丹酚酸A甲基結(jié)合代謝物的制備與結(jié)構(gòu)鑒定

翟文婷等

摘要：利用具有高兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）活力的大鼠肝細(xì)胞液體外溫孵代謝反應(yīng)，首次制備了4種丹酚酸A（SAA）的甲基結(jié)合代謝物。HPLC分析結(jié)果顯示，這些體外溫孵代謝產(chǎn)物與大鼠經(jīng)靜脈途徑給予SAA后在體內(nèi)生成的代謝產(chǎn)物一致。以O(shè)DS為固定相，甲醇水混合溶劑體系梯度洗脫，經(jīng)中壓柱層析分離，制得純度在95%以上的代謝產(chǎn)物單體成分。綜合應(yīng)用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波譜方法，并與母體化合物SAA進(jìn)行波譜數(shù)據(jù)的對(duì)比分析，鑒定這4種甲基結(jié)合代謝物分別為3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。

關(guān)鍵詞：丹酚酸A；體外酶促甲基結(jié)合代謝；結(jié)構(gòu)鑒定；質(zhì)譜；核磁共振譜

1引言

化合物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過(guò)程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成藥性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，并貫穿新藥研發(fā)至臨床應(yīng)用的全過(guò)程。在藥物設(shè)計(jì)及新藥開發(fā)早期就開展藥物代謝研究，不僅有利于提高新藥研發(fā)的成功率，還是新藥發(fā)現(xiàn)和藥物設(shè)計(jì)的重要來(lái)源，受到國(guó)際醫(yī)藥界的普遍關(guān)注[1～3]。

丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹參Salvia miltiorrhiza Bge.中一種微量的水溶性酚酸類成分，由一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮合而成（圖1），是丹參活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多種藥理活性，已作為心腦血管保護(hù)劑候選藥物進(jìn)入開發(fā)階段[5，6]。與諸多的天然多酚類化合物一樣，分布在A、B、C環(huán)上的3對(duì)鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致SAA在體內(nèi)發(fā)生快速且廣泛的代謝轉(zhuǎn)化， 這一推測(cè)已為包括人源重組酶體外溫孵在內(nèi)的眾多實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)。研究表明，SAA在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟的兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸轉(zhuǎn)移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代謝，生成包括葡醛酸和/或甲基結(jié)合在內(nèi)的多種Ⅱ相結(jié)合代謝產(chǎn)物，成為其發(fā)揮體內(nèi)藥效作用的直接物質(zhì)基礎(chǔ)[7～10]。

本研究在前期工作[11]基礎(chǔ)上，利用富含COMT酶的大鼠肝細(xì)胞液為酶供體的體外溫孵代謝反應(yīng)體系，結(jié)合中壓柱層析技術(shù)，分離制備了4種與體內(nèi)一致的SAA甲基結(jié)合代謝物，并綜合應(yīng)用質(zhì)譜和核磁共振波譜方法闡明了其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征（圖1）。相關(guān)研究結(jié)果將為揭示SAA的體內(nèi)代謝過(guò)程以及基于活性代謝產(chǎn)物的新藥篩選和發(fā)現(xiàn)提供基礎(chǔ)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），包括在線脫氣機(jī)、二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器；Thermo TSQ Quantum Access三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific Inc.），包括電噴霧離子化接口和Xcalibur色譜工作站，與Agilent 1100高效液相色譜儀構(gòu)成HPLCMS聯(lián)用分析系統(tǒng)；Bruker Avance 400核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker公司）。丹酚酸A（純度98.6%，山東靶點(diǎn)藥物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，純度≥98%，陜西森弗生物技術(shù)有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC級(jí)，F(xiàn)LUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶劑和試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2.3甲基結(jié)合代謝物的體外酶促溫孵制備與分離鈣沉淀法分離制備大鼠肝細(xì)胞液，Bradford法測(cè)定蛋白含量。孵育體系以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）為基質(zhì)，其中含2 mmol/L MgCl2、適量甲基供體（SAM輔因子）和大鼠肝細(xì)胞液（加入體積依其中蛋白含量確定）。于37℃恒溫水浴中振蕩預(yù)孵育5 min，加入SAA溶液，繼續(xù)孵育15 min后加5 mol/L HCl終止反應(yīng)。于終止反應(yīng)液中加入5倍體積乙酸乙酯超聲提取，離心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)鼜?fù)溶，以O(shè)DS為固定相，進(jìn)行中壓柱層析分離（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，HPLC跟蹤監(jiān)測(cè)，收集、合并保留時(shí)間相同的餾分，減壓回收溶劑后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。經(jīng)HPLC檢測(cè)，各化合物的色譜歸一化純度均在95%以上，適于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

