硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素為氮源。采用不同的碳源、氮源分別培養(yǎng)菌株A21后進行溶藻試驗。

    1.2.3Plackett-Burman設(shè)計變量

    采用Mintab 16軟件進行Plackett-Burman(PB)設(shè)計,對影響A21菌株生長的9個培養(yǎng)基成分進行考察,即碳源、氮源、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培養(yǎng)基初始pH值。每個因素取高水平和低水平2個水平,高水平為低水平的1.5倍。另設(shè)X4、X8、X12為虛擬列,在試驗中為空,以考察試驗誤差。以葉綠素a清除率(%)為響應(yīng)值,設(shè)定3個平行試驗,試驗設(shè)計見表1。

    1.2.4響應(yīng)面試驗設(shè)計在Plackett-Burman試驗的基礎(chǔ)上確定響應(yīng)面分析的因素與水平,采用Box-Behnken中心組合設(shè)計4因素3水平共29個試驗點進行試驗。優(yōu)化A21菌株的培養(yǎng)基成分,并在最佳培養(yǎng)基成分配比下對銅綠微囊藻葉綠素a清除率進行3次平行試驗,證實響應(yīng)面分析法的可靠性。

    1.2.5M. aeruginosa 905生物量指標葉綠素a濃度的測定在超聲條件下使M. aeruginosa 905藻細胞破碎并釋放出葉綠素a,利用丙酮于低溫黑暗條件下萃取12 h后離心,分別于630、647、664、750 nm下測定上清液的吸光度[11-13]。根據(jù)公式(1)計算葉綠素a含量:

    C(mg/L)=11.85(D664 nm- D750 nm)-1.54(D647 nm- D750 nm)-008(D630 nm- D750 nm)。[JY](1)

    式中,D664 nm、D647 nm、D630 nm、D750 nm分別表示波長為664、647、630、750 nm 時提取液的吸光度。

    根據(jù)公式(2)計算A21菌株的葉綠素a清除率(A):

    [JZ(]A=(1-Dt/Dc)×100%。[JZ)][JY](2)

    式中,Dt(mg/L)、Dc(mg/L)分別為試驗組、對照組的葉綠素a濃度。

    1.2.6數(shù)據(jù)處理利用Mintab 16、Design-expert 8.0、Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

    2結(jié)果與分析

    2.1碳源及氮源的選擇結(jié)果

    將A21菌株接種于營養(yǎng)肉湯中,于37 ℃下培養(yǎng)12 h,離心去除菌體后與銅綠微囊藻液混合,5 d后溶藻試驗結(jié)果見圖1??梢娖淙茉迥芰^好,經(jīng)計算得到葉綠素a清除率為80.34%。

    [FK(W10][TPLWL1.tif]

    以蛋白胨為氮源選擇不同碳源,其他成分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基一致,試驗結(jié)果見圖2。以蔗糖為碳源選擇不同氮源,其他成分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基一致,試驗結(jié)果見圖3。以蔗糖為碳源時,A21菌株對葉綠素a的清除率最高,為79.21%;以酵母膏為氮源時,A21菌株對葉綠素a的清除率最高,為81.27%。

    2.2Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果

    利用Mintab 16軟件進行Plackett-Burman設(shè)計,對影響

    [TPLWL2.tif]

    A21菌株生長的9個培養(yǎng)基成分進行考察,即蔗糖、酵母膏、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培養(yǎng)基初始pH值。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用Plackett-Burman設(shè)計創(chuàng)建試驗次數(shù)n=20的試驗,對12個因素(9個實際因素、3個虛擬因素)進行考察。每個因素取高水平和低水平2個水平,以葉綠素a清除率(%)為響應(yīng)值,試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2。利用Mintab 16軟件對試驗結(jié)果進行分析(表3、圖4),可見培養(yǎng)基中蔗糖、酵母膏、磷酸鉀、初始pH

    [TPLWL3.tif]

