超分子法制備包埋有機小分子的磷酸鈣納米粒

汪　雷,　姚日生,　陶　偉

(合肥工業(yè)大學 醫(yī)學工程學院,安徽 合肥　230009)

超分子法制備包埋有機小分子的磷酸鈣納米粒

汪雷,姚日生,陶偉

(合肥工業(yè)大學 醫(yī)學工程學院,安徽 合肥230009)

摘要:將有機功能小分子包埋于磷酸鈣納米粒里在納米藥物制備等技術中具有重要的意義,但大多數有機小分子在水中溶解度較差、結合磷酸鈣的能力不強,從而增加了將其包埋在磷酸鈣納米粒里的難度。文章通過加入羧甲基-β-環(huán)糊精,使得與之結合的模型分子的溶解度與磷酸鈣結合能力增強,從而解決了上述問題。結果表明親水性的羅丹明B和疏水性的偶氮苯等模型分子能有效地包埋在磷酸鈣納米粒中。

關鍵詞:磷酸鈣納米粒;羧甲基-β-環(huán)糊精;羅丹明B;偶氮苯

近年來,以磷酸鈣納米粒作為藥物載體的研究受到人們的廣泛關注。其首要原因是磷酸鈣具有良好的生物相容性,是人體硬組織如骨骼及牙齒的主要無機成分;其次,磷酸鈣具有pH值依賴的溶解性,它在血漿(pH=7.4)中幾乎難以溶解,而當pH值下降到6以下,磷酸鈣溶解為人體內廣泛存在且必需的磷酸根和鈣離子；磷酸鈣納米粒因其納米尺寸而具有富集于腫瘤組織內的能力。所以,納米磷酸鈣被認為是近乎理想的藥物載體[1-4]。

大多數小分子藥物很難溶解于水中,且這些小分子也往往不具備綁縛磷酸鈣的官能團。因此,制備包埋小分子的磷酸鈣納米粒是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。近年來,包埋小分子的納米磷酸鈣的制備方法主要分為以下兩大類：① 基于雙反相乳液的制備方法[5-7]，這種方法要求被包埋的小分子藥物具有一定的水溶性或需要有機溶劑作為輔助,同時目標小分子也需要具有能夠綁縛磷酸鈣的羧基或硫酸根等官能基團的存在；② 基于高分子組裝體[8-12]、脂質體[13]、介孔二氧化硅[14-15]等輔助納米顆粒的包埋方法,其核心在于先將目標藥物負載于這些納米顆粒,然后將磷酸鈣沉積于這些納米的表面以達到包埋的目的。

β-環(huán)糊精是一種可以通過超分子相互作用復合小分子的環(huán)狀多糖,這一超分子性質使其廣泛地應用于藥物分子制劑的研究中[16-17]。同時,β-環(huán)糊精的環(huán)狀邊緣具有大量的羥基,可以方便地進行修飾[18-19]。目前將β-環(huán)糊精與磷酸鈣的特點相結合的研究并不多,本文提出一種基于β-環(huán)糊精超分子性質制備包埋有機小分子的磷酸鈣納米粒制備方法,將羧基修飾的β-環(huán)糊精與目標小分子形成超分子復合體,這時,β-環(huán)糊精不僅增加了目標分子的溶解性,同時β-環(huán)糊精環(huán)狀邊緣修飾的羧基具有綁縛磷酸鈣晶粒的性質,當磷酸鈣通過水相沉淀法制備生成時可完成對目標分子的包埋。實驗選用羅丹明B和偶氮苯分別作為水溶及疏水小分子藥物模型對該方法進行驗證。結果表明,通過羧基化β-環(huán)糊精的輔助,可以將缺少磷酸鈣親合能力的水溶性藥物及疏水性藥物進行有效地包埋。