3結(jié)果與討論

3.1代謝物的體內(nèi)外一致性分析

在相同色譜條件下，分別測(cè)定了空白大鼠肝細(xì)胞液孵育體系（不含SAA）、SAA與大鼠肝細(xì)胞液體外共孵育體系、空白大鼠膽汁以及大鼠尾靜脈注射給予SAA后0～2 h內(nèi)收集的膽汁樣品的HPLC圖譜，結(jié)果如圖2所示。其中，在SAA與大鼠肝細(xì)胞液體外共孵育體系中（圖2Ab），可見除內(nèi)源性物質(zhì)及少量未反應(yīng)完全的SAA外有4個(gè)主要色譜峰（根據(jù)色譜出峰先后依次標(biāo)記為1， 2， 3和4），其色譜保留時(shí)間均大于SAA，表明在優(yōu)化的體外孵育條件下SAA被快速、完全地代謝，生成4個(gè)極性明顯低于SAA的主要代謝產(chǎn)物。進(jìn)一步考察相同色譜條件下給藥大鼠膽汁樣品的HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)除膽汁內(nèi)源性物質(zhì)和SAA外尚含有多個(gè)代謝產(chǎn)物，其中14 min后的色譜圖輪廓與圖2Bb相似，亦給出4個(gè)主要色譜峰，且色譜保留時(shí)間完全一致，僅在色譜峰的相對(duì)高度上有所差異。上述結(jié)果表明，建立的以大鼠肝細(xì)胞液為酶供體的體外酶促溫孵體系可以快速生成與體內(nèi)一致的SAA代謝物，可作為反應(yīng)體系進(jìn)行體內(nèi)代謝物的富集制備。

摘要：利用具有高兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）活力的大鼠肝細(xì)胞液體外溫孵代謝反應(yīng)，首次制備了4種丹酚酸A（SAA）的甲基結(jié)合代謝物。HPLC分析結(jié)果顯示，這些體外溫孵代謝產(chǎn)物與大鼠經(jīng)靜脈途徑給予SAA后在體內(nèi)生成的代謝產(chǎn)物一致。以O(shè)DS為固定相，甲醇水混合溶劑體系梯度洗脫，經(jīng)中壓柱層析分離，制得純度在95%以上的代謝產(chǎn)物單體成分。綜合應(yīng)用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波譜方法，并與母體化合物SAA進(jìn)行波譜數(shù)據(jù)的對(duì)比分析，鑒定這4種甲基結(jié)合代謝物分別為3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。

關(guān)鍵詞：丹酚酸A；體外酶促甲基結(jié)合代謝；結(jié)構(gòu)鑒定；質(zhì)譜；核磁共振譜

1引言

化合物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過(guò)程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成藥性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，并貫穿新藥研發(fā)至臨床應(yīng)用的全過(guò)程。在藥物設(shè)計(jì)及新藥開發(fā)早期就開展藥物代謝研究，不僅有利于提高新藥研發(fā)的成功率，還是新藥發(fā)現(xiàn)和藥物設(shè)計(jì)的重要來(lái)源，受到國(guó)際醫(yī)藥界的普遍關(guān)注[1～3]。

丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹參Salvia miltiorrhiza Bge.中一種微量的水溶性酚酸類成分，由一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮合而成（圖1），是丹參活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多種藥理活性，已作為心腦血管保護(hù)劑候選藥物進(jìn)入開發(fā)階段[5，6]。與諸多的天然多酚類化合物一樣，分布在A、B、C環(huán)上的3對(duì)鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致SAA在體內(nèi)發(fā)生快速且廣泛的代謝轉(zhuǎn)化， 這一推測(cè)已為包括人源重組酶體外溫孵在內(nèi)的眾多實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)。研究表明，SAA在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟的兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸轉(zhuǎn)移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代謝，生成包括葡醛酸和/或甲基結(jié)合在內(nèi)的多種Ⅱ相結(jié)合代謝產(chǎn)物，成為其發(fā)揮體內(nèi)藥效作用的直接物質(zhì)基礎(chǔ)[7～10]。

