柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因克隆及結(jié)構(gòu)預(yù)測

馬玉花，冶貴生，馬秀芳，李玉英，龍曉晨，馬娟，冶桂蓮

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧　810016)

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柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因克隆及結(jié)構(gòu)預(yù)測

馬玉花，冶貴生，馬秀芳，李玉英，龍曉晨，馬娟，冶桂蓮

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧810016)

摘要：【目的】 克隆得到柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因并預(yù)測其結(jié)構(gòu).【方法】 以柴達(dá)木盆地梭梭同化枝為材料，RT-PCR擴(kuò)增其AQP基因并進(jìn)行序列測定.【結(jié)果】 所得柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因的堿基數(shù)為481個(gè)，編碼160個(gè)氨基酸.AQP親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜螺旋區(qū)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示柴達(dá)木盆地梭梭AQP二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲.AQP有1個(gè) N-糖基化位點(diǎn)，2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)N-端豆蔻?；稽c(diǎn)， 1個(gè)微體細(xì)胞C端靶信號(hào)和1個(gè)白細(xì)胞介素10家族信號(hào).此外AQP蛋白的親水性較弱，具有3個(gè)跨膜螺旋區(qū).柴達(dá)木盆地梭梭AQP三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示其主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲互相盤繞而成，含有少量β折疊.【結(jié)論】 研究結(jié)果為下一步柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因的表達(dá)特性及功能研究提供了依據(jù).

關(guān)鍵詞：梭梭；AQP基因；擴(kuò)增；序列分析

梭梭(HaloxylonAammodendron)為藜科(Chenopodiaceae)梭梭屬(HaloxylonBunge)超旱生鹽生小喬木或大灌木，具有抗旱、耐鹽堿等生態(tài)適應(yīng)特征，廣泛分布于亞洲和非洲荒漠地區(qū)，是荒漠地區(qū)主要的建群種和優(yōu)良固沙植物.梭梭不僅是優(yōu)良的薪炭材料，也是荒漠草場主要的飼料樹種之一[1]，梭梭還是肉蓯蓉的寄主，因而對(duì)梭梭的研究和開發(fā)利用具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值.作為超旱生耐鹽植物[2]，關(guān)于梭梭抗逆研究主要集中在抗旱方面[3-5]，耐鹽機(jī)理方面的研究少有報(bào)道，而且主要集中在鹽處理對(duì)梭梭種子萌發(fā)、幼苗生長、單一生理生化指標(biāo)影響等研究[1,6-7]，對(duì)梭梭抗旱耐鹽相關(guān)基因的研究報(bào)道較少[8-12].

水通道蛋白(AQPs)是水選擇性通透的膜內(nèi)在蛋白，種子萌發(fā)、氣孔運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞伸長、生殖生長、韌皮部裝卸和植物應(yīng)激等生命過程都與水通道蛋白密切相關(guān).目前已在多種植物中發(fā)現(xiàn)了AQPs，研究表明植物通過調(diào)節(jié)AQPs的活性協(xié)同微調(diào)水分的跨膜運(yùn)輸，進(jìn)而維持高滲條件下的水分平衡以抵御各種逆境脅迫.目前有關(guān)梭梭AQP的研究尚未見報(bào)道.本文通過對(duì)柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因進(jìn)行克隆、序列分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，研究結(jié)果可為下一步梭梭AQP的功能研究奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

供試梭梭的種子采自青海省柴達(dá)木盆地，實(shí)驗(yàn)室育苗后取同化枝進(jìn)行總RNA的提取.RNA提取試劑盒為北京艾德來生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，ExTaq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司.

參照試劑盒說明提取梭梭總RNA.根據(jù)已發(fā)表的AQP基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，由大連寶生物工程有限公司合成，預(yù)期目的片段長度為481 bp.引物序列為：AQP-F：5′-CTYGTYTACTGCACHGCY-3′、AQP-R：5′-CCVACCCARAADATCCAN-3′.按試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min.PCR產(chǎn)物送交生物公司進(jìn)行序列測定，應(yīng)用DNASTAR軟件進(jìn)行序列分析，predictprotein預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性及分析蛋白修飾位點(diǎn)，用TMHMM進(jìn)行蛋白跨膜螺旋區(qū)分析，應(yīng)用I-Tasser在線服務(wù)器預(yù)測蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu).

2結(jié)果與分析

2.1梭梭總RNA提取

試劑盒提取獲得的梭梭總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到梭梭RNA電泳圖(圖1)，可見所得RNA條帶清晰，28S為18S的2倍，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求.

2.2梭梭AQP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

將AQP基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明AQP基因所在泳道出現(xiàn)目的條帶，大小與預(yù)期的481 bp長度相符(圖2).

圖1　柴達(dá)木盆地梭梭總RNA電泳圖Fig.1　Total RNA of Haoxylon ammodendron

圖2　AQP基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2　Amplified results of AQP gene

2.3AQP基因核苷酸序列和氨基酸序列分析

2.3.1核苷酸序列分析AQP基因核苷酸序列經(jīng)DNASTAR分析(表1)，結(jié)果表明AQP基因核苷酸序列長度為481 bp，T的含量較高，達(dá)到29.52%，基因序列中A+T的含量高于G+C的含量.