1實驗部分

1.1羧甲基-β-環(huán)糊精的制備

取9.1 gβ-環(huán)糊精與7.5 g NaOH在30 mL蒸餾水中混合,加熱至60 ℃,逐滴加入70 mL濃度為1 mol/L的一氯乙酸水溶液,滴加時間控制在30 min左右。保持60 ℃攪拌4 h后,將混合物冷卻至室溫(25 ℃),并用濃鹽酸調節(jié)pH值至10?；旌弦涸谑覝叵路磻?2 h后使用濃鹽酸中和至中性。將混合液傾入過量的乙醇,得到渾濁懸浮液，過濾得到白色沉淀物。將白色固體重新溶解在水中,再于乙醇中沉淀2次,收集沉淀物,最后將沉淀在40 ℃下真空干燥得到產物。

1.2磷酸鈣納米粒的制備

將20 mg羥甲基β-環(huán)糊精和8 mg羅丹明B加入2 mol/L的20 mL氯化鈣水溶液中混合直至溶液澄清,在30 min內逐滴加入磷酸氫二鈉0.04 mol水溶液。滴加完畢后,用1 mol/L的NaOH水溶液調節(jié)混合物pH值至10,并攪拌1 h。加入30 mg檸檬酸鈉。將混合物繼續(xù)攪拌1 h后,在水中透析(截留分子量為3 500 Da)24 h。然后將混合液以10 000 r/min離心15 min,得到沉淀產物。將沉淀于乙醇中攪拌均勻,再以10 000 r/min離心15 min,洗出殘留在表面上的羅丹明B。攪勻、離心的步驟重復至少3次,直至上清液無色透明,收集最終產物,并于40 ℃條件下真空干燥。

在羅丹明B水溶液中直接制備磷酸鈣納米粒，制備過程與包埋羅丹明B的磷酸鈣納米粒一致,但沒有加入羥甲基β-環(huán)糊精。

在磷酸鈣生成后加入羅丹明B和羧甲基-β-環(huán)糊精的混合液是為了驗證羧甲基-β-環(huán)糊精是否能將羅丹明B固定在磷酸鈣的表面。向12 mL磷酸氫二鈉(0.04 mol)水溶液中滴加2 mol/L氯化鈣的水溶液20 mL。將混合液用1 mol/L的NaOH水溶液調節(jié)pH值至10,并攪拌1 h。然后將預先混合在20 mL水中1 h的20 mg羥甲基-β-環(huán)糊精和8 mg羅丹明B溶液加入?；旌弦簲嚢? h后加入30 mg檸檬酸鈉。繼續(xù)攪拌1 h，將所得產物以上述實驗程序進行純化獲取。

在羧甲基-β-環(huán)糊精和偶氮苯的混合液中制備磷酸鈣納米粒，實驗步驟與羧甲基-β-環(huán)糊精輔助下制備包埋羅丹明B磷酸鈣納米粒一致,將8 mg羅丹明B換為6 mg偶氮苯。

在磷酸鈣生成后加入偶氮苯與羧甲基-β-環(huán)糊精混合液是為了驗證羥甲基-β-環(huán)糊精是否能將偶氮苯固定在磷酸鈣的表面上。實驗步驟與在磷酸鈣生成后加入羅丹明B與羧甲基-β-環(huán)糊精的混合液一致,將8 mg羅丹明B換為6 mg偶氮苯。

1.3藥物分子的負載率和負載量

負載率和負載量的計算公式分別為：

(1)

12 mg包埋羅丹明B的磷酸鈣微粒加入10 mL pH值為1的HCl溶液?；旌弦和ㄟ^超聲處理至少30 min,直至粉末完全溶解,冷凍干燥除去水。加入10 mL的磷酸鹽緩沖液(pH=5.4),然后通過紫外分光光度法在555.7 nm波長進行測定。對紫外吸收強度的標準曲線進行計算得出羅丹明B的質量濃度數值。

40 mg包埋有客體分子的磷酸鈣微粒加入到20 mL的磷酸鹽緩沖液中(pH=5.4或7.4),然后將混合液轉移到透析袋(截留分子量為3 500 Da)。將透析袋浸入200 mL相應的磷酸鹽緩沖液后在恒溫搖動器(37 ℃,150 r/min)中進行釋放。以預定的時間間隔提取透析袋外2.0 mL緩沖溶液,并以等體積的新鮮緩沖溶液作為替換來保持漏槽狀態(tài)。釋放客體分子的量通過分析UV吸光度或高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)得到。

