石蠟切片技術(shù)在本科教學(xué)中的應(yīng)用

王樹(shù)蕓 韓秀蘭 霍學(xué)慧 畢建杰 王啟柏 李圣福 郭風(fēng)法

【摘要】石蠟切片技術(shù)是一門非常實(shí)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但由于其制作步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，很難應(yīng)用到本科教學(xué)中。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)改良的石蠟切片釕紅染色法具有簡(jiǎn)單、易操作、染色效果好，學(xué)生容易掌握的特點(diǎn)，所需課時(shí)量?jī)H13課時(shí)。將石蠟切片技術(shù)與高校實(shí)驗(yàn)課程相結(jié)合，利于該技術(shù)在本科教學(xué)中廣泛推廣。

【關(guān)鍵詞】石蠟切片 釕紅染色法 本科教學(xué)

【基金項(xiàng)目】1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)教研項(xiàng)目“數(shù)字化植物教學(xué)標(biāo)本園建設(shè)”；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)教研項(xiàng)目“農(nóng)科類數(shù)字化實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心建設(shè)”。

【中圖分類號(hào)】G64 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-3089（2016）05-0172-02

石蠟切片是進(jìn)行組織學(xué)、生物學(xué)研究的常用實(shí)驗(yàn)方法。石蠟切片包括標(biāo)本采集固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、展片、烤片、烘片、脫蠟、染色、封片等一系列步驟制成透明的薄片，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，可以觀察植物組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。但因其制作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，一般不列為本科教學(xué)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。而石蠟切片技術(shù)應(yīng)用范圍廣、實(shí)用性強(qiáng)，所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良、簡(jiǎn)化其步驟，使這門技術(shù)可以更好的應(yīng)用到本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。

目前，各大高等院校對(duì)大學(xué)生動(dòng)手實(shí)踐能力的培養(yǎng)，已成為教育改革的重要內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)教學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐能力的重要手段，是理論課替代不了的。所以，將石蠟切片技術(shù)應(yīng)用到本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，對(duì)教育改革可以起到推動(dòng)作用。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)校園中的櫻花樹(shù)葉或者楊樹(shù)葉。

2.實(shí)驗(yàn)試劑和器材

無(wú)水乙醇、二甲苯、冰醋酸均為天津凱通生產(chǎn)

石蠟為SIGMA中國(guó)有限公司生產(chǎn)的蠟片，熔點(diǎn)52℃-56℃

中性樹(shù)膠為上海生工生產(chǎn)

卡諾固定液：無(wú)水乙醇：冰醋酸=3：1，于青霉素小瓶貯存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

明膠（粘片劑）：1g明膠溶于100ml蒸餾水放在36℃烘箱，全部溶解后，再加15ml甘油，2g石炭酸，完全溶解后，分成小瓶，儲(chǔ)存在細(xì)口瓶中備用。

釕紅染色液：0.04g釕紅固體染料溶解于200ml蒸餾水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

15ml注射器，用于快速抽氣。

以上所述溶劑都由實(shí)驗(yàn)老師提前配制準(zhǔn)備好。

3.實(shí)驗(yàn)儀器

半自動(dòng)石蠟切片機(jī)為浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)是YZB。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱為上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，型號(hào)是DHG-91435-11。

4.實(shí)驗(yàn)步驟

步驟1.取材固定

將新鮮材料剪成0.5cm見(jiàn)方的小塊，立即放入固定液中殺死固定，存于4℃冰箱固定12-24小時(shí)。此步驟于上一次實(shí)驗(yàn)課快要結(jié)束時(shí)進(jìn)行，耗時(shí)10min左右。

技術(shù)要點(diǎn)：

固定的目的是利用化學(xué)藥品將活細(xì)胞迅速殺死，使植物材料以保持固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)。所以，取材一定要新鮮、完整、快速，防止葉片失水過(guò)多，造成組織萎蔫變形，不利于觀察。

