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    基于溶藻效果的溶藻細菌A21培養(yǎng)基成分優(yōu)化

    2017-04-05 18:19:40李文利傅以鋼劉征宇章忠輝
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年12期
    關(guān)鍵詞:響應(yīng)面分析藍藻培養(yǎng)基

    李文利++傅以鋼++劉征宇++章忠輝++陸雅雅

    摘要:藍藻“水華”的暴發(fā)對人體健康、水產(chǎn)養(yǎng)殖等造成了嚴重影響,微生物法是一種安全、有效的水華防治方法。通過碳源及氮源的單因素試驗、Plackett-Burman試驗設(shè)計、響應(yīng)面試驗分析對A21菌株的培養(yǎng)基進行優(yōu)化,最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。該培養(yǎng)基使A21菌株對銅綠微囊藻的葉綠素a(葉綠素a)清除效率提高了5.18%。

    關(guān)鍵詞:藍藻;溶藻細菌;培養(yǎng)基;優(yōu)化;Plackett-Burman試驗;響應(yīng)面分析

    中圖分類號: S182文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2016)12-0516-05

    收稿日期:2015-04-08

    基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:21277101);上海海洋大學(xué)橫向課題(編號:D-8006-13-0117)。

    作者簡介:李文利(1988—),女,江蘇徐州人,碩士,主要從事食品微生物研究。E-mail:1067349333@qq.com。

    通信作者:李曉暉,博士,副教授,主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail:xhli@shou.edu.cn。

    人為因素導(dǎo)致太湖水體富營養(yǎng)化進程加速,于2007年暴發(fā)了大規(guī)模“水華”,給當(dāng)?shù)鼐用駧砹丝只臶1]。近年來的監(jiān)測結(jié)果顯示,60%太湖水域的營養(yǎng)化水平處于中度污染以上,東萊水系等甚至達到重度污染,其余水域均為輕度污染[2-4]。微囊藻是太湖藍藻“水華”的優(yōu)勢藻類,銅綠微囊藻(Microcstis aeruginosa)是其代表藻株,其細胞內(nèi)含有多種色素蛋白,生長速度極快,并產(chǎn)生對人體有害的微囊藻毒素[5-6]。水體富營養(yǎng)化水平持續(xù)偏高帶來的“水華”現(xiàn)象令人堪憂,尋求一種高效、環(huán)保的抑藻物質(zhì)迫在眉睫。

    從“水華”暴發(fā)水體中分離安全、有效的溶藻細菌是一種有效的防治手段和途徑,為水污染治理提供了新的研究思路[7-9]。現(xiàn)已報道多株分離自太湖水域的溶藻細菌,為抑制藍藻“水華”現(xiàn)象提供了良好基礎(chǔ),但大多處于分離鑒定階段,對于抑藻物質(zhì)制備成本高、生物活性低且不穩(wěn)定、二次污染等生物安全性問題尚有待進一步研究,以期實現(xiàn)溶藻微生物在治理“水華”中的應(yīng)用[10]。

    本研究通過優(yōu)化溶藻菌株A21的培養(yǎng)基成分,提高對M. aeruginosa 905生物量的清除率。在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行Plackett-Burman(PB)設(shè)計,選擇出溶藻菌株A21溶藻效果的主要影響成分;根據(jù)PB試驗結(jié)果進行響應(yīng)面試驗設(shè)計(response surface methodology,RSM),建立預(yù)估模型,得到估算的最佳培養(yǎng)基配方;根據(jù)實際情況進行調(diào)整,得到溶藻菌株A21的最佳培養(yǎng)基配方。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1藻種和菌種

    銅綠微囊藻905(M. aeruginosa 905)購自中國科學(xué)院水生生物種質(zhì)庫淡水藻種庫,轉(zhuǎn)接至新鮮的BG11培養(yǎng)基中,于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h條件下培養(yǎng)[11]。溶藻菌株A21由筆者所在實驗室利用原位取樣法[12]從太湖暴發(fā)藍藻“水華”的水域分離得到,經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬。

    1.1.2主要試劑

    溶藻菌株A21的基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分為碳源5 g/L、氮源10 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L,采用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至70。營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯用于A21菌株的活化和培養(yǎng);魯格氏碘液用于藻細胞固定;丙酮用于銅綠微囊藻細胞葉綠素的提取。

