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      人參皂苷20(R)-25-OH-Rg3的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

      2016-06-22 06:24:09美,瑩,燮,
      關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)鑒定分離純化

      楊 佳 美, 劉 春 瑩, 金 鳳 燮, 魚 紅 閃

      ( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

      人參皂苷20(R)-25-OH-Rg3的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

      楊 佳 美,劉 春 瑩,金 鳳 燮,魚 紅 閃

      ( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

      摘要:采用硅膠柱層析法和結(jié)晶法,從人參皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中分離得到了一種未知人參皂苷,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。10 g人參皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,分離純化得到該人參皂苷單體0.25 g。經(jīng)HPLC檢測(cè),其純度達(dá)99.7%。核磁共振檢測(cè)結(jié)果表明,該人參皂苷單體為12β,20(R),25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside,命名為20(R)-25-OH-Rg3。

      關(guān)鍵詞:人參皂苷;分離純化;結(jié)構(gòu)鑒定

      0引言

      人參皂苷是人參中的主要有效成分,在人參主根中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%左右[1-2]?,F(xiàn)已明確的人參皂苷單體有60多種[3]。人參皂苷由疏水的非糖基皂苷元(Aglycon)和親水的糖(Sugarmoieties)兩部分組成[4]。人參皂苷屬于三萜類皂苷,可分為3類:原人參二醇類皂苷(PPD),原人參三醇類皂苷(PPT)和齊果烷類人參皂苷[5]。人參皂苷具有廣泛的生物學(xué)活性[6-7]。

      本實(shí)驗(yàn)室前期利用酶轉(zhuǎn)化法制備了二醇類人參皂苷產(chǎn)物,對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行HPLC檢測(cè),與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品(Rg3、F2、Rg5、Rh2、C-K等)對(duì)照,發(fā)現(xiàn)其中有一種未知人參皂苷,采用硅膠柱層析法及結(jié)晶法對(duì)該未知皂苷進(jìn)行分離純化,得到目的皂苷單體,并利用核磁共振技術(shù)對(duì)單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

      1材料與方法

      1.1材料

      人參皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,實(shí)驗(yàn)室自制;人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、Rc、Rd、F2、Rg3、Rg5、C-K、Rh2,本實(shí)驗(yàn)室提供;薄層層析板SilicaGel60-F254,德國(guó)Merck公司;硅膠,青島海洋化工廠;甲醇、氯仿,均為分析純。

      JascoN2000系列高效液相色譜儀,日本分光公司;Alltech2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,美國(guó)Alltech公司;瑞士BrukeAVANCE600核磁共振波譜儀。

      1.2方法

      1.2.1薄層層析

      將人參皂苷溶于甲醇中,點(diǎn)樣于薄層層析板,展開劑為體積比7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水混合物,顯色劑為10%硫酸溶液。通過(guò)對(duì)照樣品斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)來(lái)確定樣品中所含皂苷成分。

      1.2.2硅膠柱層析

      取10g人參皂苷產(chǎn)物,用少量甲醇溶解(不能溶解的樣品用氯仿溶解),稱取25g的80~100目硅膠,加入樣品溶液中,并均勻攪拌待其完全蒸干[8]。稱取200g的300~400目硅膠作為分離膠,再裝入樣品膠,在最上層放置脫脂棉。用一定量的純氯仿通柱,然后按氯仿-甲醇體積比9.5∶0.5、9∶1、8.8∶1.2、8.5∶1.5依次進(jìn)行洗脫。每200mL收集一瓶,并用TLC法檢測(cè)。

      1.2.3高效液相色譜

      采用HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)人參皂苷[9],將樣品的保留時(shí)間與人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì),以確定人參皂苷的種類。中匯達(dá)C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);進(jìn)樣量,10μL;柱溫,35 ℃;流動(dòng)相流量,1.0mL/min;載氣,氮?dú)?;氣體體積流量,3.2L/min;載氣壓力,0.1MPa;ELSD的漂移管溫度,110 ℃。

      流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B);0~20min,20%A;20~31min,20%~32%A;31~40min,32%~43%A;40~70min,43%~100%A。

      1.2.4核磁共振法

      利用瑞士BrukeAVANCE600超導(dǎo)核磁共振波普儀對(duì)單體皂苷進(jìn)行一維核磁共振檢測(cè)。1H觀測(cè)頻率為400MHz,13C觀測(cè)頻率為150MHz,溶劑是Pyridine-D5(氘代吡啶)。包括1HNMR、13CNMR、1H-1HCOSY、DEPT45、DEPT90、DEPT135、HSQC、HMBC等圖譜的測(cè)定。

      2結(jié)果與討論

      2.1人參皂苷產(chǎn)物成分的確定

      取少量人參皂苷產(chǎn)物溶解于甲醇溶液中,經(jīng)HPLC檢測(cè),結(jié)果如圖1所示。

      圖1 人參皂苷產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)圖譜

      與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照,可知該產(chǎn)物中主要含有(S,R)-Rg3、Rg5及一種未知皂苷,未知皂苷中有2個(gè)吸收峰,暫命名為化合物1和化合物2。

      2.2硅膠柱層析法分離未知皂苷

      按照“1.2.2”的方法對(duì)該未知人參皂苷進(jìn)行硅膠柱分離。收集洗脫液,TLC檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

      圖2 樣品的TLC圖譜

      利用硅膠柱層析法分離目的皂苷,根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果,分別收集較純的各組分,收集的情況如表1所示。

      表1 洗脫分離收集表

      經(jīng)過(guò)硅膠柱層析法的分離,得到3種較純的人參皂苷,分別是目的皂苷、Rg3和Rg5。其中目的皂苷為1.42g,得率是14.2%。采用TLC法對(duì)表1中的各組分進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖3所示。

