溶菌酶觸發(fā)的芽孢桿菌芽孢萌發(fā)及其異質(zhì)性研究*

王桂文，張鵬飛，王曉春，陳歡君，Peter Setlow，Li Yongqing

(1.廣西科學(xué)院，廣西南寧　530007;2.東卡羅來納大學(xué)物理系，美國北卡羅來納州格林維爾市，NC 27858;3.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧　530004;4.康涅狄格大學(xué)健康中心分子、微生物與結(jié)構(gòu)生物學(xué)系，美國康涅狄格州法明頓，CT 06030)

溶菌酶觸發(fā)的芽孢桿菌芽孢萌發(fā)及其異質(zhì)性研究*

王桂文1**，張鵬飛2，王曉春1，陳歡君3，Peter Setlow4，Li Yongqing2

(1.廣西科學(xué)院，廣西南寧530007;2.東卡羅來納大學(xué)物理系，美國北卡羅來納州格林維爾市，NC 27858;3.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004;4.康涅狄格大學(xué)健康中心分子、微生物與結(jié)構(gòu)生物學(xué)系，美國康涅狄格州法明頓，CT 06030)

摘要：【目的】了解溶菌酶觸發(fā)芽孢桿菌孢子萌發(fā)的異質(zhì)性及其機制，為認(rèn)識芽孢(Spore)萌發(fā)機制和殺滅芽孢提供參考?！痉椒ā繎?yīng)用拉曼光譜和微分干涉差(DIC)顯微鏡成像技術(shù)高通量分析大量單個Bacillus subtilis(Bs)和B.megaterium(Bm)芽孢經(jīng)溶菌酶觸發(fā)的萌發(fā)動態(tài)?！窘Y(jié)果】溶菌酶濃度和溫度越高，芽孢萌發(fā)越快，孢內(nèi)CaDPA開始快速釋放時間(Tlag)、快速釋放所需時間(ΔTrelease)和芽孢皮層水解所需時間(ΔTlys)越短；低于20℃，Bs芽孢萌發(fā)的ΔTrelease值是25℃時的4倍以上。SpoVA蛋白高表達(dá)菌株的ΔTrelease值和普通菌株基本相同，而缺少皮層水解酶的菌株ΔTrelease值高于普通菌株。95℃處理15 min的孢子，其Tlag、ΔTrelease和ΔTlys值是對照的2倍以上。Bs芽孢萌發(fā)的異質(zhì)性明顯，不僅表現(xiàn)在芽孢間，也表現(xiàn)在菌株間。Bm芽孢對溶菌酶更敏感，芽孢間的異質(zhì)性顯著低于Bs?！窘Y(jié)論】溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)在物種、菌株和單細(xì)胞層面都存在顯著的異質(zhì)性;溶菌酶濃度和溫度對芽孢萌發(fā)有重大影響;皮層水解酶也可能參與溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)進(jìn)程。