    值對菌株A21的溶藻效果影響顯著(P<0.05)。R2為9433%,R2(預(yù)測)為95.34%,表明該結(jié)果的可信度較高。

    2.3響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

    在PB試驗設(shè)計的基礎(chǔ)上確定4個主要影響因素,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理,利用Design-Export 8.0軟件對蔗糖、酵母膏、磷酸鉀、初始pH值進行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗,試驗設(shè)計與結(jié)果見表4、表5。

    該響應(yīng)面試驗設(shè)置4個中心點,共有29個處理,重復(fù)3次以評估試驗誤差。采用Design-Export 8.0數(shù)據(jù)處理軟件

    對表6中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,以葉綠素a清除率(Y,%)為因變量,以蔗糖(X1,g)、酵母膏(X2,g)、磷酸鉀(X3,g)、[JP2]初始pH值(X4)為自變量建立回歸方程。根據(jù)表6中各因素的P值去除回歸方程中影響不顯著的因子,對二次回歸方程進行優(yōu)化得到回歸方程:Y=80.485 2+0.572 5X1+2.096 7X2-2.245X3+0.412 5X4+1.22X1X2-1.302 5X1X3+2.47X2X3+1.315X2X4-1.667 5X3X4-5.839 75X12-2753 5X22。

    由表6、表7可知,A21菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化回歸模型的P值<0.000 1,失擬的P值為0.508 1,表明回歸模型高度顯著(P<0.05),失擬檢驗不顯著(P>0.05)。桑葉黃A21菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化回歸模型的校正確定系數(shù)R2為0.948 6,表明模型能解釋約94.86%響應(yīng)值的變化,僅有5.14%的總變異不能用該模型解釋。確定系數(shù)R2為0.974 3,表明模型擬合程度良好、試驗誤差小,該回歸模型可用來分析和預(yù)測A21菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化的情況。

    響應(yīng)面3D圖和等高線(圖5)可直觀反映各因素間的交互作用及其強弱[14-15]。

    2.4最佳培養(yǎng)基配方與驗證試驗

    采用Design-Expert V8.0.6軟件預(yù)測A21菌株的最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖6.475 g/L、酵母膏13.025 g/L、磷酸鉀 0.5 g/L、pH值8.2,此時A21菌株培養(yǎng)液的葉綠素a清除效率為85153 4%。根據(jù)實際情況進行調(diào)整,最佳試驗配方為蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。進行多次驗證試驗,菌株A21培養(yǎng)液的葉綠素a清除效率為84.5%,相對誤差為07%。通過對培養(yǎng)基成分的優(yōu)化,菌株A21的葉綠素a清除效率提高了518%。

    3結(jié)論

    菌株A21是一株高效、安全的溶藻細菌,細菌中的某些代謝產(chǎn)物可促使藻細胞死亡。為進一步提高菌株A21的溶藻能力,通過碳源和氮源的單因素選擇試驗、PB試驗設(shè)計、響應(yīng)面試驗設(shè)計對菌株A21的培養(yǎng)基成分和配比進行研究,得到該菌株的最佳培養(yǎng)基配方,其葉綠素a清除效率由8034%提高至84.50%。[CM(21*2/3]本研究結(jié)果為菌株A21及其發(fā)酵產(chǎn)物在藍藻“水華”治理中的應(yīng)用提供依據(jù)。

    參考文獻:

    [1]Ding L,Wu J Q,Pang Y,et al. Simulation study on algal dynamics based on ecological flume experiment in Taihu Lake,China[J]. Ecological Engineering,2007,31(3):200-206.

    [2]李娟英,曹宏宇,崔昱,等. 太湖流域主要水系水環(huán)境特征分析與富營養(yǎng)化評價[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志,2012,33(4):7-13.

    [3]錢益春,何平.1998—2006年太湖水質(zhì)變化分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,31(2):370-374.

    [4]Chen Y,Qin B,Teubner K,et al. Long-term dynamics of phytoplankton assemblages:Microcystis domination in Lake Taihu,a large shallow lake in China[J]. Journal of Plankton Research,2003,25(4):445-453.

