手性固定相AD、AS和OD的拆分性能

李麗群,　范　軍*,　張　晶,　陳曉東,　王　泰,　賀建峰,　章偉光,*

(1. 華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院, 廣東 廣州 510006; 2. 廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司, 廣東 廣州 510663)

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手性固定相AD、AS和OD的拆分性能

李麗群1,范軍1*,張晶1,陳曉東2,王泰2,賀建峰1,章偉光1,2*

(1. 華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院, 廣東 廣州 510006; 2. 廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司, 廣東 廣州 510663)

摘要:手性固定相-高效液相色譜法在手性藥物、手性農(nóng)藥等的分離分析中應(yīng)用廣泛。本文采用3種多糖衍生物的手性固定相(即EnantioPak AD、AS和OD)對20種手性化合物開展手性分離研究,進而探討樣品分子結(jié)構(gòu)、多糖骨架和衍生基團對手性分離的影響。結(jié)果表明,除化合物13外,其余化合物在EnantioPak AD上均實現(xiàn)基線分離,分離度多在2.0以上,在正己烷-醇流動相中加入酸堿添加劑可改善和優(yōu)化酸性或堿性化合物的分離效果;芳香醇(化合物13～16)隨著側(cè)鏈碳數(shù)增加在色譜柱上的保留減弱,其分離度呈現(xiàn)增加的趨勢;對比8種化合物在3種手性固定相上的分離結(jié)果可知,EnantioPak AD表現(xiàn)出更優(yōu)的分離性能。這為深入研究和了解多糖手性固定相、拓展其手性分離應(yīng)用提供了參考。

關(guān)鍵詞:多糖手性固定相;高效液相色譜;手性識別;分離機理

手性異構(gòu)體在生物體環(huán)境中可能表現(xiàn)截然不同的生物活性、藥理和毒性等,因此對天然化合物、手性藥物、農(nóng)藥化學(xué)品及中間體進行手性分析檢測是非常必要的。近幾十年,手性固定相-高效液相色譜法成為手性分離分析的重要手段之一[1-4]。

在多糖分子(如直鏈淀粉和纖維素等)中,葡萄糖單元通過氫鍵形成螺旋鏈結(jié)構(gòu),進而形成高度有序的超分子手性區(qū)域,與手性化合物產(chǎn)生手性識別作用;在多糖骨架上引入取代基(如苯氨基甲酸酯等)形成多糖衍生物后,其手性識別能力得到顯著地提高;同時,糖單元的結(jié)構(gòu)及衍生基團的性質(zhì)對多糖手性固定相的分離性能影響明顯[5-11]。靳紅衛(wèi)等[12]發(fā)現(xiàn),普萘洛爾對映體在Chiralpak AD、Chiralcel OD和OJ等色譜柱上的分離度分別為8.97、9.24和1.76,而在Chiralpak AS柱上無分離趨勢;袁黎明等[13]研究38種手性化合物在Chiralcel OD、Chiralpak AD和IA、(S,S)-Whelk-O1等色譜柱上的分離時發(fā)現(xiàn),Chiralpak AD柱可拆分其中21種(約占55%),而22種化合物在Chiralcel OD柱上實現(xiàn)基線分離。本課題組也相繼開發(fā)了單脲鍵、多脲鍵的環(huán)糊精手性固定相[14,15]、脲鍵型多糖手性固定相[16,17]等,研究了它們對手性金屬配合物、氨基酸及衍生物、β-阻斷劑等手性藥物的拆分性能。

本文則研究了20種手性化合物在EnantioPak AD、OD和AS等3種手性固定相上的分離,探討糖單元、取代基等對手性分離的影響。3種多糖衍生物的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

圖1　3種多糖衍生物的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1　Molecular structures of the three polysaccharide derivatives　AD: amylose tri(3,5-dimethylphenylcarbamate); AS: amylose-tris[(S)-α-phenylethylcarbamate]; OD: cellulose-tris(3,5-dimethyphenylcarbamate).