    1.1.3主要儀器

    SPX-250PG型智能型光照培養(yǎng)箱(上海天恒醫(yī)療機械有限公司),SQ-UV2300型紫外可見分光光度計(北京宇艾奇電子科技有限公司),CX21型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS 奧林巴斯),藻類計數(shù)框(新科儀器,計數(shù)區(qū) 20 mm×20 mm,100個小格),TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機(湘潭湘儀儀器有限公司)等。

    1.2方法

    1.2.1溶藻試驗

    A21菌株經(jīng)營養(yǎng)瓊脂活化后接種在新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。將菌液以4 000 r/min離心10 min,取0.5 mL上清液與4.5 mL生長對數(shù)期的M. aeruginosa 905藻液進行混合,同時取0.5 mL滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)液與4.5 mL生長對數(shù)期的M. aeruginosa 905藻液混合作為對照組,置于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h條件下培養(yǎng)5 d。

    1.2.2碳源和氮源的單因素選擇

    根據(jù)微生物營養(yǎng)代謝方式的不同,選擇可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、乙酸鈉等為碳源,選擇硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素為氮源。采用不同的碳源、氮源分別培養(yǎng)菌株A21后進行溶藻試驗。

    1.2.3Plackett-Burman設(shè)計變量

    采用Mintab 16軟件進行Plackett-Burman(PB)設(shè)計,對影響A21菌株生長的9個培養(yǎng)基成分進行考察,即碳源、氮源、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培養(yǎng)基初始pH值。每個因素取高水平和低水平2個水平,高水平為低水平的1.5倍。另設(shè)X4、X8、X12為虛擬列,在試驗中為空,以考察試驗誤差。以葉綠素a清除率(%)為響應(yīng)值,設(shè)定3個平行試驗,試驗設(shè)計見表1。

    1.2.4響應(yīng)面試驗設(shè)計在Plackett-Burman試驗的基礎(chǔ)上確定響應(yīng)面分析的因素與水平,采用Box-Behnken中心組合設(shè)計4因素3水平共29個試驗點進行試驗。優(yōu)化A21菌株的培養(yǎng)基成分,并在最佳培養(yǎng)基成分配比下對銅綠微囊藻葉綠素a清除率進行3次平行試驗,證實響應(yīng)面分析法的可靠性。

    1.2.5M. aeruginosa 905生物量指標葉綠素a濃度的測定在超聲條件下使M. aeruginosa 905藻細胞破碎并釋放出葉綠素a,利用丙酮于低溫黑暗條件下萃取12 h后離心,分別于630、647、664、750 nm下測定上清液的吸光度[11-13]。根據(jù)公式(1)計算葉綠素a含量:

    C(mg/L)=11.85(D664 nm- D750 nm)-1.54(D647 nm- D750 nm)-008(D630 nm- D750 nm)。[JY](1)

    式中,D664 nm、D647 nm、D630 nm、D750 nm分別表示波長為664、647、630、750 nm 時提取液的吸光度。

    根據(jù)公式(2)計算A21菌株的葉綠素a清除率(A):

    [JZ(]A=(1-Dt/Dc)×100%。[JZ)][JY](2)

    式中,Dt(mg/L)、Dc(mg/L)分別為試驗組、對照組的葉綠素a濃度。

    1.2.6數(shù)據(jù)處理利用Mintab 16、Design-expert 8.0、Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

    2結(jié)果與分析

    2.1碳源及氮源的選擇結(jié)果

    將A21菌株接種于營養(yǎng)肉湯中,于37 ℃下培養(yǎng)12 h,離心去除菌體后與銅綠微囊藻液混合,5 d后溶藻試驗結(jié)果見圖1??梢娖淙茉迥芰^好,經(jīng)計算得到葉綠素a清除率為80.34%。

    [FK(W10][TPLWL1.tif]

    以蛋白胨為氮源選擇不同碳源,其他成分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基一致,試驗結(jié)果見圖2。以蔗糖為碳源選擇不同氮源,其他成分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基一致,試驗結(jié)果見圖3。以蔗糖為碳源時,A21菌株對葉綠素a的清除率最高,為79.21%;以酵母膏為氮源時,A21菌株對葉綠素a的清除率最高,為81.27%。