本研究在前期工作[11]基礎(chǔ)上，利用富含COMT酶的大鼠肝細(xì)胞液為酶供體的體外溫孵代謝反應(yīng)體系，結(jié)合中壓柱層析技術(shù)，分離制備了4種與體內(nèi)一致的SAA甲基結(jié)合代謝物，并綜合應(yīng)用質(zhì)譜和核磁共振波譜方法闡明了其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征（圖1）。相關(guān)研究結(jié)果將為揭示SAA的體內(nèi)代謝過(guò)程以及基于活性代謝產(chǎn)物的新藥篩選和發(fā)現(xiàn)提供基礎(chǔ)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），包括在線脫氣機(jī)、二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器；Thermo TSQ Quantum Access三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific Inc.），包括電噴霧離子化接口和Xcalibur色譜工作站，與Agilent 1100高效液相色譜儀構(gòu)成HPLCMS聯(lián)用分析系統(tǒng)；Bruker Avance 400核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker公司）。丹酚酸A（純度98.6%，山東靶點(diǎn)藥物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，純度≥98%，陜西森弗生物技術(shù)有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC級(jí)，F(xiàn)LUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶劑和試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2.3甲基結(jié)合代謝物的體外酶促溫孵制備與分離鈣沉淀法分離制備大鼠肝細(xì)胞液，Bradford法測(cè)定蛋白含量。孵育體系以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）為基質(zhì)，其中含2 mmol/L MgCl2、適量甲基供體（SAM輔因子）和大鼠肝細(xì)胞液（加入體積依其中蛋白含量確定）。于37℃恒溫水浴中振蕩預(yù)孵育5 min，加入SAA溶液，繼續(xù)孵育15 min后加5 mol/L HCl終止反應(yīng)。于終止反應(yīng)液中加入5倍體積乙酸乙酯超聲提取，離心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)鼜?fù)溶，以O(shè)DS為固定相，進(jìn)行中壓柱層析分離（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，HPLC跟蹤監(jiān)測(cè)，收集、合并保留時(shí)間相同的餾分，減壓回收溶劑后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。經(jīng)HPLC檢測(cè)，各化合物的色譜歸一化純度均在95%以上，適于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

3結(jié)果與討論

3.1代謝物的體內(nèi)外一致性分析

在相同色譜條件下，分別測(cè)定了空白大鼠肝細(xì)胞液孵育體系（不含SAA）、SAA與大鼠肝細(xì)胞液體外共孵育體系、空白大鼠膽汁以及大鼠尾靜脈注射給予SAA后0～2 h內(nèi)收集的膽汁樣品的HPLC圖譜，結(jié)果如圖2所示。其中，在SAA與大鼠肝細(xì)胞液體外共孵育體系中（圖2Ab），可見除內(nèi)源性物質(zhì)及少量未反應(yīng)完全的SAA外有4個(gè)主要色譜峰（根據(jù)色譜出峰先后依次標(biāo)記為1， 2， 3和4），其色譜保留時(shí)間均大于SAA，表明在優(yōu)化的體外孵育條件下SAA被快速、完全地代謝，生成4個(gè)極性明顯低于SAA的主要代謝產(chǎn)物。進(jìn)一步考察相同色譜條件下給藥大鼠膽汁樣品的HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)除膽汁內(nèi)源性物質(zhì)和SAA外尚含有多個(gè)代謝產(chǎn)物，其中14 min后的色譜圖輪廓與圖2Bb相似，亦給出4個(gè)主要色譜峰，且色譜保留時(shí)間完全一致，僅在色譜峰的相對(duì)高度上有所差異。上述結(jié)果表明，建立的以大鼠肝細(xì)胞液為酶供體的體外酶促溫孵體系可以快速生成與體內(nèi)一致的SAA代謝物，可作為反應(yīng)體系進(jìn)行體內(nèi)代謝物的富集制備。

摘要：利用具有高兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）活力的大鼠肝細(xì)胞液體外溫孵代謝反應(yīng)，首次制備了4種丹酚酸A（SAA）的甲基結(jié)合代謝物。HPLC分析結(jié)果顯示，這些體外溫孵代謝產(chǎn)物與大鼠經(jīng)靜脈途徑給予SAA后在體內(nèi)生成的代謝產(chǎn)物一致。以O(shè)DS為固定相，甲醇水混合溶劑體系梯度洗脫，經(jīng)中壓柱層析分離，制得純度在95%以上的代謝產(chǎn)物單體成分。綜合應(yīng)用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波譜方法，并與母體化合物SAA進(jìn)行波譜數(shù)據(jù)的對(duì)比分析，鑒定這4種甲基結(jié)合代謝物分別為3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。

關(guān)鍵詞：丹酚酸A；體外酶促甲基結(jié)合代謝；結(jié)構(gòu)鑒定；質(zhì)譜；核磁共振譜

1引言

化合物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的過(guò)程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成藥性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)，并貫穿新藥研發(fā)至臨床應(yīng)用的全過(guò)程。在藥物設(shè)計(jì)及新藥開發(fā)早期就開展藥物代謝研究，不僅有利于提高新藥研發(fā)的成功率，還是新藥發(fā)現(xiàn)和藥物設(shè)計(jì)的重要來(lái)源，受到國(guó)際醫(yī)藥界的普遍關(guān)注[1～3]。

丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹參Salvia miltiorrhiza Bge.中一種微量的水溶性酚酸類成分，由一分子丹參素與兩分子咖啡酸縮合而成（圖1），是丹參活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多種藥理活性，已作為心腦血管保護(hù)劑候選藥物進(jìn)入開發(fā)階段[5，6]。與諸多的天然多酚類化合物一樣，分布在A、B、C環(huán)上的3對(duì)鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致SAA在體內(nèi)發(fā)生快速且廣泛的代謝轉(zhuǎn)化， 這一推測(cè)已為包括人源重組酶體外溫孵在內(nèi)的眾多實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)。研究表明，SAA在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟的兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸轉(zhuǎn)移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代謝，生成包括葡醛酸和/或甲基結(jié)合在內(nèi)的多種Ⅱ相結(jié)合代謝產(chǎn)物，成為其發(fā)揮體內(nèi)藥效作用的直接物質(zhì)基礎(chǔ)[7～10]。

本研究在前期工作[11]基礎(chǔ)上，利用富含COMT酶的大鼠肝細(xì)胞液為酶供體的體外溫孵代謝反應(yīng)體系，結(jié)合中壓柱層析技術(shù)，分離制備了4種與體內(nèi)一致的SAA甲基結(jié)合代謝物，并綜合應(yīng)用質(zhì)譜和核磁共振波譜方法闡明了其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征（圖1）。相關(guān)研究結(jié)果將為揭示SAA的體內(nèi)代謝過(guò)程以及基于活性代謝產(chǎn)物的新藥篩選和發(fā)現(xiàn)提供基礎(chǔ)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），包括在線脫氣機(jī)、二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器；Thermo TSQ Quantum Access三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific Inc.），包括電噴霧離子化接口和Xcalibur色譜工作站，與Agilent 1100高效液相色譜儀構(gòu)成HPLCMS聯(lián)用分析系統(tǒng)；Bruker Avance 400核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker公司）。丹酚酸A（純度98.6%，山東靶點(diǎn)藥物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，純度≥98%，陜西森弗生物技術(shù)有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC級(jí)，F(xiàn)LUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶劑和試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2.3甲基結(jié)合代謝物的體外酶促溫孵制備與分離鈣沉淀法分離制備大鼠肝細(xì)胞液，Bradford法測(cè)定蛋白含量。孵育體系以磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）為基質(zhì)，其中含2 mmol/L MgCl2、適量甲基供體（SAM輔因子）和大鼠肝細(xì)胞液（加入體積依其中蛋白含量確定）。于37℃恒溫水浴中振蕩預(yù)孵育5 min，加入SAA溶液，繼續(xù)孵育15 min后加5 mol/L HCl終止反應(yīng)。于終止反應(yīng)液中加入5倍體積乙酸乙酯超聲提取，離心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)鼜?fù)溶，以O(shè)DS為固定相，進(jìn)行中壓柱層析分離（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，HPLC跟蹤監(jiān)測(cè)，收集、合并保留時(shí)間相同的餾分，減壓回收溶劑后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。經(jīng)HPLC檢測(cè)，各化合物的色譜歸一化純度均在95%以上，適于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

3結(jié)果與討論

3.1代謝物的體內(nèi)外一致性分析

在相同色譜條件下，分別測(cè)定了空白大鼠肝細(xì)胞液孵育體系（不含SAA）、SAA與大鼠肝細(xì)胞液體外共孵育體系、空白大鼠膽汁以及大鼠尾靜脈注射給予SAA后0～2 h內(nèi)收集的膽汁樣品的HPLC圖譜，結(jié)果如圖2所示。其中，在SAA與大鼠肝細(xì)胞液體外共孵育體系中（圖2Ab），可見除內(nèi)源性物質(zhì)及少量未反應(yīng)完全的SAA外有4個(gè)主要色譜峰（根據(jù)色譜出峰先后依次標(biāo)記為1， 2， 3和4），其色譜保留時(shí)間均大于SAA，表明在優(yōu)化的體外孵育條件下SAA被快速、完全地代謝，生成4個(gè)極性明顯低于SAA的主要代謝產(chǎn)物。進(jìn)一步考察相同色譜條件下給藥大鼠膽汁樣品的HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)除膽汁內(nèi)源性物質(zhì)和SAA外尚含有多個(gè)代謝產(chǎn)物，其中14 min后的色譜圖輪廓與圖2Bb相似，亦給出4個(gè)主要色譜峰，且色譜保留時(shí)間完全一致，僅在色譜峰的相對(duì)高度上有所差異。上述結(jié)果表明，建立的以大鼠肝細(xì)胞液為酶供體的體外酶促溫孵體系可以快速生成與體內(nèi)一致的SAA代謝物，可作為反應(yīng)體系進(jìn)行體內(nèi)代謝物的富集制備。