關(guān)鍵詞：拉曼光譜微分干涉差成像芽孢桿菌芽孢萌發(fā)溶菌酶單細(xì)胞分析

0引言

【研究意義】部分桿菌屬細(xì)菌會通過在細(xì)胞內(nèi)形成休眠體芽孢(Spore)的方式來應(yīng)對環(huán)境脅迫。由于富含2，6-吡啶二羧酸(Dipicolinic acid，DPA)與鈣離子(Ca2+)的絡(luò)合物CaDPA，且含水量極低，芽孢對逆境有極強的抵抗能力[1-3]。芽孢的休眠期可以很長，但對外界環(huán)境卻極其敏感，只要一感受到適宜的條件就開始萌發(fā)，恢復(fù)到營養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)。而一旦萌發(fā)，芽孢就喪失原有的抵抗力，這是殺滅芽孢類細(xì)菌的好時機[4]。因此，了解芽孢萌發(fā)機理和規(guī)律，對抑制其致病性、維護(hù)人類健康及生命安全具有極其重要的理論意義與應(yīng)用價值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已知的芽孢萌發(fā)機制是營養(yǎng)性萌發(fā)劑(Germinants)與芽孢內(nèi)膜上的受體蛋白結(jié)合，觸發(fā)芽孢啟動系列萌發(fā)事件[5-6]。除營養(yǎng)性萌發(fā)劑以外，溶菌酶、鹽類、高壓、CaDPA和陽離子表面活性劑(如月桂胺Dodecylamine)等其它非營養(yǎng)性化學(xué)試劑或物理因素，也可以觸發(fā)芽孢萌發(fā)[6-8]。其中，溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)是比較特殊的非營養(yǎng)萌發(fā)方式。已有研究顯示，溶菌酶通過水解芽孢的肽聚糖皮層引起孢內(nèi)CaDPA釋放進(jìn)而完成芽孢萌發(fā)[6]。但芽孢衣對芽孢有保護(hù)作用，溶菌酶無法越過這道屏障水解芽孢皮層，因而對溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)研究較少，所研究的對象主要是食品工業(yè)上的污染菌[9-11]，對芽孢桿菌屬芽孢的研究極少[12]。芽孢的萌發(fā)機制已有大量報道[5-6,13-14]，創(chuàng)新的技術(shù)方法在該領(lǐng)域的應(yīng)用加速其研究進(jìn)程，特別是近年來拉曼光譜、微分干涉差(DIC)顯微術(shù)、熒光成像和拉曼成像等技術(shù)并結(jié)合單細(xì)胞分析在芽孢萌發(fā)研究中的應(yīng)用與發(fā)展，對認(rèn)識芽孢萌發(fā)機理及其異質(zhì)性發(fā)揮極其重要的作用[15]，并大大地拓展了研究對象[16-18]。另外，細(xì)菌芽孢經(jīng)營養(yǎng)萌發(fā)劑觸發(fā)的萌發(fā)存在顯著的異質(zhì)性，即在相同的萌發(fā)條件下，有的芽孢萌發(fā)極快，有的芽孢萌發(fā)則可能需要幾小時甚至幾天時間[14,16-18]。而單細(xì)胞分析顯示，芽孢間的萌發(fā)差異主要體現(xiàn)在芽孢接受外源萌發(fā)劑刺激到孢內(nèi)DPA開始釋放的時間(Tlag)，而胞內(nèi)DPA大量釋放階段則具有較強的同質(zhì)性[19]?！颈狙芯壳腥朦c】對芽孢萌發(fā)的異質(zhì)性研究已經(jīng)有不少報道[7,19-21]，但是對溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)異質(zhì)性研究還未見報道，因此本文從該方面入手研究芽孢萌發(fā)的異質(zhì)性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用拉曼光譜與DIC成像技術(shù)，從單細(xì)胞水平上分析溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)方式，了解細(xì)菌芽孢的非營養(yǎng)萌發(fā)規(guī)律、機制及其異質(zhì)性。

1材料與方法

1.1菌株

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，Bs)，巨大芽孢桿菌(B.megaterium，Bm)，相關(guān)菌株信息見表1。

1.2芽孢制備

Bm芽孢的培養(yǎng)方法[22]：菌株接入LB固體培養(yǎng)基，30℃條件下活化24～36 h。挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，200 r/min，過夜培養(yǎng)；按1%(V/V) 的比例轉(zhuǎn)入產(chǎn)孢培養(yǎng)基(CCY)，30℃，200 r/min培養(yǎng)48～60 h，鏡檢芽孢率達(dá)到99%后收集孢子。

Bs芽孢的培養(yǎng)方法：活化的菌株涂板在無抗生素的2×SG培養(yǎng)基瓊脂平板，37℃條件下培養(yǎng)2～3 d，轉(zhuǎn)到23℃下再培養(yǎng)數(shù)天[23]。用無菌水洗取菌苔，用于收集孢子。

芽孢收集：5 000 r/min離心收集、純化芽孢，無菌水洗滌10次，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

芽孢采用脫衣液70℃處理30 min去掉芽孢衣，無菌水洗10次。脫衣液組成為0.1 mol/L NaOH，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L二硫蘇糖醇，1%(W/V)十二烷基硫酸鈉[29]。

表1實驗所用菌株及其性質(zhì)

Table 1Strains used and their properties

1.3芽孢萌發(fā)

芽孢基本萌發(fā)溫度為25℃，在不同溫度試驗中選擇16℃、20℃和25℃。將待分析的芽孢用無菌水稀釋成每毫升芽孢液約含108個芽孢，吸取2 μL滴加在蓋玻片上，真空干燥，將蓋玻片固定在自制的恒溫平臺上。滴加預(yù)先恒溫到實驗所需溫度的溶菌酶溶液。溶菌酶溶液濃度在不同濃度試驗中選擇1.00 μg/mL,2.50 μg/mL，3.75 μg/mL,5.00 μg/mL以及10.00 μg/mL。

1.4芽孢萌發(fā)監(jiān)測

1.4.1拉曼光譜監(jiān)測

應(yīng)用單細(xì)胞激光拉曼光譜系統(tǒng)聚焦在單個芽孢上采集拉曼光譜[21]。激光功率為5 mW，連續(xù)采集拉曼光譜直到芽孢萌發(fā)后15～30 min，積分時間為15 s。