    2.2Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果

    利用Mintab 16軟件進行Plackett-Burman設(shè)計,對影響

    [TPLWL2.tif]

    A21菌株生長的9個培養(yǎng)基成分進行考察,即蔗糖、酵母膏、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培養(yǎng)基初始pH值。在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用Plackett-Burman設(shè)計創(chuàng)建試驗次數(shù)n=20的試驗,對12個因素(9個實際因素、3個虛擬因素)進行考察。每個因素取高水平和低水平2個水平,以葉綠素a清除率(%)為響應(yīng)值,試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2。利用Mintab 16軟件對試驗結(jié)果進行分析(表3、圖4),可見培養(yǎng)基中蔗糖、酵母膏、磷酸鉀、初始pH

    [TPLWL3.tif]

    值對菌株A21的溶藻效果影響顯著(P<0.05)。R2為9433%,R2(預(yù)測)為95.34%,表明該結(jié)果的可信度較高。

    2.3響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

    在PB試驗設(shè)計的基礎(chǔ)上確定4個主要影響因素,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理,利用Design-Export 8.0軟件對蔗糖、酵母膏、磷酸鉀、初始pH值進行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗,試驗設(shè)計與結(jié)果見表4、表5。

    該響應(yīng)面試驗設(shè)置4個中心點,共有29個處理,重復(fù)3次以評估試驗誤差。采用Design-Export 8.0數(shù)據(jù)處理軟件

    對表6中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,以葉綠素a清除率(Y,%)為因變量,以蔗糖(X1,g)、酵母膏(X2,g)、磷酸鉀(X3,g)、[JP2]初始pH值(X4)為自變量建立回歸方程。根據(jù)表6中各因素的P值去除回歸方程中影響不顯著的因子,對二次回歸方程進行優(yōu)化得到回歸方程:Y=80.485 2+0.572 5X1+2.096 7X2-2.245X3+0.412 5X4+1.22X1X2-1.302 5X1X3+2.47X2X3+1.315X2X4-1.667 5X3X4-5.839 75X12-2753 5X22。

    由表6、表7可知,A21菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化回歸模型的P值<0.000 1,失擬的P值為0.508 1,表明回歸模型高度顯著(P<0.05),失擬檢驗不顯著(P>0.05)。桑葉黃A21菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化回歸模型的校正確定系數(shù)R2為0.948 6,表明模型能解釋約94.86%響應(yīng)值的變化,僅有5.14%的總變異不能用該模型解釋。確定系數(shù)R2為0.974 3,表明模型擬合程度良好、試驗誤差小,該回歸模型可用來分析和預(yù)測A21菌株培養(yǎng)基成分優(yōu)化的情況。

    響應(yīng)面3D圖和等高線(圖5)可直觀反映各因素間的交互作用及其強弱[14-15]。

    2.4最佳培養(yǎng)基配方與驗證試驗

    采用Design-Expert V8.0.6軟件預(yù)測A21菌株的最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖6.475 g/L、酵母膏13.025 g/L、磷酸鉀 0.5 g/L、pH值8.2,此時A21菌株培養(yǎng)液的葉綠素a清除效率為85153 4%。根據(jù)實際情況進行調(diào)整,最佳試驗配方為蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。進行多次驗證試驗,菌株A21培養(yǎng)液的葉綠素a清除效率為84.5%,相對誤差為07%。通過對培養(yǎng)基成分的優(yōu)化,菌株A21的葉綠素a清除效率提高了518%。

    3結(jié)論

    菌株A21是一株高效、安全的溶藻細菌,細菌中的某些代謝產(chǎn)物可促使藻細胞死亡。為進一步提高菌株A21的溶藻能力,通過碳源和氮源的單因素選擇試驗、PB試驗設(shè)計、響應(yīng)面試驗設(shè)計對菌株A21的培養(yǎng)基成分和配比進行研究,得到該菌株的最佳培養(yǎng)基配方,其葉綠素a清除效率由8034%提高至84.50%。[CM(21*2/3]本研究結(jié)果為菌株A21及其發(fā)酵產(chǎn)物在藍藻“水華”治理中的應(yīng)用提供依據(jù)。

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