1.4細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞MDA-MB-231(ATCC)由上海復蒙基因生物技術有限公司提供,在DMEM培養(yǎng)基與10%的胎牛血清中置于37 ℃,5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

MDA-MB-231細胞接種于6孔板中,每孔1×105個細胞在0.5 mL DMEM培養(yǎng)基中置于37 ℃,5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)基替換為含有包埋羅丹明B的磷酸鈣微粒的DMEM培養(yǎng)基,羅丹明B的劑量為20 mmol。將細胞在37 ℃條件下培養(yǎng)2 h,然后將細胞進行沖洗,用胰蛋白酶處理,并使用BD FACSCalibur流式細胞儀進行流式細胞分析。

MDA-MB-231細胞與包埋有羅丹明B的磷酸微粒在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h,羅丹明B的劑量為20 mmol,然后用磷酸鹽緩沖液洗滌2次,并用4%甲醛在室溫下固定15 min。細胞骨架F-肌動蛋白和細胞核分別用Alexa Fluor 488和DAPI進行對比染色。蓋玻片被安裝在顯微鏡載玻片上并滴加1滴抗熒光淬滅封片液以減少熒光漂白。通過LSM 710共焦激光掃描顯微鏡觀察細胞攝取納米微粒。

磷酸鈣包埋多西紫杉醇的細胞毒性,用MTT法試驗測定。通常情況下,MDA-MB-231細胞在96孔板中培養(yǎng),密度為每孔1×104個細胞，加入系列稀釋的磷酸鈣納米微粒。培養(yǎng)48 h后,將樣品用MTT法處理4 h，形成的甲瓚結晶溶解于二甲基亞砜中,并使用Bio-Rad model 680酶標儀在波長為570 nm處測定吸光度。

2結果與討論

2.1羧甲基-β-環(huán)糊精的表征

本文在堿性條件下通過β-環(huán)糊精和氯乙酸的取代反應制備了羧甲基-β-環(huán)糊精，其核磁共振氫譜(1HNMR)如圖1所示,其中,位移在5.32和5.10 處為β-環(huán)糊精上H1的質子信號峰[20],位移為4.5～3.3的信號峰來自β-環(huán)糊精H2～H6及羧甲基上的亞甲基氫(—CH2—COOH)。通過對核磁氫譜各峰的積分面積進行分析[21]可得β-環(huán)糊精1-羧甲基的取代度。

將1個β-環(huán)糊精內H1標定為7,則β-環(huán)糊精上H2～H6的質子數之和對應為42個,由取代度公式可知羧甲基的取代度約為6。

圖1　羧甲基-β-環(huán)糊精的1HNMR譜

為了驗證羧甲基-β-環(huán)糊精可以輔助磷酸鈣對羅丹明B進行包埋,需證明羅丹明B與羧甲基-β-環(huán)糊精在制備磷酸鈣的條件下形成了超分子復合體。對此,本文采用二維核磁相關譜對其進行了研究分析[22],結果如圖2所示。由圖2可看出,β-環(huán)糊精與羅丹明B混合物于CaCl2重水溶液中,羅丹明B和羧甲基-β-環(huán)糊精特征峰的交叉區(qū)出現了明顯的相關峰,圓環(huán)中的(3.9,1.2)與(3.7,1.2)為羅丹明B上乙基與羧甲基-β-環(huán)糊精H3與H5相關峰,矩形框內(3.7,6.8)與(3.7,6.9)為羅丹明B二乙基氨基苯基苯環(huán)氫與羧甲基-β-環(huán)糊精H5的相關峰。因此可以斷定,當羧甲基-β-環(huán)糊精與羅丹明B混合時,羧甲基-β-環(huán)糊精以包覆羅丹明B二乙胺基苯基的方式形成超分子。