1.4.2微分干涉差(DIC)顯微術(shù)監(jiān)測

采用與文獻(xiàn)[21]類似的DIC顯微術(shù)監(jiān)測大量單個芽孢的萌發(fā)動態(tài)，具體實驗系統(tǒng)參見文獻(xiàn)[30]。芽孢的核心是一個CaDPA的巨型倉庫并且水的含量非常少，折射率高，DIC顯微鏡將其轉(zhuǎn)換成一個振幅圖像，可通過CCD將其記錄下來。在萌發(fā)過程中，芽孢內(nèi)部主要的大分子物質(zhì)CaDPA大量釋放并與周圍水分子進(jìn)行置換，使得折射率發(fā)生改變[31]。

將倒置DIC顯微鏡加以改造，并接入高性能CCD，實現(xiàn)同步輸出芽孢萌發(fā)監(jiān)測過程的拉曼光譜和DIC圖像。通過自編VC程序，根據(jù)實驗需要，每6 s采集一幅DIC圖像。圖像處理：用Matlab軟件編寫程序，識別芽孢圖像，以單個芽孢為中心，讀取芽孢范圍內(nèi)20個象素位點的灰度值，作為芽孢圖像信號積分，依時間函數(shù)繪制成芽孢萌發(fā)過程的實時DIC信號強度變化曲線。通過統(tǒng)計不同時間段的芽孢萌發(fā)數(shù)來計算芽孢的群體萌發(fā)率。

芽孢的萌發(fā)監(jiān)測時間一般為60～90 min，部分芽孢的萌發(fā)監(jiān)測時間根據(jù)萌發(fā)進(jìn)展有所調(diào)整。本文相關(guān)數(shù)據(jù)分析和討論均限于實驗監(jiān)測的時間范圍內(nèi)。

本實驗設(shè)定芽孢與溶菌酶開始接觸的時間為0，孢內(nèi)CaDPA開始快速釋放的時間為遲滯時間Tlag，CaDPA釋放完畢的時間為Trelease，芽孢皮層完全溶解的時間為Tlys。定義CaDPA釋放需要的時間為△Trelease=Trelease-Tlag、皮層溶解所需時間為△Tlys=Tlys-Trelease。其中Tlag值反映的是芽孢啟動萌發(fā)的速度，△Trelease和△Tlys值分別反映CaDPA釋放和皮層溶解的快慢，是反映單個芽孢萌發(fā)進(jìn)程的主要參數(shù)。參數(shù)Ilag和Irelease分別是Tlag和Trelease時芽孢的DIC亮度值(以0 min時的亮度為1，芽孢萌發(fā)后實驗記錄終點的亮度為0)，前者間接反映Tlag時芽孢的CaDPA含量，后者間接反映Tlys時芽孢皮層的水解程度和芽孢的吸水程度。

2結(jié)果與分析

2.1溶菌酶濃度對芽孢萌發(fā)的影響

在較低的溶菌酶濃度下，芽孢需要經(jīng)過一定的時間才開始萌發(fā)。溶菌酶濃度越高，芽孢萌發(fā)的遲滯期越短。在1.00 μg/mL濃度下，90 min觀察期內(nèi)僅有約7%的芽孢萌發(fā)，而在10.00 μg/mL濃度時，98%以上的芽孢在10 min內(nèi)萌發(fā)(圖1a)。讀取單個芽孢的DIC亮度，以時間為函數(shù)，建立單個芽孢的萌發(fā)動態(tài)曲線(圖1b、c)，結(jié)果顯示，芽孢的亮度在芽孢與溶菌酶接觸后緩慢降低，緊接著是快速降低；溶菌酶濃度越高，芽孢的亮度變化越快。

溶菌酶濃度Concentrations of lysozyme：(b)10.00 μg/mL；(c)2.50 μg/mL

圖1Bs芽孢在不同溶菌酶濃度下的群體萌發(fā)曲線(a)及7個不同芽孢的萌發(fā)動態(tài)(b，c)

Fig.1Germination of wild-type B.subtilis spores triggered by 1.00 μg/mL,2.50 μg/mL,3.75 μg/mL and 10.00 μg/mL lysozyme (a) and germination kinetics of 7 individual spores(b,c)

應(yīng)用拉曼光譜對芽孢的溶菌酶萌發(fā)過程進(jìn)行驗證發(fā)現(xiàn)，與營養(yǎng)萌發(fā)類似[24]，溶菌酶觸發(fā)的萌發(fā)動態(tài)是典型的三相態(tài)，DIC圖像亮度變化與孢內(nèi)CaDPA含量變化一致(圖2)，所得結(jié)果與文獻(xiàn)[21，24，30]類似。因此DIC成像分析方法適用于實時監(jiān)測溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)動態(tài)。