    [5]陳水勇,吳振明,俞偉波,等. 水體富營養(yǎng)化的形成、危害和防治[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù),1999,2(2):12-16.

    [6]孔繁翔,高光. 大型淺水富營養(yǎng)化湖泊中藍藻水華形成機理的思考[J]. 生態(tài)學(xué)報,2005,25(3):589-595.

    [7]Imamura N,Motoike I,Shimada N,et al. An efficient screening approach for anti-Microcystis compounds based on knowledge of aquatic microbial ecosystem[J]. Journal of Antibiotics,2001,54(7):582-587.

    [8]van Hannen E J,Zwart G,van Agterveld M P,et al. Changes in bacterial and eukaryotic community structure after mass lysis of filamentous cyanobacteria associated with viruses[J]. Applied and Environmental Microbiology,1999,65(2):795-801.

    [9]趙傳鵬. 環(huán)境溶藻細菌的檢測與評價[D]. 南京:東南大學(xué),2005.

    [10]倪兆林,申元英. 溶藻類細菌的研究現(xiàn)狀[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2013,13(15):2997-3000.

    [11]Shao J H,Li R H,Joe E L,et al. Potential for control of harmful cyanobacterial blooms using biologically derived substances:problems and prospects[J]. Journal of Environmental Management,2013,125(1):149-155.

    [12]Hu X,Liu Y G,Zeng G M,et al. Effects of limonene stress on the growth of and microcystin release by the fr-eshwater cyanobacterium Microcystis aeruginosa FACHB-905[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2014,105(1):121-127.

    [13]安鑫龍,李豫紅,趙艷珍,等. 溶藻微生物的研究方法[J]. 水利漁業(yè),2005,25(2):17-18.

    [14]周得慶,徐士菊. 微生物學(xué)[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007:134-142.

    [15]Tahmouzi S. Optimization of polysaccharides from Zagros oak leaf using RSM:antioxidant and antimicrobial activities[J]. Carbohydrate polymers,2014,106:238-246.

    [16]姜紹通,汪洪普,潘麗軍. 響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取芋頭多糖工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(3):215-219.