1實驗部分

1.1儀器與試劑

安捷倫1200系列高效液相色譜系統(tǒng),配有紫外檢測器、真空脫氣機、四元泵、100 μL定量環(huán)的自動進樣器、柱溫箱和安捷倫化學(xué)工作站軟件(美國安捷倫)。

正己烷、異丙醇、乙醇(色譜純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司),乙二胺(DEA)、三氟乙酸(TFA)(色譜純,上海晶純生化科技股份有限公司); 20種手性化合物(見圖2)、EnantioPak AD、OD和AS手性固定相由廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供,硅膠填料的粒徑為5 μm,孔徑為100 nm,色譜柱規(guī)格為150 mm×4.6 mm。

1.2色譜分離實驗

如無特殊說明,手性化合物均用乙醇溶解;流動相使用前經(jīng)過濾并超聲脫氣處理;在安捷倫高效液相色譜系統(tǒng)上,25 ℃下以1.0 mL/min的流速進行色譜分離實驗。

保留因子k按公式k=(tR-t0)/t0計算,其中tR為化合物的保留時間(min),t0為死時間(min);分離因子(α)按k2/k1計算得到;分離度(Rs)按2 (tR2-tR1)/(w2+w1)計算得到,其中tR2和tR1分別為第二個和第一個洗脫對映異構(gòu)體的保留時間(min),w2和w1分別為相應(yīng)異構(gòu)體色譜峰的半峰寬[14]。

2結(jié)果與討論

2.1EnantioPak AD手性固定相的分離性能

在正相色譜條件下研究了EnantioPak AD手性固定相對化合物1～12的分離情況,流動相條件和分離結(jié)果見表1?？梢钥闯?這些化合物在EnantioPak AD柱上都實現(xiàn)了基線分離(Rs>2.0);在流動相的選擇方面,化合物1～4沒有典型的酸性或堿性官能團,在正己烷-醇流動相中即可實現(xiàn)分離;化合物6～9上帶有羧基或羥基官能團,在流動相中添加少量TFA增強其洗脫能力,達到更好的分離效果(如化合物7);化合物10～12中含有氨基,在流動相中同時添加TFA-DEA后得到分離。

圖2　20種手性化合物的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2　Molecular structures of the 20 chiral compounds

CompoundinFig.2k1αRsMobilephasecondition(volumeratio)*16.921.182.18Hex-EtOH(98∶2)24.591.462.07Hex-EtOH(90∶10)31.291.222.91Hex-EtOH(65∶35)41.841.343.19Hex-IPA(70∶30)50.801.432.47Hex-EtOH-TFA(85∶15∶0.1)60.571.452.66Hex-EtOH-TFA(80∶20∶0.1)71.421.885.00Hex-EtOH-TFA(85∶15∶0.3)81.351.413.29Hex-IPA-TFA(90∶10∶0.1)90.641.643.46Hex-EtOH-IPA-TFA(80∶10∶10∶0.3)102.211.362.68Hex-EtOH-TFA-DEA(90∶10∶0.1∶0.1)116.601.162.01Hex-EtOH-TFA-DEA(94∶6∶0.1∶0.1)122.771.262.81Hex-IPA-EtOH-TFA-DEA(80∶15∶5∶0.3∶0.1)

* Hex: hexane; EtOH: ethanol; IPA: isopropanol; TFA: trifluoroacetic acid; DEA: diethylamine.

表 2　化合物13～20在3種手性柱上的HPLC分離結(jié)果

13-16: Hex-EtOH (95∶5, v/v), detection wavelength 220 nm; 17, 18: Hex-EtOH (90∶10, v/v), detection wavelength 220 nm; 19: Hex (0.1%TFA)-EtOH (80∶20, v/v), detection wavelength 290 nm; 20: Hex (0.1%TFA)-IPA (97∶3, v/v), detection wavelength 220 nm. ns: no separation.