      原,人參皂苷混合物;1~3分別為收集的未知皂苷、Rg3和Rg5

      圖3硅膠柱洗脫單點(diǎn)組分TLC圖

      Fig.3TLCofpurefractionsfromsilicagel

      由圖3可以看出,3種組分在TLC板中均為單點(diǎn)。采用HPLC法檢測(cè)目的皂苷的純度,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,雖然目的皂苷在TLC上呈現(xiàn)單點(diǎn),但是在HPLC圖譜中顯示出2個(gè)吸收峰,說(shuō)明硅膠柱層析法不能將這兩種化合物分離,需要對(duì)化合物1和化合物2進(jìn)行進(jìn)一步的精制。

      圖4 目的皂苷的HPLC圖譜

      2.3結(jié)晶法純化化合物2

      將硅膠柱分離得到的化合物1和化合物2混合物,溶解于20mL70%的甲醇溶液中,自然冷卻結(jié)晶,放置2~3d后,得到白色不定型沉淀物,過(guò)濾后收集沉淀。HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖5所示,該晶體的保留時(shí)間是45.290min,與圖4中2個(gè)峰的保留時(shí)間作對(duì)比可以看出,析出的結(jié)晶為化合物2,質(zhì)量為0.25g,得率是17.6%,純度達(dá)99.7%。

      圖5 化合物2的HPLC圖譜

      2.4核磁法測(cè)定化合物2的結(jié)構(gòu)

      對(duì)化合物2進(jìn)行1HNMR,13CNMR,1H-1HCOSY,DEPT45,DEPT90,DEPT135,HSQC,HMBC等檢測(cè)。得到1HNMR(吡啶-d5,400MHz) 數(shù)據(jù):0.718(3H,s,H-19),0.831(3H,s,H-30),0.904(3H,s,H-18),1.001(3H,s,H-29),1.187(3H,s,H-28),1.305(9H,s,H-21,26,27),5.25(1H,d,J=7.8Hz,H-1′),4.82(1H,d,J=7.8Hz,H-1″);其13CNMR數(shù)據(jù)如表2所示。

      結(jié)合1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)化合物2的碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]中12β,20(R),25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside的數(shù)據(jù)非常相似,應(yīng)該是同種物質(zhì),結(jié)構(gòu)式如圖6所示。其分子式為C42H74O14,相對(duì)分子質(zhì)量為803.03。該物質(zhì)的簡(jiǎn)稱為25-OH-Rg3[11](也稱作Rg3-Hy[12]),由于本次分離出的結(jié)構(gòu)為R型25-OH-Rg3,所以命名為20(R)-25-OH-Rg3。

      表2 化合物2的13C-NMR化學(xué)位移

      圖6 20(R)-25-OH-Rg3的結(jié)構(gòu)式

      人參皂苷20(R)-25-OH-Rg3具有很高的藥用價(jià)值,它能增加大腦中的Na+通量進(jìn)而增強(qiáng)記憶能力[17],而且能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[18]。

      化合物1的純化未達(dá)到核磁要求,未對(duì)其進(jìn)行核磁檢測(cè)。根據(jù)HPLC及此次核磁檢測(cè)結(jié)果分析,推測(cè)化合物1和化合物2可能是手性化合物,化合物1可能是S型的25-OH-Rg3,其系統(tǒng)名稱是12β,20(S),25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside,結(jié)構(gòu)式如圖7所示。

      圖7 20(S)-25-OH-Rg3的結(jié)構(gòu)式

      3結(jié)論

      該酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中主要含有(S,R)-Rg3、Rg5及人參皂苷(S,R)-25-OH-Rg3。10g人參皂苷產(chǎn)物進(jìn)行硅膠柱層析法的分離,得到目的皂苷1.42g,得率為14.2%。結(jié)晶法制得20(R)-25-OH-Rg3單體0.25g,得率為17.6%,HPLC檢測(cè)其純度達(dá)99.7%。經(jīng)核磁共振分析可知,人參皂苷20(R)-25-OH-Rg3的系統(tǒng)命名為12β,20(R),25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside,其分子式為C42H74O14,相對(duì)分子質(zhì)量為803.03。另外,推測(cè)化合物1可能是S型的25-OH-Rg3,其系統(tǒng)名稱是12β,20(S),25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside。

      目前,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中關(guān)于20(R)-25-OH-Rg3的報(bào)道很少,鑒定出(S,R)-25-OH-Rg3的結(jié)構(gòu),不僅豐富了人參皂苷的種類,還為其更多的生物活性研究提供理論依據(jù)。

      參考文獻(xiàn):

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      [7] 竇德強(qiáng),靳玲,陳杰英.人參的化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)展與展望[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,16(2):15-16.

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      Purificationandidentificationof20(R)-25-hydroxy-ginsenosideRg3

      YANGJiamei,LIUChunying,JINFengxie,YUHongshan

      (SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

      Abstract:A rare ginsenoside was purified from the biotransformation products of natural ginsenosides. 0.25 g rare ginsenoside was obtained from 10 g samples after silica gel chromatograph and crystalliza- tion, and its purity was 99.7% detected by HPLC. NMR result showed that the rare ginsenoside was 12β, 20(R), 25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside, named 20(R)-25-hydroxy-ginsenoside Rg3.

      Key words:ginsenoside; purification; identification

      收稿日期:2014-12-30.

      基金項(xiàng)目:“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09503001-003).

      作者簡(jiǎn)介:楊佳美(1989-),女,碩士研究生;通信作者:魚紅閃(1968-),男,教授.

      中圖分類號(hào):TS201.2;Q946.83

      文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

      文章編號(hào):1674-1404(2016)03-0171-03

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