    猜你喜歡
    響應(yīng)面分析藍藻培養(yǎng)基
    南美白對蝦養(yǎng)殖池塘藍藻水華處理舉措
    針對八月高溫藍藻爆發(fā)的有效處理方案
    多隨機變量下的架空直立式碼頭樁基可靠度分析
    水運管理(2016年8期)2016-11-05 11:38:59
    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    響應(yīng)面微波輔助提取金花茶花多糖工藝研究
    各種培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個事項
    超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮工藝的優(yōu)化
    水楊酸浸種對NaCl脅迫下黍稷種子萌發(fā)時α—淀粉酶活性的影響
    KBM581培養(yǎng)基:人T細胞誘導(dǎo)與擴增培養(yǎng)基應(yīng)用指南
    可怕的藍藻
    国产成人精品无人区| 亚洲国产av新网站| 黄片无遮挡物在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 只有这里有精品99| 七月丁香在线播放| 欧美精品国产亚洲| 多毛熟女@视频| 国产精品人妻久久久影院| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品一区二区性色av| 国产探花极品一区二区| av专区在线播放| 日本91视频免费播放| 丝瓜视频免费看黄片| 中文字幕制服av| 人妻系列 视频| 在线 av 中文字幕| 在线 av 中文字幕| 51国产日韩欧美| 精品国产乱码久久久久久小说| 人妻一区二区av| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品一区二区三区视频在线| av专区在线播放| 国产免费一级a男人的天堂| 最黄视频免费看| 亚洲av男天堂| 免费黄频网站在线观看国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 下体分泌物呈黄色| 一级毛片我不卡| 亚洲国产最新在线播放| 91在线精品国自产拍蜜月| 人人澡人人妻人| 人人澡人人妻人| 视频中文字幕在线观看| 国产综合精华液| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久99精品国语久久久| 国产熟女午夜一区二区三区 | 91久久精品电影网| 多毛熟女@视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩电影二区| 2022亚洲国产成人精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产极品天堂在线| 国产老妇伦熟女老妇高清| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 在线观看免费视频网站a站| 国产成人精品久久久久久| 一本色道久久久久久精品综合| 久久97久久精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 不卡视频在线观看欧美| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 天美传媒精品一区二区| 国产爽快片一区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 欧美区成人在线视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 只有这里有精品99| 午夜福利,免费看| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产综合精华液| 亚洲人与动物交配视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产欧美亚洲国产| 精华霜和精华液先用哪个| 丰满乱子伦码专区| 日韩免费高清中文字幕av| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 日韩视频在线欧美| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日韩av不卡免费在线播放| av免费在线看不卡| 国产黄片视频在线免费观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 伊人久久国产一区二区| av视频免费观看在线观看| 亚洲成人av在线免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲欧美清纯卡通| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品无大码| 最近中文字幕高清免费大全6| 日本黄色片子视频| 国产精品一区二区在线观看99| 搡女人真爽免费视频火全软件| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲不卡免费看| 国产男女超爽视频在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 免费看光身美女| 国产亚洲5aaaaa淫片| 午夜激情久久久久久久| 99国产精品免费福利视频| 波野结衣二区三区在线| 美女大奶头黄色视频| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品久久久久久精品古装| 51国产日韩欧美| 国产精品伦人一区二区| 亚洲成人一二三区av| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲中文av在线| 国产有黄有色有爽视频| 成人美女网站在线观看视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产91av在线免费观看| 日韩视频在线欧美| 看免费成人av毛片| 成年人免费黄色播放视频 | 高清午夜精品一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 2022亚洲国产成人精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本与韩国留学比较| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲色图综合在线观看| 丝袜喷水一区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一级毛片久久久久久久久女| 中文在线观看免费www的网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产成人91sexporn| 热99国产精品久久久久久7| 秋霞伦理黄片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲三级黄色毛片| 国产一区二区三区av在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲图色成人| 日本黄大片高清| 欧美另类一区| 久久精品国产a三级三级三级| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲欧美清纯卡通| 尾随美女入室| 最近最新中文字幕免费大全7| 婷婷色综合www| 亚洲丝袜综合中文字幕| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲va在线va天堂va国产| av视频免费观看在线观看| 69精品国产乱码久久久| 乱系列少妇在线播放| 久久久久久久久久成人| 各种免费的搞黄视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产一区二区在线观看av| 日韩亚洲欧美综合| 久久久久国产网址| 久久久久视频综合| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产探花极品一区二区| 日日撸夜夜添| 午夜激情福利司机影院| 国产成人freesex在线| 一本色道久久久久久精品综合| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩一区二区视频免费看| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲综合精品二区| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品免费大片| 亚洲av在线观看美女高潮| av网站免费在线观看视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产成人精品一,二区| 亚洲天堂av无毛| 亚洲色图综合在线观看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 99热全是精品| 熟女电影av网| 在线观看人妻少妇| 永久免费av网站大全| 久久婷婷青草| 精品酒店卫生间| 97超视频在线观看视频| 另类精品久久| 交换朋友夫妻互换小说| 六月丁香七月| 亚洲久久久国产精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 蜜桃在线观看..