八正顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

史亞柱，劉皈陽，李　翔，黎春彤，馮春景

1.解放軍第203醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，北京 100048

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·藥學(xué)研究·

八正顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

史亞柱1，劉皈陽2*，李翔2，黎春彤2，馮春景2

1.解放軍第203醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，北京 100048

[摘要]目的建立八正顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法對(duì)八正顆粒中的大黃、梔子、車前子、燈心草、甘草進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC法對(duì)制劑中的梔子進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果大黃、梔子、車前子、燈心草、甘草的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無干擾。含量測(cè)定中，梔子苷在2.32～46.4 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，平均回收率為99.41%，RSD=1.46% (n=6)。結(jié)論所建立的定性、定量方法簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性好，為八正顆粒提供了有效的質(zhì)量控制方法。

[關(guān)鍵詞]八正顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層鑒別；高效液相色譜法

0引言

八正顆粒是解放軍第二〇三醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由八正合劑演變而來，由瞿麥、木通、大黃、梔子、車前子、燈心草、甘草、萹蓄、滑石共9味藥材組成，清熱瀉火、利水通淋[1]。常用于膀胱炎、尿道炎、急性前列腺炎、泌尿道結(jié)石及急性腎炎、急性腎盂腎炎。在臨床中長(zhǎng)期使用，療效確切，獲得患者的廣泛認(rèn)可[2]。八正顆粒并未收入藥典，有文獻(xiàn)對(duì)其薄層鑒別、含量測(cè)定進(jìn)行報(bào)道，但對(duì)其質(zhì)量控制尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[3-5]。為提高產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證藥效一致，本研究采用薄層色譜分別對(duì)八正顆粒中的大黃、梔子、車前子、燈心草、甘草進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法測(cè)定制劑中梔子苷的含量，對(duì)八正顆粒進(jìn)行全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，建立和完善八正顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為控制藥品質(zhì)量、保證藥品安全有效提供依據(jù)。

1儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀，Agilent 1200系列四元泵，VWD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，ChemStation化學(xué)工作站(美國安捷倫公司)；瑞士卡瑪Linomat 5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀；梅特勒-托利多AE200電子天平；80-2離心沉淀機(jī)(金壇市金南儀器廠)；ZF-90暗箱式紫外透射儀(上海顧村電光儀器廠)；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

德國默克硅膠60高效薄層板(德國Merck)；對(duì)照藥材、對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院：梔子苷對(duì)照品(批號(hào)：110749-201316)、大黃素對(duì)照品(批號(hào)：110756-200110)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)：110796-201308)、蘆薈大黃素對(duì)照品(批號(hào)：110795-201308)、大黃素甲醚對(duì)照品(批號(hào)：758-9803)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：111610-201106)、毛蕊花糖苷對(duì)照品(批號(hào)：111530-201411)為含量測(cè)定用；大黃對(duì)照藥材(批號(hào)：121249-201304)、梔子對(duì)照藥材(批號(hào)：120986-201309)、車前子對(duì)照藥材(批號(hào)：121628-201001)、燈心草對(duì)照藥材(批號(hào)：121463-201002)、川木通對(duì)照藥材(批號(hào)：121409-201402)、瞿麥對(duì)照藥材(批號(hào)：121685-201301)、萹蓄對(duì)照藥材(批號(hào)：121673-201201)、甘草對(duì)照藥材(批號(hào)：120904-201318)為薄層鑒別用。

2方法與結(jié)果

2.1薄層鑒別

2.1.1大黃的薄層色譜鑒別取本品2 g，加二氯甲烷20 mL，超聲處理30 min，濾過蒸干，1 mL甲醇復(fù)溶為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.2 g，參照2015版《中國藥典》[1](以下統(tǒng)稱《藥典》)大黃藥材薄層鑒別項(xiàng)下方法處理。再取蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。上述溶液按照《藥典》大黃藥材薄層鑒別項(xiàng)下色譜條件展開并觀察，結(jié)果見圖1。

圖1　大黃的TLC圖譜

4.大黃對(duì)照藥材，5.蘆薈大黃素對(duì)照品，6.大黃素對(duì)照品，7.大黃素甲醚對(duì)照品，8.大黃酚對(duì)照品，9.缺大黃陰性樣品；a.365 nm下觀察，b.置氨蒸氣中熏后，條斑變?yōu)榧t色結(jié)果

