人參皂苷20(R)-25-OH-Rg3的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

楊 佳 美，　劉 春 瑩，　金 鳳 燮，　魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

人參皂苷20(R)-25-OH-Rg3的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

楊 佳 美，劉 春 瑩，金 鳳 燮，魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:采用硅膠柱層析法和結(jié)晶法，從人參皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中分離得到了一種未知人參皂苷，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。10 g人參皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，分離純化得到該人參皂苷單體0.25 g。經(jīng)HPLC檢測(cè)，其純度達(dá)99.7%。核磁共振檢測(cè)結(jié)果表明，該人參皂苷單體為12β，20(R)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside，命名為20(R)-25-OH-Rg3。

關(guān)鍵詞:人參皂苷；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定

0引言

人參皂苷是人參中的主要有效成分，在人參主根中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%左右[1-2]?，F(xiàn)已明確的人參皂苷單體有60多種[3]。人參皂苷由疏水的非糖基皂苷元(Aglycon)和親水的糖(Sugarmoieties)兩部分組成[4]。人參皂苷屬于三萜類皂苷，可分為3類：原人參二醇類皂苷(PPD)，原人參三醇類皂苷(PPT)和齊果烷類人參皂苷[5]。人參皂苷具有廣泛的生物學(xué)活性[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)室前期利用酶轉(zhuǎn)化法制備了二醇類人參皂苷產(chǎn)物，對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行HPLC檢測(cè)，與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品(Rg3、F2、Rg5、Rh2、C-K等)對(duì)照，發(fā)現(xiàn)其中有一種未知人參皂苷，采用硅膠柱層析法及結(jié)晶法對(duì)該未知皂苷進(jìn)行分離純化，得到目的皂苷單體，并利用核磁共振技術(shù)對(duì)單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

1材料與方法

1.1材料

人參皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)室自制；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、Rc、Rd、F2、Rg3、Rg5、C-K、Rh2，本實(shí)驗(yàn)室提供；薄層層析板SilicaGel60-F254，德國(guó)Merck公司；硅膠，青島海洋化工廠；甲醇、氯仿，均為分析純。

JascoN2000系列高效液相色譜儀，日本分光公司；Alltech2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)Alltech公司；瑞士BrukeAVANCE600核磁共振波譜儀。

1.2方法

1.2.1薄層層析

將人參皂苷溶于甲醇中，點(diǎn)樣于薄層層析板，展開劑為體積比7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水混合物，顯色劑為10%硫酸溶液。通過(guò)對(duì)照樣品斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)來(lái)確定樣品中所含皂苷成分。

1.2.2硅膠柱層析

取10g人參皂苷產(chǎn)物，用少量甲醇溶解(不能溶解的樣品用氯仿溶解)，稱取25g的80～100目硅膠，加入樣品溶液中，并均勻攪拌待其完全蒸干[8]。稱取200g的300～400目硅膠作為分離膠，再裝入樣品膠，在最上層放置脫脂棉。用一定量的純氯仿通柱，然后按氯仿-甲醇體積比9.5∶0.5、9∶1、8.8∶1.2、8.5∶1.5依次進(jìn)行洗脫。每200mL收集一瓶，并用TLC法檢測(cè)。

1.2.3高效液相色譜

采用HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)人參皂苷[9]，將樣品的保留時(shí)間與人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，以確定人參皂苷的種類。中匯達(dá)C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；進(jìn)樣量，10μL；柱溫，35 ℃；流動(dòng)相流量，1.0mL/min；載氣，氮?dú)?；氣體體積流量，3.2L/min；載氣壓力，0.1MPa；ELSD的漂移管溫度，110 ℃。

流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)；0～20min，20%A；20～31min，20%～32%A；31～40min，32%～43%A；40～70min，43%～100%A。

1.2.4核磁共振法

利用瑞士BrukeAVANCE600超導(dǎo)核磁共振波普儀對(duì)單體皂苷進(jìn)行一維核磁共振檢測(cè)。1H觀測(cè)頻率為400MHz，13C觀測(cè)頻率為150MHz，溶劑是Pyridine-D5(氘代吡啶)。包括1HNMR、13CNMR、1H-1HCOSY、DEPT45、DEPT90、DEPT135、HSQC、HMBC等圖譜的測(cè)定。

2結(jié)果與討論

2.1人參皂苷產(chǎn)物成分的確定

取少量人參皂苷產(chǎn)物溶解于甲醇溶液中，經(jīng)HPLC檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1　人參皂苷產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)圖譜

與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，可知該產(chǎn)物中主要含有(S，R)-Rg3、Rg5及一種未知皂苷，未知皂苷中有2個(gè)吸收峰，暫命名為化合物1和化合物2。

2.2硅膠柱層析法分離未知皂苷

按照“1.2.2”的方法對(duì)該未知人參皂苷進(jìn)行硅膠柱分離。收集洗脫液，TLC檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

圖2　樣品的TLC圖譜

利用硅膠柱層析法分離目的皂苷，根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果，分別收集較純的各組分，收集的情況如表1所示。

表1　洗脫分離收集表

經(jīng)過(guò)硅膠柱層析法的分離，得到3種較純的人參皂苷，分別是目的皂苷、Rg3和Rg5。其中目的皂苷為1.42g，得率是14.2%。采用TLC法對(duì)表1中的各組分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