卡諾固定液中的冰醋酸滲透力強(qiáng)而快，能溶解脂肪，可保存蛋白質(zhì)不變質(zhì)，是染色體很好的保存劑，組織發(fā)脹，可阻止酒精、甲醛等引起的收縮，采用注射器抽氣可排除材料內(nèi)氣泡的干擾，加速固定液的滲透，更好的保存材料細(xì)胞的原有狀態(tài)。

注意事項(xiàng)：

（1）應(yīng)力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。

（2）組織塊不易過(guò)大過(guò)厚，必須小于2cm×1cm×0.5cm，尤其是組織塊厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。

（3）固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組織20倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。

（4）注射器抽氣時(shí)應(yīng)注意，不可抽取過(guò)度，保持抽取狀態(tài)30s，反復(fù)3次即可。

步驟2.清洗脫水

上午課時(shí)，上課教師指導(dǎo)學(xué)生將前一天實(shí)驗(yàn)課固定的材料70%酒精漂洗至無(wú)醋酸氣味，再移到70%酒精，靜置20min（期間經(jīng)?；蝿?dòng)）。然后依次換80%酒精20min→95%酒精（加署紅）20min→無(wú)水乙醇60min→無(wú)水乙醇60min→無(wú)水乙醇60min。此步驟需要耗時(shí)4課時(shí)，上課教師在實(shí)驗(yàn)間歇把本次試驗(yàn)的內(nèi)容、步驟、注意事項(xiàng)和意義向?qū)W生講解清楚。

技術(shù)要點(diǎn)：

脫水這一步至關(guān)重要，為了減少組織材料的急劇收縮，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行。而徹底脫水也是透明和浸蠟順利進(jìn)行的保證。

步驟3.透明浸蠟

下午課時(shí)，上課教師指導(dǎo)學(xué)生將材料依次更換：無(wú)水乙醇：二甲苯=3：1溶液 30min→無(wú)水乙醇：二甲苯=1：1溶液 30min→無(wú)水乙醇：二甲苯=3：1溶液 30min→100%二甲苯 20min→100%二甲苯 20min。然后加入與二甲苯等體積的的蠟片，置于42℃烘箱。本次實(shí)驗(yàn)耗時(shí)3課時(shí)，上課教師下課前要求學(xué)生晚9：00換蠟一次，換蠟后置于60℃烘箱，此后兩天內(nèi)上午和晚上各換蠟一次。

步驟4.包埋切片

上課時(shí)，上課教師先指導(dǎo)學(xué)生疊包埋用的紙船，然后進(jìn)行包埋。包埋好的蠟塊放事先預(yù)冷的冰水中，置于冰箱1h，然后進(jìn)行授課，將本節(jié)課的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容跟大家講解清楚，1h后取出進(jìn)行修塊、切片、貼片、展片、烤片后置于木質(zhì)切片架于烘箱中烘片，本次實(shí)驗(yàn)共計(jì)耗時(shí)約3課時(shí)。

技術(shù)要點(diǎn)：

本實(shí)驗(yàn)采用石蠟取代透明劑二甲苯，使石蠟浸入組織并起支持作用。以石蠟為媒介，使植物組織達(dá)到一定的硬度，可以通過(guò)切片機(jī)切成8um厚的蠟帶，將植物組織的結(jié)構(gòu)清晰的呈現(xiàn)出來(lái)。

注意事項(xiàng)：

（1）包埋時(shí)順時(shí)針輕輕搖晃盛有組織材料和石蠟的小瓶，將材料晃起，倒入紙船中，并將材料一字?jǐn)[開(kāi)，中間間隔適當(dāng)?shù)木嚯x，然后將紙船底部慢慢浸入事先準(zhǔn)備好的冷水中，不要完全浸沒(méi)，雙手捏緊紙船兩端，直至表層石蠟?zāi)?。?dòng)作要迅速，防止石蠟受冷凝固。