圖2a是5個芽孢的CaDPA拉曼光譜特征峰1 017 cm-1的信號強度(反映的是芽孢內(nèi)CaDPA的含量)變化動態(tài)曲線，圖2b是DIC成像同時記錄的同一芽孢的亮度變化。結(jié)果顯示，溶菌酶萌發(fā)過程單個芽孢的DIC圖像亮度與孢內(nèi)CaDPA含量變化對應(yīng)，芽孢的亮度急速降低的過程就是孢內(nèi)CaDPA快速釋放的過程，孢內(nèi)CaDPA完全釋放，1 017 cm-1峰則完全消失；之后DIC圖像亮度隨著芽孢皮層溶解緩慢下降，并逐漸保持基本不變。

萌發(fā)參數(shù)(表2)顯示，溶菌酶濃度越低，芽孢萌發(fā)越慢，孢內(nèi)CaDPA的快速釋放時間(ΔTrelease值)和芽孢皮層水解的時間(ΔTlys值)越長。2.50 μg/mL時的Tlag值分別是3.75 μg/mL、10.00 μg/mL的4倍和20倍左右，ΔTrelease值和ΔTlys值分別是后兩者的2.50倍和1.5～3.0倍左右。當(dāng)溶菌酶濃度達(dá)到1 000 μg/mL時，芽孢幾乎是接觸到溶菌酶溶液就開始水解皮層，并快速釋放CaDPA，而且?guī)缀鯖]有觀察到皮層水解的過程(Tlys)。參數(shù)Ilag顯示，溶菌酶濃度越低，在Tlag前孢內(nèi)已經(jīng)緩慢釋放的CaDPA越多。上述結(jié)果說明高濃度溶菌酶觸發(fā)芽孢快速釋放孢內(nèi)CaDPA并水解芽孢皮層，但當(dāng)溶菌酶的濃度高于3.75 μg/mL時，ΔTrelease值基本相同。

圖2拉曼光譜(a)與DIC成像(b)實時同步監(jiān)測同一芽孢的萌發(fā)過程

Fig.2Simultaneous monitoring of the lysozyme-triggered germination of individual Bacillus spores followed by Raman spectroscopy (a) and DIC microscopy imaging (b)

2.2溫度對芽孢萌發(fā)的影響

如圖3所示，在5.00 μg/mL溶菌酶溶液作用下，溫度降低，PS832芽孢的萌發(fā)速度明顯降低；芽孢在25℃、20℃和16℃下，90 min內(nèi)的萌發(fā)率依次是99.9%、96.2%和86.7%。萌發(fā)參數(shù)(表3)顯示，溫度主要影響Tlag、Trelease和Tlys值;相應(yīng)地，DPA完全釋放和皮層水解結(jié)束所需的時間隨溫度降低而升高，特別是低于20℃(包括20℃)后，ΔTrelease值是25℃的4倍以上。

2.3濕熱處理對芽孢萌發(fā)的影響

PS832芽孢經(jīng)90℃水浴處理15 min后，40 min內(nèi)的萌發(fā)率與對照相當(dāng)(圖4，5.00 μg/mL溶菌酶)，但芽孢萌發(fā)明顯推遲，其Tlag值約為對照的2倍，孢內(nèi)CaDPA快速釋放所需的時間(ΔTrelease)和皮層水解的時間(ΔTlys)是對照的2.5倍左右(表4)。CaDPA開始快速釋放時芽孢的DIC亮度(Ilag)低于對照，而CaDPA完全釋放時的亮度(Irelease)則高于對照。Bm孢子在85℃水浴處理15 min，所得結(jié)果類似(數(shù)據(jù)沒有給出)。

表225℃時不同溶菌酶濃度下芽孢桿菌孢子的萌發(fā)參數(shù)

Table 2Mean values and standard deviations of germination parameters of decoated Bacillus spores triggered by various levels of lysozyme at 25℃