| 日本vs欧美在线观看视频 | 日韩av不卡免费在线播放| 91久久精品国产一区二区成人| 精品人妻一区二区三区麻豆| 最黄视频免费看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 最近中文字幕2019免费版| 伦理电影免费视频| 国产成人精品福利久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一区二区三区乱码不卡18| av国产久精品久网站免费入址| 99久久综合免费| 亚洲av综合色区一区| 久久久久国产网址| 欧美国产精品一级二级三级 | 高清黄色对白视频在线免费看 | 久久久国产精品麻豆| 欧美国产精品一级二级三级 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久国产精品大桥未久av | 欧美高清成人免费视频www| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲成人一二三区av| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久97久久精品| 99久久精品一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一边亲一边摸免费视频| 色视频www国产| 中文字幕人妻丝袜制服| av卡一久久| 亚洲人成网站在线观看播放| xxx大片免费视频| 国产爽快片一区二区三区| 午夜日本视频在线| 99久国产av精品国产电影| 亚洲性久久影院| 在线观看三级黄色| 久久久久久久久久久丰满| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品久久久久成人av| 内射极品少妇av片p| 国产亚洲欧美精品永久| 精品亚洲成a人片在线观看| 街头女战士在线观看网站| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美另类一区| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲性久久影院| 久久久国产一区二区| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美精品专区久久| 久久精品夜色国产| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 性色avwww在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲国产精品999| 亚洲av福利一区| 成年人午夜在线观看视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 99热国产这里只有精品6| 欧美精品亚洲一区二区| 国产成人精品久久久久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 97超碰精品成人国产| 黑人高潮一二区| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美日韩av久久| 欧美日韩综合久久久久久| 久久青草综合色| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 天堂俺去俺来也www色官网| 日韩欧美 国产精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成人免费观看视频高清| 日日爽夜夜爽网站| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 99久国产av精品国产电影| 黄色欧美视频在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 成人漫画全彩无遮挡| 国产亚洲一区二区精品| 欧美激情极品国产一区二区三区 | av视频免费观看在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 简卡轻食公司| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 一级毛片我不卡| 中文字幕久久专区| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 男人添女人高潮全过程视频| 国产极品天堂在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 美女视频免费永久观看网站| 国产欧美亚洲国产| 99热国产这里只有精品6| 免费观看无遮挡的男女| 极品少妇高潮喷水抽搐| 在线看a的网站| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品一二三区在线看| 亚洲国产精品999| 国产黄频视频在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品乱久久久久久| 韩国av在线不卡| 国产男女超爽视频在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美日韩av久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久久久久久久丰满| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 亚洲国产精品国产精品| 久久久久久伊人网av| 国产爽快片一区二区三区| 69精品国产乱码久久久| 久久久久久久国产电影| 久久国产乱子免费精品| 免费看av在线观看网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲av在线观看美女高潮| 国产亚洲5aaaaa淫片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品一区二区三卡| 日韩欧美 国产精品| 国产精品女同一区二区软件| 免费看日本二区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国内精品宾馆在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲精品视频女| 最近2019中文字幕mv第一页| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产视频内射| 街头女战士在线观看网站| 欧美丝袜亚洲另类| 一区在线观看完整版| 国产69精品久久久久777片| freevideosex欧美| 久久久久国产精品人妻一区二区| 一级,二级,三级黄色视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久网色| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美日韩av久久| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产黄色视频一区二区在线观看| a级毛片在线看网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 男的添女的下面高潮视频| 国产片特级美女逼逼视频| 