在正相模式下的分離主要通過Dalgliesh的“三點相互作用”理論[18]來解釋。手性分子中的羥基、氨基或酯基等官能團可與手性固定相上的苯氨基甲酰基產(chǎn)生相互作用而形成非對映異構(gòu)體配合物。由于手性異構(gòu)體空間結(jié)構(gòu)的差異影響兩者結(jié)合的空間立體效應(yīng)及非對映體配合物的穩(wěn)定性,最終實現(xiàn)異構(gòu)體的手性分離。

2.2芳香醇碳鏈長度對EnantioPak AD手性固定相分離性能的影響

化合物13～16均為芳香醇,結(jié)構(gòu)相似,側(cè)鏈長度不同。對它們在EnantioPak AD柱上的分離進行了研究,結(jié)果見表2。

結(jié)果表明,隨著側(cè)鏈碳鏈長度的增加,化合物在色譜柱上的保留減弱,分離度和選擇因子呈現(xiàn)增加的趨勢。如前所述,手性固定相與化合物分子間的手性識別主要通過分子間弱相互作用(如氫鍵、π-π作用、疏水作用等)實現(xiàn);同時,手性中心附近的基團產(chǎn)生的立體位阻也會影響手性分離[19]。在化合物13～16中,隨著烷基側(cè)鏈碳數(shù)依次增加,空間位阻的增大使得手性分子與手性固定相間的氫鍵作用減弱；另一方面,手性化合物與流動相間疏水作用增強,加速了樣品從手性固定相上洗脫,進而對樣品的手性分離產(chǎn)生影響。

2.33種手性固定相的拆分性能比較

2.3.1多糖骨架結(jié)構(gòu)的影響

EnantioPak AD和OD手性固定相具有相同的取代基(即3,5-二甲基苯氨基甲?；?(見圖1),但多糖結(jié)構(gòu)不同,前者為直鏈淀粉,后者為纖維素。以化合物13～20比較研究其分離性能差異(見表2),化合物17和20的色譜圖見圖3。

圖3　手性化合物17和20的色譜圖Fig. 3　HPLC chromatograms of chiral compounds 17 and 20　17: Hex-EtOH (90∶10, v/v), detection wavelength 220 nm; 20: Hex (0.1%TFA)-IPA (97∶3, v/v), detection wavelength 220 nm.

結(jié)果表明,除化合物13外,其余化合物在EnantioPak AD柱上均實現(xiàn)基線分離(Rs>1.5);化合物13和20在EnantioPak OD柱的分離優(yōu)于EnantioPak AD柱,而化合物14～19的分離度均比在EnantioPak AD柱上差,化合物18則無分離趨勢。

這些差異可歸因于多糖葡萄糖單元的構(gòu)象和空間結(jié)構(gòu)的不同。本課題組曾對比研究鍵合型纖維素和直鏈淀粉手性固定相的分離性能[16]。直鏈淀粉是由D-葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵形成的鏈狀聚合物,為右手4/3螺旋結(jié)構(gòu);而纖維素則是由D-葡萄糖單元通過β-1,4-糖苷鍵鏈接形成的,為左手3/2螺旋結(jié)構(gòu);在多糖衍生物中,3,5-二甲苯氨基甲酰基圍繞著主鏈形成一個螺旋溝槽,與手性分子形成氫鍵、偶極-偶極和π-π堆積等分子間相互作用而實現(xiàn)手性識別。

2.3.2衍生基團的影響

表2亦給出化合物13～20在EnantioPak AS柱上的分離結(jié)果。結(jié)果表明,化合物17、19和20在EnantioPak AS柱上得到一定的分離,其他未有分離趨勢。顯然EnantioPak AS對這些化合物的分離能力比EnantioPak AD和OD差。