2.1.2梔子的薄層色譜鑒別取本品2 g、梔子對(duì)照藥材0.2 g，參照《藥典》梔子藥材薄層鑒別項(xiàng)下方法，以甲醇超聲法制備供試品和對(duì)照藥材溶液。再取梔子苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。上述溶液以二氯甲烷-甲醇(5∶1)展開并觀察，在10%硫酸乙醇溶液中，105 ℃加熱顯色，結(jié)果見圖2。

2.1.3車前子的薄層色譜鑒別取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液。另取車前子對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取毛蕊花糖苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。上述溶液分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-醋酸-水(2∶1∶7)展開并觀察，置紫外光燈(365 nm)下檢視，結(jié)果見圖3。

2.1.4甘草的薄層色譜鑒別取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液。另取甘草對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取甘草苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。上述溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(7∶0.5∶1)展開，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱顯色，見圖4。

圖2　梔子TLC圖譜

4.梔子對(duì)照藥材，5.梔子苷對(duì)照品，6.缺梔子陰性樣品

圖3　車前子TLC圖譜

4.車前子對(duì)照藥材，5.毛蕊花糖苷對(duì)照品，6.缺車前子陰性樣品

圖4　甘草TLC圖譜

4.甘草對(duì)照藥材，5.甘草苷對(duì)照品，6.缺甘草陰性樣品；b.365 nm下檢視

2.1.5燈心草的薄層色譜鑒別取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液。另取燈心草對(duì)照藥材0.2 g同法制成對(duì)照藥材溶液。參照《藥典》燈心草藥材薄層鑒別項(xiàng)下色譜條件展開，見圖5。

圖5　燈心草TLC圖譜

4.燈心草對(duì)照藥材，5.缺燈心草陰性樣品

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(30∶70)；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；進(jìn)樣量：

10 μL，運(yùn)行時(shí)間：12 min。

2.2.2溶液制備①供試品溶液的制備：精密稱量同一批號(hào)八正顆粒0.3 g，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，取續(xù)濾液，即得。②對(duì)照品溶液的制備：取在60 ℃減壓干燥4 h的梔子苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含232 μg的溶液，即得。③陰性溶液的制備：按照八正顆粒的處方比例和制法，制備缺梔子的陰性對(duì)照樣品，按照供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備成陰性對(duì)照溶液。

2.2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC圖譜。見圖6。結(jié)果顯示，梔子苷保留時(shí)間為9.22 min，與其他成分分離良好，不受其他成分干擾，理論塔板數(shù)按梔子苷計(jì)，不低于5 000。

圖6　梔子苷的HPLC圖譜

2.2.4線性關(guān)系精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻。上述溶液依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、梔子苷濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，梔子苷在2.32～46.4 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=14.49 X-1.390，r=0.999 9，線性范圍2.32～46.4 μg/mL。

2.2.5精密度試驗(yàn)精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄梔子苷峰面積，其RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取上述同一供試品溶液(批號(hào)：20140901)，分別在0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，其RSD為0.78%，結(jié)果表明，供試品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次供試品(批號(hào)：20140901) 6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，梔子苷的平均含量為1.871 μg/mg，RSD為1.95%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收率試驗(yàn)稱取已知含量(含梔子苷1.871 μg/mg)的同一批八正顆粒約0.15 g，精密稱定，分別加入梔子苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，測(cè)定梔子苷的含量，計(jì)算回收率。梔子苷平均加樣回收率為99.41%，RSD為1.46%。結(jié)果見表1。

2.2.9樣品的含量測(cè)定取3批八正顆粒(批號(hào)：20140501、20140901、20141101)，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算梔子苷的含量，結(jié)果見表2。

3討論

3.1薄層鑒別在鑒別試驗(yàn)中，對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)中大黃和梔子的鑒別進(jìn)行了修訂。考察了《藥典》大黃和梔子藥材鑒別項(xiàng)下的提取方法，考慮到梔子和大黃在八正顆粒制法中分別為50%乙醇提取和水提取，本試驗(yàn)又考察了文獻(xiàn)中超聲提取的方法，提取溶劑分別對(duì)比了二氯甲烷、甲醇和水，最終確定大黃鑒別采用二氯甲烷超聲提取，梔子采用甲醇提取的方法，節(jié)省了操作時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作步驟，保證了檢驗(yàn)工作的有效性和高效率[4]。

表1　梔子苷加樣回收率試驗(yàn)

表2　三批樣品的含量測(cè)定結(jié)果(μg/mg)