物種Species菌株Strains溶菌酶濃度Lysozymeconcentration(μg/mL)Tlag(min)Trelease(min)Tlys(min)ΔTrelease(min)ΔTlys(min)Ilag(%)Irelease(%)萌發(fā)率*Germinationrate(%)BsPS8321.00///////7.0(90min)2.5047.2±17.749.2±17.252.5±18.12.1±2.13.3±2.366.2±10.722.9±6.183.6(90min)3.7512.1±4.812.8±4.715.1±5.50.8±0.92.3±1.573.2±10.120.9±7.496.2(60min)10.002.5±1.43.1±1.53.8±1.80.8±0.70.8±0.680.7±9.118.3±10.799.9(20min)1000.000.9±1.01.6±1.2/0.6±0.2/87.1±10.66.2±9.099.9(15min)FB1103.7544.4±10.049.2±11.056.5±11.24.8±2.17.3±3.367.8±6.327.8±6.781.2(90min)FB1113.7537.9±18.941.2±17.944.6±18.13.3±2.93.4±1.660.8±12.917.1±6.569.8(90min)FB1133.7520.7±11.424.1±12.128.5±12.93.3±1.54.4±4.669.9±9.120.1±6.391.1(90min)PS34113.756.2±2.57.4±2.59.4±3.11.2±0.72.0±1.066.0±10.615.9±4.399.8(35min)PS36403.7523.0±11.524.2±11.426.5±11.61.2±0.82.3±1.058.6±10.420.4±5.591.2(60min)BmQMB15511.0027.5±3.728.4±3.931.6±3.50.9±0.83.2±1.974.5±7.524.5±8.699.9(50min)5.0011.4±3.712.2±3.614.7±3.90.8±0.73.3±1.877.4±10.126.2±8.7100.0(50min)100.001.5±0.71.8±0.82.2±0.90.3±0.10.4±0.491.5±4.911.5±8.8100.0(10min)

注：*括號內(nèi)為觀察時間

Note:*the observation periods were listed in brackets

圖3Bs芽孢在不同溫度下的群體萌發(fā)曲線(a)及8個不同芽孢的萌發(fā)動態(tài)(b,c)

Fig.3Germination of B.subtilis spores triggered by 5.00 μg/mL lysozyme at various temperatures(a) and the germination kinetics of 8 individual spores under 20℃(b) or 16℃(c)

圖4濕熱處理后芽孢的群體萌發(fā)曲線(a)及8個不同芽孢的萌發(fā)動態(tài)(b,c)

Fig.4Spore germination of wet-heated spores with triggering of 5.00 μg/mL lysozyme (a) and the germination kinetic of 8 individual spores untreated(b) or treated at 95℃ for 15 min(c)

表3PS832芽孢在不同溫度下的萌發(fā)參數(shù)

Table 3Mean values and standard deviations of germination parameters of B.sutilis PS832 spores at various temperatures

溫度TemperatureTlag(min)Trelease(min)Tlys(min)ΔTrelease(min)ΔTlys(min)Ilag(%)Irelease(%)萌發(fā)率Germinationrate(%)25℃5.1±2.95.8±2.97.0±3.20.7±0.71.1±0.771.5±10.412.4±4.499.920℃12.6±6.315.5±7.017.5±7.22.9±1.62.0±1.276.6±8.912.6±4.196.216℃26.9±10.730.1±10.932.1±10.83.2±0.81.9±2.363.4±11.411.2±6.286.7

注：5.00 μg/mL溶菌酶，觀察時間為60 min

Note：The germination was triggered by 5.00 μg/mL lysozyme and followed in 60 min

表4經(jīng)濕熱處理后的PS832芽孢萌發(fā)參數(shù)

Table 4Mean values and standard deviations of germination parameters of wet-heated B.sutilis PS832 spores

處理TreatmentTlag(min)Trelease(min)Tlys(min)ΔTrelease(min)ΔTlys(min)Ilag(%)Irelease(%)萌發(fā)率Germinationrate(%)Control5.0±2.35.8±2.96.3±2.90.8±0.70.5±0.678.0±11.88.6±7.099.495℃,15min9.9±4.711.9±4.613.1±4.72.0±0.81.3±0.972.5±9.320.8±7.397.7

注：萌發(fā)條件為5.00 μg/mL溶菌酶，25℃

Note：Germinations were triggered by 5.00 μg/mL lysozyme at 25℃

2.4不同菌株的萌發(fā)動態(tài)

SpoVA蛋白是處于芽孢內(nèi)膜上控制CaDPA吸收與釋放的關(guān)鍵蛋白，PS3411、PS3640是對SpoVA操控子進(jìn)行改造的菌株[25-26]。在90 min的觀察期內(nèi)(圖5,3.75 μg/mL溶菌酶)，SpoVA蛋白高表達(dá)(4倍)的菌株P(guān)S3411的萌發(fā)很快，同樣是spoVAC遺傳改造菌株，PS3640菌株萌發(fā)也較快。但除萌發(fā)啟動時間不同外，PS3411、PS3640菌株的萌發(fā)參數(shù)基本相同(表2)。