日本黄大片高清| 男人爽女人下面视频在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 大香蕉97超碰在线| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品久久久久久久久免| 国产伦精品一区二区三区视频9| 男人狂女人下面高潮的视频| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲图色成人| 五月玫瑰六月丁香| 赤兔流量卡办理| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久鲁丝午夜福利片| 在线观看免费高清a一片| 波野结衣二区三区在线| 精品久久久精品久久久| 日韩欧美 国产精品| 少妇 在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品伦人一区二区| 99久久精品热视频| tube8黄色片| xxx大片免费视频| h视频一区二区三区| 国产精品三级大全| 高清视频免费观看一区二区| 在线观看免费高清a一片| 黑丝袜美女国产一区| 高清欧美精品videossex| 人妻夜夜爽99麻豆av| 51国产日韩欧美| 一区二区三区精品91| 欧美丝袜亚洲另类| 草草在线视频免费看| 国产乱人偷精品视频| 黑人高潮一二区| 午夜免费观看性视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 大香蕉久久网| 亚洲va在线va天堂va国产| 三级国产精品欧美在线观看| 免费在线观看成人毛片| 日本与韩国留学比较| 亚洲av不卡在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产男女内射视频| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品第二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲伊人久久精品综合| 黄色欧美视频在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲经典国产精华液单| 男人舔奶头视频| 国产日韩欧美视频二区| 精品久久久久久久久亚洲| 老熟女久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 九色成人免费人妻av| 免费看不卡的av| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 国产在视频线精品| 亚洲一区二区三区欧美精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 99久久精品热视频| 精品视频人人做人人爽| 丰满迷人的少妇在线观看| 大香蕉久久网| 一本一本综合久久| 亚洲精品,欧美精品| 99热这里只有精品一区| 五月玫瑰六月丁香| 尾随美女入室| 久久韩国三级中文字幕| 国产成人精品久久久久久| 秋霞在线观看毛片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| videos熟女内射| 国产精品三级大全| 国产在线视频一区二区| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲人成网站在线播| 色吧在线观看| 人人妻人人看人人澡| 日日爽夜夜爽网站| 在线看a的网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品视频女| 国产成人aa在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 中文字幕免费在线视频6| 五月伊人婷婷丁香| 纯流量卡能插随身wifi吗| 草草在线视频免费看| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 欧美日韩在线观看h| 九九爱精品视频在线观看| 亚州av有码| 亚洲精华国产精华液的使用体验| av国产精品久久久久影院| 免费观看av网站的网址| 久久99热6这里只有精品| 亚洲美女视频黄频| 久久久精品免费免费高清| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲av二区三区四区| 亚洲av免费高清在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲国产精品国产精品| 91久久精品国产一区二区三区| 久久亚洲国产成人精品v| 91精品伊人久久大香线蕉| 边亲边吃奶的免费视频| 如何舔出高潮| 五月玫瑰六月丁香| 国产中年淑女户外野战色| 免费观看av网站的网址| 一本久久精品| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久 成人 亚洲| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成人免费无遮挡视频| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久精品94久久精品| 秋霞伦理黄片| 精品久久国产蜜桃| 欧美97在线视频| 国产成人精品婷婷| 精品一区二区三卡| 少妇的逼好多水| 午夜免费观看性视频| 午夜久久久在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 中文字幕制服av| 一区二区av电影网| 丝瓜视频免费看黄片| 视频区图区小说| 自线自在国产av| 日日撸夜夜添| 亚洲精品一二三| 丰满少妇做爰视频| 亚洲真实伦在线观看| 91成人精品电影| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 欧美高清成人免费视频www| 嫩草影院入口| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 丝瓜视频免费看黄片| 激情五月婷婷亚洲| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品一区二区三区视频在线| 26uuu在线亚洲综合色| 秋霞伦理黄片| 国产免费一区二区三区四区乱码| a级毛片在线看网站| 乱人伦中国视频| 国产精品一区二区在线不卡| 全区人妻精品视频| 亚洲成人一二三区av| 在线观看三级黄色| 精品酒店卫生间| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人91sexporn| 久久av网站| 五月开心婷婷网| 成年人午夜在线观看视频| 国产一区二区在线观看日韩| 人妻 亚洲 视频| 99九九在线精品视频 | 免费黄网站久久成人精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 美女内射精品一级片tv| 这个男人来自地球电影免费观看 | 99视频精品全部免费 在线| 99热全是精品| 亚洲精品色激情综合| 国产欧美亚洲国产| 51国产日韩欧美| 日日撸夜夜添| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美高清成人免费视频www| 午夜老司机福利剧场| 亚洲欧美精品专区久久| 美女中出高潮动态图| 99久久综合免费| 国产精品福利在线免费观看| 精品一区二区三卡| 热re99久久国产66热| 久久久午夜欧美精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站 | 亚洲av不卡在线观看| 久久久精品94久久精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产男女内射视频| 大陆偷拍与自拍| 国产精品久久久久久久久免| 免费av中文字幕在线| 插逼视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 国国产精品蜜臀av免费| 九九在线视频观看精品| 另类精品久久| 国国产精品蜜臀av免费| 全区人妻精品视频| 午夜精品国产一区二区电影| 成人特级av手机在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 日本与韩国留学比较| 久久狼人影院| 最后的刺客免费高清国语| 美女主播在线视频| 国产成人午夜福利电影在线观看|