2.3.2氨基酸序列分析推導(dǎo)的AQP基因氨基酸序列經(jīng)DNASTAR軟件分析后表明(表2)，氨基酸序列長度為160 aa，分子質(zhì)量為17 026.84 U.各類氨基酸中堿性和酸性氨基酸的含量分別為7.5%和3.12%，疏水性和親水性氨基酸的含量分別為45%和21.25%.

表1　AQP基因核苷酸序列分析

表2　AQP氨基酸序列分析

2.3.3柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因與參考基因核苷酸序列和氨基酸序列比較結(jié)果將獲得的柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因與Genebank中登錄的擬南芥(Arabidopsisthaliana,NM100044.4)、甜菜(Betavulgarissubsp.vulgaris，NM001303070.1)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon,XM003563129.2)、甘草(Glycyrrhizauralensis,AY781788.1)、荷花(Nelumbonucifera,XM010257025.1)、煙草(Nicotianatabacum,BK008511.1)、桃(Prunuspersica,AF367460.1)、大果櫟(Quercusmacrocarpa,FJ495157.1)、Quercusmacrocarpa(FJ495159.1)、番茄(Solanumlycopersicum,AB845607.1)、龍葵(Solanumnigrum,GU575314.1)、獨(dú)腳金(Strigaasiatica,DQ445128.1)等植物進(jìn)行核苷酸與氨基酸序列比較，結(jié)果表明(圖3-4)所得梭梭AQP基因序列與非梭梭屬植物AQP基因序列間存在著豐富的變異，其核苷酸序列的同源性在71.7%～85%，氨基酸序列同源性在75%～91.9%，可見柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因與其他科屬植物的AQP基因存在這豐富的變異.

圖3　AQP基因核苷酸序列同源性Fig.3　The homology of AQP gene

圖4　AQP基因氨基酸序列同源百分比Fig.4　The percentage homology of AQP

2.4AQP蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

Predictprotein預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示梭梭AQP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋占42.5%，β折疊占8.75%，無規(guī)則卷曲占48.75%，可見α螺旋和無規(guī)則卷曲是梭梭AQP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件.用TMHMM預(yù)測梭梭AQP跨膜區(qū)，結(jié)果顯示AQP含三個(gè)跨膜螺旋的結(jié)構(gòu)(圖5).

圖5　梭梭AQP蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.5　Transmembrane structure prediction of AQP protein

Predictprotein對(duì)AQP進(jìn)行功能位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果表明，AQP具有1個(gè) N-糖基化位點(diǎn)，即135-138位的NKSK，其糖基化的連接點(diǎn)為天冬酰胺；2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，分別為119-121位的TLR，174-176位的TTK；4個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，分別為25-28位的TLSD，70-73位的SLLD，112-115位的SLGE，160-163位的SEFD； 2個(gè)N-端豆蔻酰化位點(diǎn)，分別為16-21位的GVAASR，154-159位的GVYKAM；1個(gè)微體細(xì)胞C端靶信號(hào)，175-177位的TKM；白細(xì)胞介素10家族信號(hào)，76-96位的KGYLGCQALSEMIQFYLEEVM.

Kyte-Doolittle方法預(yù)測結(jié)果顯示(圖6)，AQP的親水性較弱，分布區(qū)域較少，疏水性很強(qiáng)，具有多個(gè)連續(xù)疏水區(qū).在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，采用I-Tasser在線軟件對(duì)柴達(dá)木盆地梭梭AQP進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖7).預(yù)測結(jié)果顯示：AQP三維結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、無規(guī)則卷曲和少量β折疊盤繞而成.模型的C-score達(dá)到了1.41，說明所建模型可信度較高.

圖6　梭梭AQP親水性分析Fig.6　Hydrophilicity plot of AQP protein

圖7　梭梭AQP三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.7　The predicted 3D structure of AQP protein

3討論與結(jié)論

在水通道蛋白被發(fā)現(xiàn)之前，水分的跨膜運(yùn)輸被認(rèn)為是通過簡單擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)的[13].1988年Denker等第一次從人類紅細(xì)胞膜上純化分離水通道蛋白[14]，1991年P(guān)reston等完成了第一個(gè)水通道蛋白的克隆、氨基酸序列與蛋白結(jié)構(gòu)的研究，推測其可能是與水分運(yùn)輸相關(guān)的蛋白[15]，1992年進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證表明其在水分運(yùn)輸中發(fā)揮作用著重要的功能[16]，自此證實(shí)水分的跨膜運(yùn)輸是通過水通道蛋白實(shí)現(xiàn)的.