（2）包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的梯形，以利于下一步切片時(shí)形成蠟帶。

（3）粘片劑明膠不能過(guò)量，過(guò)量反而不粘

（4）展片時(shí)蠟片的光面向下，不要滴加太多水，蠟帶能夠完全展開(kāi)即可。

步驟4.染色封片

將烘好的片子通過(guò)染色盒進(jìn)行二甲苯脫蠟，無(wú)水乙醇2min→無(wú)水乙醇 2s→70%酒精1min→30%酒精1min→蒸餾水1min逐級(jí)復(fù)水，釕紅染色1min，再脫水透明，中性樹(shù)膠封片。

上課教師指導(dǎo)學(xué)生在普通光學(xué)顯微鏡下觀察制得的石蠟切片，觀察植物葉片的植物葉片的組織結(jié)構(gòu)，以及柵欄組織和海綿組織的區(qū)別，并繪制成圖，作為本次試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。本次課共計(jì)耗時(shí)3課時(shí)。

技術(shù)要點(diǎn)：

烘片后的切片需脫蠟及復(fù)水才能在水溶性染液中進(jìn)行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級(jí)經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。如果染料配制于酒精中，則將切片移至與酒精近似濃度時(shí)，即可染色。如果不經(jīng)過(guò)復(fù)水，材料脫蠟后直接進(jìn)入染色劑中，材料將會(huì)嚴(yán)重變形，甚至難以染色。

染色的目的是使細(xì)胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色和足夠強(qiáng)的差異以便于觀察。經(jīng)染色可顯示細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器及內(nèi)含物以及不同類型的細(xì)胞組織。本實(shí)驗(yàn)采用的釕紅主要染細(xì)胞間層，配置簡(jiǎn)單，染色穩(wěn)定，且染色時(shí)間短，顏色鮮明，不容易染色過(guò)度，染出來(lái)的切片植物組織結(jié)構(gòu)清晰，便于普通顯微鏡觀察。

注意事項(xiàng)：

（1）脫蠟及以后過(guò)程中，必須保證載玻片載有材料的一面，在玻片架上朝向一致。

（2）將載玻片從二甲苯中取出，務(wù)必使有材料的一面朝上。

（3）二甲苯極易揮發(fā)，載玻片從二甲苯中取出后要迅速滴膠，以免材料暴露于空氣中，吸收的水分而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

（4）注意中性樹(shù)膠的濃度，太稠時(shí)，用適量二甲苯稀釋。

（5）膠的數(shù)量以剛好不溢出蓋玻片為宜（200ul移液器滴加1滴）。

二、結(jié)論與分析

本實(shí)驗(yàn)共計(jì)耗時(shí)13課時(shí)，比較系統(tǒng)、連貫，而且步驟已簡(jiǎn)化，簡(jiǎn)單易操作，學(xué)生在短時(shí)間內(nèi)就能夠熟練掌握和操作。此方法將以前只能從書(shū)本上看到的植物顯微結(jié)構(gòu)，通過(guò)自己的雙手親自做出來(lái)，會(huì)使學(xué)生印象更加深刻。所以將石蠟切片技術(shù)應(yīng)用在學(xué)校的本科教學(xué)中，具有深遠(yuǎn)意義。

實(shí)驗(yàn)教學(xué)在大學(xué)教學(xué)過(guò)程中占據(jù)重要位置，是理論教學(xué)外培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐能力、創(chuàng)造能力的重要手段，也是輔助理論教學(xué)重要的一部分，實(shí)驗(yàn)教學(xué)使得課堂上講的內(nèi)容及方法能付于實(shí)踐，加深和鞏固課堂教學(xué)的內(nèi)容。

目前，各大學(xué)校本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程，普遍選用一些耗時(shí)短，簡(jiǎn)單的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，但一般實(shí)用性不強(qiáng)。而石蠟切片技術(shù)在學(xué)生繼續(xù)深造及今后的科研工作中大有裨益，所以在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中廣泛推廣石蠟切片這門應(yīng)用范圍廣、實(shí)用性強(qiáng)的常規(guī)技術(shù)在學(xué)校的本科教學(xué)中推廣勢(shì)在必行。

參考文獻(xiàn)：

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