皮層水解酶CwlJ和SleB是參與芽孢萌發(fā)進(jìn)程的兩個重要酶，經(jīng)遺傳改造后的FB110菌株芽孢衣上無SleB酶，F(xiàn)B111菌株缺少CwlJ酶，F(xiàn)B113菌株則兩種酶都缺乏。圖5a顯示，在同樣的溶菌酶濃度下，F(xiàn)B113菌株萌發(fā)較快，F(xiàn)B110和FB111菌株的萌發(fā)過程基本相同。萌發(fā)參數(shù)(表2)顯示，皮層水解酶基因改造的FB系列菌株的ΔTrelease和ΔTrelease值明顯

圖5不同的Bs芽孢菌株(a)和不同物種的芽孢萌發(fā)動態(tài)(b～d)

Fig.5Spore germination of various B.subtilis strains (a) and germination kinetics of individual spores triggered by 3.75 μg/mL lysozyme (b～d)

高于spoVA改造的PS3411、PS3640菌株和野生型菌株，特別是FB110菌株，其ΔTrelease、ΔTlys值分別是spoVA改造菌株和野生型菌株的4倍和3倍以上。Ilag值顯示，PS3640菌株在Tlag前已經(jīng)緩慢釋放了較大量的CaDPA。

2.5巨大芽孢桿菌(Bm)芽孢的萌發(fā)動態(tài)

測試Bm芽孢在不同溶菌酶濃度下的萌發(fā)動態(tài)(圖6)，發(fā)現(xiàn)Bm芽孢對溶菌酶的敏感程度比Bs高，即使是僅1.00 μg/mL，95%以上的芽孢也在20 min內(nèi)萌發(fā)。和Bs芽孢一樣，溶菌酶濃度越低，Bm芽孢萌發(fā)越慢，ΔTrelease值和ΔTlys值越高。不同于Bs芽孢的是，Bm芽孢一旦開始萌發(fā)，90%以上的Bm芽孢在20 min內(nèi)完成萌發(fā)，其Tlag、Trelease和Tlys值的標(biāo)準(zhǔn)差(SD值)比Bs芽孢小得多(表2)。除Tlag、Trelease和Tlys值外，Bm芽孢在1.00 μg/mL、5.00 μg/mL溶菌酶下的其他萌發(fā)參數(shù)基本相同。當(dāng)溶菌酶濃度達(dá)到100.00 μg/mL 時，芽孢幾乎是接觸到溶菌酶溶液就開始水解皮層，并快速釋放孢內(nèi)的CaDPA。

圖6Bm芽孢在不同溶菌酶濃度下的群體萌發(fā)曲線(a)及5.00 μg/mL溶菌酶下8個不同芽孢的萌發(fā)動態(tài)(b)

Fig.6Germination of wild-type B.megaterium QM B1551 spores triggered by various concentrations of lysozyme (a) and the kinetics of 8 individual spores under 5.00 μg/mL of lysozyme (b)

3討論

溶菌酶觸發(fā)的細(xì)菌芽孢萌發(fā)是一條比較特殊的萌發(fā)途徑。與外源CaDPA觸發(fā)的萌發(fā)類似，溶菌酶通過水解芽孢皮層的肽聚糖引起孢內(nèi)CaDPA的釋放過程，只不過前者是外源CaDPA激活芽孢衣上的皮層水解酶進(jìn)而觸發(fā)芽孢萌發(fā)，而溶菌酶是直接水解芽孢皮層觸發(fā)芽孢萌發(fā)[6]。雖然芽孢桿菌屬細(xì)菌的溶菌酶萌發(fā)不是主要的芽孢萌發(fā)方式[14]，但對該方式的萌發(fā)規(guī)律和萌發(fā)機制進(jìn)行研究有助于認(rèn)識芽孢的抗性機制與萌發(fā)機制。

實驗結(jié)果顯示，在同樣條件下，溶菌酶濃度和溶液溫度是影響芽孢萌發(fā)的關(guān)鍵因素。濃度和溫度越高，芽孢萌發(fā)越快，孢內(nèi)CaDPA釋放的時間和芽孢皮層水解的時間越短，這是因為較高的濃度和溫度使得溶菌酶能更快地水解芽孢皮層。在高達(dá)100.00～1 000.00 μg/mL的濃度下，溶菌酶不僅會水解皮層，還會快速水解芽孢壁，引起芽孢內(nèi)膜破裂，造成孢內(nèi)物質(zhì)直接泄漏，這可能是細(xì)菌芽孢在高濃度的溶菌酶下極速釋放孢內(nèi)CaDPA的原因(表2)。