圖2　二維核磁相關譜

2.2納米磷酸鈣微粒包埋性質表征

本文選擇羅丹明B和偶氮苯分別作為親水和憎水藥物模型進行研究。在羅丹明B水溶液中直接反應獲得的磷酸鈣沉淀經洗滌后為白色固體,這說明羅丹明B既沒有被包埋入磷酸鈣顆粒中，也不能牢固地吸附于磷酸鈣顆粒的表面。在羅丹明B與羧甲基-β-環(huán)糊精混合液中進行磷酸鈣的沉淀反應，洗滌產物可得紅色的固體顆粒。這說明羧甲基-β-環(huán)糊精的加入使得羅丹明B成功負載于磷酸鈣顆粒中。一般地,納米粒負載藥物分子的方式有內部包埋和表面吸附2種,本文通過改變加料順序確定磷酸鈣對羅丹明B的負載方式[22],即先形成磷酸鈣顆粒，再加入羅丹明B和羧甲基-β-環(huán)糊精混合溶液。這種方法獲得的磷酸鈣經過洗滌后產物為白色,說明羅丹明B并不能通過羧甲基-β-環(huán)糊精的輔助牢固地吸附于磷酸鈣顆粒的表面。綜合以上實驗結果可以得出,通過與羧甲基-β-環(huán)糊精形成超分子化合物,羅丹明B被有效地包埋于磷酸鈣顆粒中。進一步的實驗結果表明,在pH值為5.4或7.4的PBS緩沖溶液中,羧甲基-β-環(huán)糊精的加入對羅丹明B的紫外可見光吸收幾乎沒有影響,如圖3所示。

圖3中，羧甲基-β-環(huán)糊精與羅丹明B的摩爾比分別為0、0.5、1.0,與偶氮苯的摩爾比分別為2、4、6、10此,本研究將負載羅丹明B的磷酸鈣在酸性條件下溶解后凍干除水,pH值為 5.4的PBS緩沖液定容后經紫外可見分光光度計確定羅丹明B的含量,帶入(1)式可得負載量和負載率分別為0.82%、32.72%。

圖3　不同分子濃度對紫外-可見光吸收的影響

偶氮苯在水中不能溶解,因此無法直接進行水相反應包埋于磷酸鈣中。當向水中加入羧甲基-β-環(huán)糊精后,偶氮苯溶解于水中形成溶液,這說明了羧甲基-β-環(huán)糊精與偶氮苯形成了穩(wěn)定的主客體超分子，并溶于水中。在這種超分子溶液中進行磷酸鈣的沉淀反應,產物為黃色的磷酸鈣。相應地,本文采用先形成磷酸鈣再加入偶氮苯和羧甲基-β-環(huán)糊精的超分子水溶液的方法卻只能獲得白色粉末。因此可以推斷，黃色產物中偶氮苯是以包埋的方式進入了磷酸鈣顆粒。進一步實驗顯示,在H2O與DMSO體積比為1∶1的混合溶液中,偶氮苯的紫外-可見吸收不會受到羧甲基-β-環(huán)糊精的影響,如圖3c所示。因此,將定量的包埋偶氮苯的磷酸鈣顆粒在酸性條件下溶解后凍干,加入的H2O/DMSO混合溶液定容后經紫外吸收法測量得到偶氮苯的負載量和負載率分別為1.27%和36.25%。

為了驗證包埋模型分子的磷酸鈣顆粒達到納米的尺度，本文通過光散射對產物進行了表征,其結果如圖4所示,透射電鏡照片如圖5所示。由圖4可知,包埋羅丹明B和包埋偶氮苯的磷酸鈣顆粒直徑均為100 nm左右。由圖5可知,顆粒為球狀,且顆粒大小與光散射結果一致。實驗證明了在羧基化β-環(huán)糊精的輔助下制備出了包埋有機小分子的磷酸鈣納米粒。