EnantioPak AD和AS均為直鏈淀粉衍生物手性固定相,其骨架結(jié)構(gòu)、硅膠基質(zhì)和結(jié)合方式相同,但葡萄糖單元上的取代基不同。在EnantioPak AD中,苯環(huán)上甲基的推電子作用使其具有較高的π電子密度,可與手性底物形成強的π-π堆積作用,同時苯氨基甲?；鵆=O電子云密度增大,促使固定相與手性化合物(如13～16)中的羥基形成氫鍵,進而實現(xiàn)手性拆分[15];在EnantioPak AS中,苯環(huán)與氨基甲?；ㄟ^烷基連接,空間位阻影響手性固定相與手性分子間的相互作用[20],手性化合物在EnantioPak AS上的保留要弱于EnantioPak AD。

3結(jié)論

在正相模式下研究了20種手性化合物在多糖手性固定相EnantioPak AD、AS和OD上的分離,探討了化合物的結(jié)構(gòu)、多糖骨架和衍生基團等對手性分離的影響。結(jié)果表明,除化合物13外,其余化合物在EnantioPak AD上都獲得良好的分離;對酸性或堿性化合物,在正己烷-醇流動相中加入三氟乙酸或二乙胺等添加劑可改善分離;比較了8種化合物在3種手性固定相上的分離,EnantioPak AD表現(xiàn)出最優(yōu)的分離性能。

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Enantioseparation behavior of chiral stationary phases AD, AS and OD

LI Liqun1, FAN Jun1*, ZHANG Jing1, CHEN Xiaodong2,WANG Tai2, HE Jianfeng1, ZHANG Weiguang1,2*

(1. School of Chemistry and Environment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China;2. Guangzhou Research & Creativity Biotechnology Co. Ltd., Guangzhou 510663, China)

Abstract:Over the past decades, HPLC enantioseparation with chiral stationary phases (CSPs) has been widely applied in chiral analysis and preparation of new pharmaceuticals, pesticides, food, etc. Herein, enantioseparation of 20 chiral compounds have been carried out on three polysaccharide-based CSPs (EnantioPak AD, AS and OD) with normal phases by HPLC, separately. The influences of skeletal structure and the kinds of derivative groups on separation behaviors of these CSPs have been studied in detail. As results indicated, except for compound 13, the other compounds were baseline separated on EnantioPak AD, with most of resolution over 2.0; in addition, better separation for acidic or basic compounds was achieved through adding acidic/basic additives into the mobile phase of hexane-alcohol. For four aromatic alcohols (compounds 13-16), their retention in the EnantioPak AD column showed a weakening tendency with increase of carbon number in side chain group, and the reverse trend of their resolution was observed. Furthermore, EnantioPak AD showed much better separation performance for eight compounds (13-20) than the others. In short, these results have provided some references for further investigation of separation behavior and applications of polysaccharide-based CSPs.

Key words:polysaccharide-based chiral stationary phases; high performance liquid chromatography (HPLC); chiral recognition; separation mechanism

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.10035 [11]Shen J, Okamoto Y. Chem Rev, 2015, 10.1021/acs. chemrev.5b00317

*收稿日期:2015-10-24

基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(21171059,21571070);科技部中小型企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目(13C26214404534);廣東省科技計劃項目(2014A010101145,2012B010900043);廣州市科技計劃項目(2013J4400027,201508020093).

中圖分類號:O658

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)01-0108-05

色譜手性分離?？ぱ芯空撐?/p>

*通訊聯(lián)系人:Tel:(020)39310187,E-mail:wgzhang@scnu.edu.cn(章偉光); E-mail:fanj@scnu.edu.cn(范軍).

Foundation item: Project of National Natural Science Foundation of China (21171059, 21571070); Innovation Fund for Technology Based Firms, Ministry of Science and Technology, China (13C26214404534); Science and Technology Project of Guangdong Province, China (2014A010101145, 2012B010900043); Guangzhou Science and Technology Project, China (2013J4400027, 201508020093).