雖然溶菌酶能通過直接水解芽孢皮層觸發(fā)細(xì)菌芽孢萌發(fā)，但本研究結(jié)果顯示，芽孢的皮層水解酶也可能參與溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)進(jìn)程：(1)缺少皮層水解酶的FB系列菌株，其芽孢萌發(fā)的速度較慢，Tlag值高于其它菌株(圖5a、表1～2)，顯示皮層水解酶可能促進(jìn)溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)，與其它萌發(fā)途徑類似[13]。(2)ΔTlys值隨著溶菌酶濃度的升高而降低，推測在較低的溶菌酶濃度時皮層水解酶也參與CaDPA釋放后的芽孢皮層水解。(3)FB系列菌株的孢內(nèi)CaDPA快速釋放的時間和皮層水解的時間比其他菌株高；圖5c顯示，在Tlag后、CaDPA極速釋放前，是孢內(nèi)CaDPA慢速釋放的過程，F(xiàn)B菌株的這個過程比較長，因而ΔTrelease值高于其他菌株，也顯示芽孢的皮層水解酶參與了溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)進(jìn)程。對于SpoVA蛋白高表達(dá)(4倍)的PS3411菌株，其ΔTrelease值和野生型菌株類似，高表達(dá)的SpoVA蛋白并沒有加快孢內(nèi)DPA的釋放，與表面活性劑十二胺觸發(fā)的萌發(fā)不同[12]。

孢內(nèi)豐富的CaDPA對孢內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸起到較好的保護(hù)作用，但濕熱處理仍會損傷芽孢內(nèi)膜和皮層上與萌發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和酶[24]。本文結(jié)果顯示，95℃水浴處理15 min并不影響溶菌酶觸發(fā)的整體萌發(fā)，但萌發(fā)啟動推遲，孢內(nèi)CaDPA釋放所需的時間和皮層水解的時間均比對照高出1倍多，Tlag時的芽孢亮度(Ilag值)低于對照，說明CaDPA釋放通道結(jié)構(gòu)可能受損導(dǎo)致Tlag前已經(jīng)有較多的CaDPA緩慢釋放。這結(jié)果與營養(yǎng)萌發(fā)基本相同[24]，從另一個角度證明濕熱處理確實破壞CaDPA釋放通道的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

溶菌酶觸發(fā)的細(xì)菌芽孢萌發(fā)有著顯著的異質(zhì)性。在物種水平上，Bm芽孢比Bs芽孢對溶菌酶更敏感，在1.00 μg/mL濃度下，99%的Bm芽孢在40 min內(nèi)已經(jīng)萌發(fā)，而Bs芽孢僅有極少數(shù)芽孢啟動萌發(fā)(圖1a)。而且，Bm物種的芽孢間異質(zhì)性顯著低于Bs物種的，不管溶菌酶的濃度大小，90%以上的Bm芽孢均在20 min的時間范圍內(nèi)完成萌發(fā)，因此其萌發(fā)參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差較小(表2)，說明芽孢間的差異較小。Bs芽孢萌發(fā)的異質(zhì)性較大，不僅表現(xiàn)在芽孢間，也表現(xiàn)在菌株間。同樣是SpoVA操控子改造菌株，在3.75 μg/mL濃度下，PS3411菌株的芽孢萌發(fā)速度比野生型菌株快，PS3640菌株萌發(fā)也較快。而缺少皮層水解酶的菌株，除FB113菌株萌發(fā)較快外，F(xiàn)B110和FB111菌株萌發(fā)較慢。上述結(jié)果顯示菌株間的差異與其遺傳背景沒有必然的聯(lián)系。

芽孢間的萌發(fā)異質(zhì)性是芽孢萌發(fā)研究的興趣點。已有研究表明，對于超級休眠芽孢，在營養(yǎng)萌發(fā)中即使是給予極好的萌發(fā)條件，啟動萌發(fā)的時間可能需要數(shù)小時，也可能需要數(shù)天[32]。表2的數(shù)據(jù)顯示，不同萌發(fā)條件、不同菌株和不同物種下，芽孢間萌發(fā)的異質(zhì)性明顯，主要表現(xiàn)在兩個數(shù)據(jù)上：一是Tlag值，較高的Tlag值往往伴隨著較高的標(biāo)準(zhǔn)差(SD值)，也就是說越不容易萌發(fā)的芽孢群體，其芽孢間的萌發(fā)異質(zhì)性越大，這可能與芽孢內(nèi)部的信號傳導(dǎo)差異有關(guān)；二是ΔTrelease值，觀察圖1～6中單個孢子的萌發(fā)動態(tài)，可以發(fā)現(xiàn)在孢內(nèi)CaDPA釋放的Tlag～Trelease期間，有一個CaDPA較慢釋放和一個CaDPA極速釋放過程，在不同的萌發(fā)條件下，極速釋放的時間基本相同，約為0.3～0.5 min(統(tǒng)計數(shù)據(jù)表中沒有給出)，因而影響ΔTrelease值大小的主要因子就是孢子啟動CaDPA釋放后的較慢釋放過程，結(jié)合前面的分析，可知這個過程與溶菌酶濃度、溫度和菌株的皮層水解酶有關(guān)，與SpoVA蛋白沒有關(guān)系。