圖4　包埋羅丹明B與偶氮苯的納米磷酸鈣的光散射強度分布

圖5　包埋羅丹明B與偶氮苯的納米磷酸鈣透射電鏡照片

2.3納米磷酸鈣微粒釋放性能表征

納米磷酸鈣具有pH值響應的性質,可用于藥物的控制釋放。本文分別以體內血漿(pH=7.4)和內涵體(pH=5.4)為參考，研究納米磷酸鈣對其負載小分子的釋放性能，如圖6所示,在pH=7.4時,被負載的小分子幾乎不釋放。相反地,當體系的pH值降低為5.4時,被負載的小分子逐漸被釋放出。由此可以推斷,在堿性條件下,處于難溶狀態(tài)的磷酸鈣骨架能夠完全抑制被負載有機小分子的釋放,而當在酸性條件下,隨著磷酸鈣的逐漸溶解,被負載的小分子被釋放出。這表明納米磷酸鈣包埋的藥物分子在輸運過程中能有效地與外界隔離,減少被血漿內蛋白清除及損害正常組織細胞的概率。而當納米粒經EPR效應富集于腫瘤組織而被癌細胞攝取后,酸性條件將促使被包埋藥物的釋放。

圖6　不同pH值條件下磷酸鈣納米粒中的釋放曲線

被包埋于磷酸鈣納米粒的藥物分子需在細胞攝取后形成的內涵體或溶酶體的酸性條件下釋放。為此,本文以包埋羅丹明B的磷酸鈣納米粒進行了細胞攝取實驗,流式細胞儀測量結果如圖7a所示,在含有納米粒的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞,其熒光強度顯示為右邊的峰,其明顯高于左邊的對照組,由于羅丹明在pH=7.4的條件下完全不釋放,因此,熒光強度的增加說明納米粒被細胞攝取。

由于磷酸鈣及其降解產物均為人體所必需的物質,而環(huán)糊精衍生物被廣泛地應用于藥物輸運,因此,本研究中的磷酸鈣具有良好的生物相容性。為了驗證這一性質,實驗制備了負載羧基化β-環(huán)糊精的納米磷酸鈣，并通過MTT法研究了其生物相容性,如圖7b所示,在加入磷酸鈣納米粒的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的細胞幾乎沒有凋亡。綜合上述納米磷酸鈣的釋放、攝取性質可知,本文制備的納米磷酸鈣具備作為藥物載體的良好性質。

圖7　細胞攝取的熒光強度分析和細胞活性測量

3結束語

本研究采用羧基化環(huán)糊精與有機小分子形成主客體超分子的方法，解決了有機小分子難溶于水或缺少對磷酸鈣吸附能力的困難,制備了包埋有機小分子的納米磷酸鈣。這種納米磷酸鈣具有根據pH值選擇性釋放的能力。通過細胞實驗可知,這種方法制備的納米磷酸鈣具有應用于藥物載體的潛在價值。

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(責任編輯閆杏麗)

Preparation of small organic molecules encapsulated calcium phosphate nanoparticles by supramolecule method

WANG Lei, YAO Ri-sheng, TAO Wei

(School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract:The studies of small organic functional molecules encapsulated calcium phosphate nanoparticles(CPNPs) have great significance in preparation of nano-drug loaded carrier. However, most of small organic molecules may be lack of solubility in water or binding affinity to calcium phosphate, which make it difficult to encapsulate them in CPNPs. To solve the problem, carboxymethyl-β-cyclodextrin(CM-β-CD) was used to afford the solubility and bind affinity when it complexed with the model molecules. The results indicated that the model molecules such as hydrophilic rhodamine B(RB) or hydrophobic azobenzene were encapsulated in CPNPs efficiently.

Key words:calcium phosphate nanoparticles(CPNPs); carboxymethyl-β-cyclodextrin(CM-β-CD); rhodamine B(RB); azobenzene

收稿日期：2015-04-09；修回日期：2015-05-05

基金項目：國家自然科學青年基金資助項目(2013GJQN0465)

作者簡介：汪雷(1990-),男,安徽合肥人,合肥工業(yè)大學碩士生; 姚日生(1962-),男,安徽合肥人,博士,合肥工業(yè)大學教授,博士生導師.

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.05.006

中圖分類號:O636.9

文獻標識碼：A

文章編號：1003-5060(2016)05-0602-06