原，人參皂苷混合物；1～3分別為收集的未知皂苷、Rg3和Rg5

圖3硅膠柱洗脫單點(diǎn)組分TLC圖

Fig.3TLCofpurefractionsfromsilicagel

由圖3可以看出，3種組分在TLC板中均為單點(diǎn)。采用HPLC法檢測(cè)目的皂苷的純度，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，雖然目的皂苷在TLC上呈現(xiàn)單點(diǎn)，但是在HPLC圖譜中顯示出2個(gè)吸收峰，說(shuō)明硅膠柱層析法不能將這兩種化合物分離，需要對(duì)化合物1和化合物2進(jìn)行進(jìn)一步的精制。

圖4　目的皂苷的HPLC圖譜

2.3結(jié)晶法純化化合物2

將硅膠柱分離得到的化合物1和化合物2混合物，溶解于20mL70%的甲醇溶液中，自然冷卻結(jié)晶，放置2～3d后，得到白色不定型沉淀物，過(guò)濾后收集沉淀。HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，該晶體的保留時(shí)間是45.290min，與圖4中2個(gè)峰的保留時(shí)間作對(duì)比可以看出，析出的結(jié)晶為化合物2，質(zhì)量為0.25g，得率是17.6%，純度達(dá)99.7%。

圖5　化合物2的HPLC圖譜

2.4核磁法測(cè)定化合物2的結(jié)構(gòu)

對(duì)化合物2進(jìn)行1HNMR，13CNMR，1H-1HCOSY，DEPT45，DEPT90，DEPT135，HSQC，HMBC等檢測(cè)。得到1HNMR(吡啶-d5，400MHz) 數(shù)據(jù)：0.718(3H，s，H-19)，0.831(3H，s，H-30)，0.904(3H，s，H-18)，1.001(3H，s，H-29)，1.187(3H，s，H-28)，1.305(9H，s，H-21，26，27)，5.25(1H，d，J=7.8Hz，H-1′)，4.82(1H，d，J=7.8Hz，H-1″)；其13CNMR數(shù)據(jù)如表2所示。

結(jié)合1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物2的碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]中12β，20(R)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside的數(shù)據(jù)非常相似，應(yīng)該是同種物質(zhì)，結(jié)構(gòu)式如圖6所示。其分子式為C42H74O14，相對(duì)分子質(zhì)量為803.03。該物質(zhì)的簡(jiǎn)稱為25-OH-Rg3[11](也稱作Rg3-Hy[12])，由于本次分離出的結(jié)構(gòu)為R型25-OH-Rg3，所以命名為20(R)-25-OH-Rg3。

表2　化合物2的13C-NMR化學(xué)位移

圖6　20(R)-25-OH-Rg3的結(jié)構(gòu)式

人參皂苷20(R)-25-OH-Rg3具有很高的藥用價(jià)值，它能增加大腦中的Na+通量進(jìn)而增強(qiáng)記憶能力[17]，而且能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[18]。

化合物1的純化未達(dá)到核磁要求，未對(duì)其進(jìn)行核磁檢測(cè)。根據(jù)HPLC及此次核磁檢測(cè)結(jié)果分析，推測(cè)化合物1和化合物2可能是手性化合物，化合物1可能是S型的25-OH-Rg3，其系統(tǒng)名稱是12β，20(S)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside，結(jié)構(gòu)式如圖7所示。

圖7　20(S)-25-OH-Rg3的結(jié)構(gòu)式

3結(jié)論

該酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中主要含有(S，R)-Rg3、Rg5及人參皂苷(S，R)-25-OH-Rg3。10g人參皂苷產(chǎn)物進(jìn)行硅膠柱層析法的分離，得到目的皂苷1.42g，得率為14.2%。結(jié)晶法制得20(R)-25-OH-Rg3單體0.25g，得率為17.6%，HPLC檢測(cè)其純度達(dá)99.7%。經(jīng)核磁共振分析可知，人參皂苷20(R)-25-OH-Rg3的系統(tǒng)命名為12β，20(R)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside，其分子式為C42H74O14，相對(duì)分子質(zhì)量為803.03。另外，推測(cè)化合物1可能是S型的25-OH-Rg3，其系統(tǒng)名稱是12β，20(S)，25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside。

目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中關(guān)于20(R)-25-OH-Rg3的報(bào)道很少，鑒定出(S，R)-25-OH-Rg3的結(jié)構(gòu)，不僅豐富了人參皂苷的種類，還為其更多的生物活性研究提供理論依據(jù)。

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Purificationandidentificationof20(R)-25-hydroxy-ginsenosideRg3

YANGJiamei,LIUChunying,JINFengxie,YUHongshan

(SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Abstract:A rare ginsenoside was purified from the biotransformation products of natural ginsenosides. 0.25 g rare ginsenoside was obtained from 10 g samples after silica gel chromatograph and crystalliza- tion, and its purity was 99.7% detected by HPLC. NMR result showed that the rare ginsenoside was 12β, 20(R), 25-trihydroxydammar-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside, named 20(R)-25-hydroxy-ginsenoside Rg3.

Key words:ginsenoside; purification; identification

收稿日期:2014-12-30.

基金項(xiàng)目:“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09503001-003).

作者簡(jiǎn)介:楊佳美(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：魚紅閃(1968-)，男，教授.

中圖分類號(hào):TS201.2；Q946.83

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1674-1404(2016)03-0171-03