本試驗(yàn)在原有標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，增加了車前子、甘草和燈心草的薄層鑒別。車前子鑒別試驗(yàn)：考察了文獻(xiàn)中車前子藥材的薄層鑒別方法，發(fā)現(xiàn)采用《藥典》法，毛蕊花糖苷和梔子苷有明顯的干擾，二者化學(xué)位移非常接近，因此本試驗(yàn)采用了聚酰胺薄膜為固定相，甲醇-冰醋酸-水為展開劑，365 nm紫外光下觀察，陰性樣品無干擾[6]。甘草鑒別試驗(yàn)，考察了《藥典》成方制劑百合固金口服液(含有水提取甘草成分)中甘草鑒別項(xiàng)下展開劑系統(tǒng)，比較了四相展開劑系統(tǒng)乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)和三項(xiàng)展開劑系統(tǒng)乙酸乙酯-甲酸-水(7∶0.5∶1)，二者差別不大，最終采用了相對(duì)簡(jiǎn)單的三項(xiàng)系統(tǒng)。燈心草在原處方制法中為藥材粉末直接入藥，因此本試驗(yàn)采用了《藥典》中燈心草藥材的鑒別條件，以超聲提取代替回流提取，簡(jiǎn)化了提取條件。

本試驗(yàn)對(duì)大黃、梔子、車前子、甘草的鑒別，均采用對(duì)照藥材和對(duì)照品同時(shí)對(duì)照。采用對(duì)照品為對(duì)照，能保證檢出被測(cè)組分的有效性；采用對(duì)照藥材為對(duì)照，可保證藥材鑒別的全面性，避免被鑒別藥材因在制劑中添加指標(biāo)性成分而不能檢出未添加的假陽性現(xiàn)象。

3.2梔子苷含量測(cè)定本試驗(yàn)對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)中梔子苷的含量測(cè)定進(jìn)行了修訂。采用文獻(xiàn)中50%甲醇超聲提取的方法，提取效率優(yōu)于原標(biāo)準(zhǔn)中稀乙醇溶解的方法[4]。分別對(duì)比了《藥典》和文獻(xiàn)方法，對(duì)流動(dòng)相比例、檢測(cè)波長(zhǎng)和色譜柱均進(jìn)行了考察，最終確定了“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件[4,7-8]。梔子苷含量限度的擬定，根據(jù)八正顆粒中梔子苷處方量為118 g，《藥典》梔子藥材含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定，含梔子不低于1.8%，按其提取轉(zhuǎn)移率不低于70%計(jì)，1 000 g成品中含有梔子苷應(yīng)不低于1.49 g。每袋10 g計(jì)，每袋含梔子以梔子苷計(jì)不低于14.9 mg。以此標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，本試驗(yàn)考察的3批八正顆粒的含量均符合標(biāo)準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[2]金燦,姜寧華.八正顆粒的制備及臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2001,11:53-54.

[3]李耿,溫良明,侯少貞,等.RP-HPLC測(cè)定八正顆粒中大黃素、大黃酚的含量[J].中成藥,2007,9:1415-1417.

[4]盛望鵬.八正顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改善研究[J].中國生化藥物雜志,2014,4:164-168.

[5]黃順旺.八正顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2009,11:20-22.

[6]鐘瑞建,俞燕,丁劍虹,等.車前子中車前素的TLC鑒別及HPLC含量測(cè)定[J].藥物分析雜志,2015,4:715-718.

[7]李翔,劉皈陽,馬建麗,等.HPLC法同時(shí)測(cè)定清熱解毒軟膠囊中綠原酸梔子苷和黃芩苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2013,3:239-241.

[8]賀康洪,侯佳寧,張紫東,等.HPLC法測(cè)定肝血管瘤活血膠囊中梔子苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2014,6:530-531,534.

Improvement in quality standard for bazheng granules

SHI Ya-zhu1,LIU Gui-yan2*,LI Xian2,LI Chun-ton2,FENG Chun-jin2

(1.NO.203 Hospital of PLA,Qiqihaer 161000,China;2.Department of Pharmacy,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish the quality standard for Bazheng granules.MethodsFive major components (including rheum officinale,fructus gardenia,semen plantaginis,medulla junci and radix glycyrrhiza) were identified by TLC.The content of geniposide was determined by HPLC.ResultsThe spots of TLC of all varieties were distinctive with good reproducibility,and there was no interference with the negative references.Geniposide had good linear relation during 2.32～46.4 μg/mL (r=0.9999).The average recovery was 99.41% with RSD 1.46% (n=6).ConclusionTLC and HPLC methods are rapid and accurate with good reproducibility,so it is effective for the quality control of Bazheng granules.

Key words：Bazheng granules;Quality standard;TLC;HPLC

收稿日期：2015-09-14

基金項(xiàng)目：軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題(14ZJ-Z20-3)

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604024

*通信作者