4結(jié)論

本研究在群體水平和單個芽孢水平上，從溫度、濃度、菌株、物種以及受損芽孢等多方面分析溶菌酶觸發(fā)的芽孢桿菌的芽孢萌發(fā)動態(tài)。結(jié)果顯示，芽孢需要一定濃度的溶菌酶或者適當(dāng)?shù)奶幚頃r間來觸發(fā)，單個芽孢的動態(tài)與營養(yǎng)萌發(fā)劑觸發(fā)的萌發(fā)基本相似；在同樣條件下，溶菌酶濃度和溫度是影響芽孢萌發(fā)的關(guān)鍵因素；溶菌酶直接水解芽孢皮層而觸發(fā)芽孢萌發(fā)，但皮層水解酶也可能參與了溶菌酶觸發(fā)的芽孢萌發(fā)進(jìn)程。溶菌酶觸發(fā)的細(xì)菌芽孢萌發(fā)在物種、菌株乃至單細(xì)胞水平都存在明顯的異質(zhì)性。研究結(jié)果同時也表明單細(xì)胞分析可以應(yīng)用于芽孢萌發(fā)機制及其異質(zhì)性。

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(責(zé)任編輯：米慧芝)

Kinetics of Germination of Individual Bacillus Spores and its Heterogeneity Triggered by Lysozyme

WANG Guiwen1，ZHANG Pengfei2，WANG Xiaochun1，CHEN Huanjun3,Peter Setlow4，LI Yongqing2

(1.Guangxi Academy of Sciences，Nanning，Guangxi，530007，China;2.Department of Physics，East Carolina University，Greenville，NC 27858，USA;3.College of Life Sciences and Technology，Guangxi University，Nanning,Guangxi，530004，China;4.Department of Molecular，Microbial and Structural Biology，University of Connecticut Health Center，F(xiàn)armington，CT 06030，USA)

Abstract:【Objective】The heterogeneous germination and its mechanism of Baillus spores triggered by lysozyme were studied in order to look insight into the mechanism of spore germination in general and provide new knowledge of inactivating bacterial spores.【Methods】The kinetic of germinations of multiple individual decoated spores of Bacillus subtilis (Bs) and B.megaterium (Bm) triggered by lysozyme were followed by Raman spectroscopy and differentail interference contrast (DIC) microscopy.【Results】Higher concentrations of lysozyme and temperatures significantly speeded the germination of Bs decaoted spores and reduced the time Tlag,at which spores began release of the great majority of spores’ 1∶1 chelate of Ca2+with dipicolinic acid (CaDPA),the period time of completing the release of CaDPA (named ΔTrelease) and the time period of hydrolysis of the spore’s peptidoglycan cortex (named ΔTlys).The ΔTreleasevalues of germination below 20℃ were 4 times more than that at 25℃.The ΔTreleasevalues of Bs spores with 4-fold-elevated level of SpoVA protein were basically similar to control strains,while spores lacking cortex-lytic enzymes exhibited notably higher ΔTreleasevalues than wild-type spores.The values of Tlag,ΔTreleaseand ΔTlysof spores treated by wet heat at 95℃ for 15 min were two times more than the untreated spores.Heterogeneous germinations were observed not only among individual decoated Bs spores,but also among Bs strains.The decoated Bm spores were more sensitive to lysozyme and its germinations of individual spores were less heterogeneous.【Conclusion】The germinations of decoated Bacillus spores triggered by lysozyme,on which the lysozyme concentration and temperature have a significant effect,are significantly heterogeneous at the levels of single spores and strains,as well as of species.The cortex-lytic enzymes may be involved in the initiation of germination.

Key words:Raman spectroscopy，DIC imaging，Baillus，spore germination，lysozyme，single-cell analysis

收稿日期：2016-02-19

作者簡介：王桂文(1969-)，男，研究員，主要從事生物物理與應(yīng)用微生物研究。

中圖分類號：Q935，Q937

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)02-0102-09

修回日期：2016-04-01

*國家自然科學(xué)基金項目(11264004，31460035)資助。

**通訊作者:E-mail:wguiwen@gxas.cn。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(2):102～110

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-05-12

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160512.0944.016.html