目前已證實(shí)水通道蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物、酵母、細(xì)菌及各種有機(jī)體中.植物水通道蛋白在植物應(yīng)對(duì)低溫、干旱、鹽堿等逆境脅迫時(shí)通過調(diào)控水分運(yùn)輸從而維持胞內(nèi)滲透壓而保證了植物在逆境脅迫下的生命活動(dòng)[17-20].由此可見植物能夠通過調(diào)節(jié)AQP的活性，從而使植物在逆境脅迫下保持細(xì)胞內(nèi)水分，在植物適應(yīng)極端環(huán)境中AQP起著重要的作用.

本文通過柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因的擴(kuò)增，并對(duì)AQP基因的序列進(jìn)行分析，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，旨在為柴達(dá)木盆地梭梭AQP的功能研究奠定基礎(chǔ)，并為梭梭抗旱、耐鹽機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)，為轉(zhuǎn)基因培育抗逆優(yōu)質(zhì)植物品種積累基因資源.所得柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因長度481 bp，編碼160個(gè)氨基酸.另外，將獲得的柴達(dá)木盆地梭梭AQP基因序列與NCBI登錄的其他植物進(jìn)行同源性比對(duì)分析，表明梭梭AQP基因核苷酸序列與不同科屬植物AQP基因的同源性在71.7%～85%，氨基酸序列同源性在75%～91.9%，可見不同植物AQP基因存在著核苷酸序列和氨基酸序列上豐富的變異，在保證蛋白必須結(jié)構(gòu)及相應(yīng)功能位點(diǎn)的穩(wěn)定基礎(chǔ)上又有非功能位點(diǎn)豐富的變異性，是不同植物適應(yīng)環(huán)境的表現(xiàn).

在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，由于α螺旋含有氫鍵不易形變，且其一側(cè)由親水性氨基酸組成，而另一側(cè)由疏水性氨基酸組成，因此使蛋白質(zhì)具有兩親的性質(zhì)，即α-螺旋的親水側(cè)形成空桶狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行水分的跨膜運(yùn)輸，而疏水的一側(cè)則通過疏水鍵與磷脂雙分子層作用而將蛋白固定在膜上，從而構(gòu)成了穩(wěn)定的跨膜結(jié)構(gòu)域以便進(jìn)行水分的跨膜運(yùn)輸.本研究中梭梭AQP具有大量的α螺旋，為梭梭AQP二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件，符合AQP作為水分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能特點(diǎn).此外AQP含有大量的無規(guī)則卷曲，而它們往往是構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異的功能部位，在蛋白功能執(zhí)行中起著重要的作用.此外，柴達(dá)木盆地梭梭AQP的疏水性較強(qiáng)，而親水性較弱，具有多個(gè)連續(xù)疏水區(qū)，疏水區(qū)可形成跨膜結(jié)構(gòu)域，與膜上的磷脂雙分子層緊密結(jié)合，從而形成跨膜通道進(jìn)行水分轉(zhuǎn)運(yùn)，跨膜區(qū)預(yù)測顯示AQP具有3個(gè)跨膜螺旋的結(jié)構(gòu)，為跨膜蛋白，符合跨膜蛋白疏水性較強(qiáng)的特征.

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(責(zé)任編輯李辛)

Gene clone and protein prediction ofAQPgene inHaloxylonammodendronin Qaidam basin

MA Yu-hua,YE Gui-sheng,MA Xiu-fang,LI Yu-ying,LONG Xiao-chen,MA Juan,YE Gui-lian

(College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining 810016,China)

Abstract：【Objective】 To clone the AQP gene and protein prediction of Haloxylon ammodendron .【Method】 The fragment of AQP gene of H.ammodendron in Qaidam basin was amplified by the specific primers and sequenced,then the nucleotide sequence and amino acid sequence of AQP gene was identified and summarized in this paper.【Result】 The sequence analysis indicated that the total length of AQP gene was 481 bp,which coding 160 AA.Predictions of hydrophilicity,secondary structure,transbilayer helix,tertiary structure showed that α-helix and random coil were the main secondary structure of AQP,AQP had 1 N-glycosylation sites,2 protein kinase C-phosphorylation site,4 casein kinase II phosphorylation sites,2 N-myristoylation sitess,1 microbodies C-terminal targeting signal,1 interleukin-10 family signature.AQP had a weaker hydrophilicity,and it had 3 transmembrane structures.The tertiary structure prediction showed the main tertiary structure of AQP include α-helix and random coil,and a small amount of β fold.【Conclusion】 This result will lay foundation for the further study of the structure of AQP gene and it's function of H.ammodendron.

Key words：Haloxylon ammodendron;AQP gene;amplification;sequence analysis

基金項(xiàng)目：青海省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012-Z-938Q)；“123高層次人才培養(yǎng)工程”項(xiàng)目.

收稿日期：2015-03-06；修回日期：2015-06-23

中圖分類號(hào)：Q 78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2016)02-0093-05

第一作者：馬玉花(1978-)，女，副教授，博士，主要從事森林培育理論與技術(shù)、植物資源開發(fā)利用方面的研究.E-mail:sophere8@163.com