miR-373-3p參與去甲腎上腺素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞RKO體外增殖的調(diào)控

馬瑞麗， 韓　佳， 侯　妮， 黃　辰,3*

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，西安　710061； 2西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部； 3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究中心；*通訊作者，E-mail：hchen@mail.xjtu.edu.cn)

?

miR-373-3p參與去甲腎上腺素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞RKO體外增殖的調(diào)控

馬瑞麗1,2， 韓佳1， 侯妮1， 黃辰1,3*

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，西安710061；2西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部；3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究中心；*通訊作者，E-mail：hchen@mail.xjtu.edu.cn)

摘要：目的確定miR-373-3p是否參與去甲腎上腺素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞RKO細(xì)胞增殖的調(diào)控。方法將結(jié)腸癌細(xì)胞RKO分為處理組和對(duì)照組，處理組細(xì)胞培養(yǎng)于含有終濃度10 μmol/L去甲腎上腺素的培養(yǎng)基中，對(duì)照組培養(yǎng)于正常培養(yǎng)基中，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的差異。使用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。通過RT-PCR檢測(cè)處理組細(xì)胞的miR-373-3p表達(dá)量。合成miR-373-3p的DNA抑制劑si-miR-373-3p，將其轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，觀察其對(duì)RKO細(xì)胞增殖的影響。采用SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果10 μmol/L去甲腎上腺素促進(jìn)RKO細(xì)胞的體外增殖(P<0.05)和遷移過程。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，處理組細(xì)胞S期和G2期比例均上升。處理組細(xì)胞miR-373-3p表達(dá)量上升(P<0.05)，轉(zhuǎn)染si-miR-373-3p的RKO細(xì)胞增殖受到抑制(P<0.05)。對(duì)轉(zhuǎn)染si-miR-373-3p的細(xì)胞，去甲腎上腺素不再促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)論miR-373-3p參與了去甲腎上腺素促進(jìn)的結(jié)腸癌細(xì)胞RKO的增殖過程。

關(guān)鍵詞：去甲腎上腺素；結(jié)腸癌；細(xì)胞增殖；miR-373-3p

結(jié)腸癌(colorectal cancer，CRC)是發(fā)生在結(jié)腸和直腸的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，為世界第三大高發(fā)癌癥，2012年結(jié)腸癌患者為354萬，因其死亡的人數(shù)69萬[1]。結(jié)腸癌的發(fā)生與基因突變、飲食、炎癥、生活方式等多種因素相關(guān)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素、去甲腎上腺素與癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Pu等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的遷移，并增加其抗藥性。Yang等[3]的研究表明，去甲腎上腺素可以通過誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)，參與到胃癌的發(fā)生過程中。Stock等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，去甲腎上腺素會(huì)阻滯胰腺癌細(xì)胞的遷移。這些研究說明，去甲腎上腺素參與到癌癥的發(fā)展中，但其在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制還有待于更進(jìn)一步的研究。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類進(jìn)化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，在真核生物中廣泛存在，主要由基因的內(nèi)含子部位剪切產(chǎn)生。已有的研究表明，miRNA的作用方式主要有兩種方式：當(dāng)其與目的蛋白的mRNA完全互補(bǔ)時(shí)，誘導(dǎo)目的蛋白降解；當(dāng)其與目的蛋白的mRNA不完全互補(bǔ)時(shí)，通過不完全的堿基配對(duì)，與目的蛋白mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄[5]，調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種功能。已有研究表明，miR-373作為促癌基因，作用于YOD1基因，促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)展[6]。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-373被組蛋白去乙?；聊?，在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[7]。本研究旨在觀察miR-373-3p是否參與由去甲腎上腺素介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞RKO增殖和遷移的過程。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株和主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞RKO由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。重酒石酸去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)購于美國Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipfectamine 2000 Transfection和RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Regent kit和real time PCR試劑盒SYBR premix EX TaqTM購于日本TaKaRa公司，引物和抑制劑由中國上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

按5 000個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行96孔板鋪板，12 h向培養(yǎng)基中加入NE，藥物終濃度為10 μmol/L，每組做5個(gè)復(fù)孔。加NE后24 h,48 h和72 h使用MTT法測(cè)定細(xì)胞數(shù)目。

1.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

按2×105/孔鋪6孔板，12 h用10 μl加液器吸頭劃線，并換培養(yǎng)基為含10 μmol/L NE和1%胎牛血清的培養(yǎng)基，分別于24 h,48 h和72 h觀察其劃痕愈合情況。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

按2×105/孔鋪6孔板，12 h時(shí)加入10 μmol/L NE，10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌2次，75%乙醇固定，用碘化丙啶染色，避光靜置30 min后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.5引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)miR-373-3p和U6的逆轉(zhuǎn)錄引物和實(shí)時(shí)定量PCR引物，以及DNA抑制劑si-miR-373-3p,序列見表1。

表1Real Time PCR所用引物序列及miR-373-3p抑制劑序列

Table 1Real time PCR primer sequence and miR-373-3p inhibitor sequence

名稱 序列(5'-3')miR-373-3pRT:GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCG-GCAATTGCACTGGATACGACACACCCCmiR-373-3pF:ATCCAGTGCGTGTCGTGmiR-373-3pR:TGCTGAAGTGCTTCGATTTTU6RT:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCATU6F:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAATU6R:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCATsi-miR-373-3pACACCCCAAAATCGAAGCACTTC

1.6RNA抽提和鑒定以及逆轉(zhuǎn)錄PCR獲取cDNA

按2×105/孔鋪6孔板，12 h時(shí)加入10 μmol/L NE，使用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使用Trizol試劑盒提取總RNA。分別利用miR-373-3p特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)參U6引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA，反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃保存。

1.7實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)miR-373-3p表達(dá)量變化

采用試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)， 設(shè)置U6作為內(nèi)參，檢測(cè)處理組和對(duì)照組miR-373-3p表達(dá)量，每組樣本均做3個(gè)重復(fù)。讀取RT-PCR反應(yīng)結(jié)果的Ct值，計(jì)算2-ΔΔCt分析比較樣品中miR-373-3p表達(dá)量的差異。

1.8si-miR-373-3p瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

按5 000個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行96孔板鋪板，鋪板12 h時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別設(shè)置陰性對(duì)照組，si-miR-373-3p組,si-miR-373-3p+NE組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。其中陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染的為亂序?qū)φ?，si-miR-373-3p組轉(zhuǎn)染si-miR-373-3p，si-miR-373-3p+NE組在轉(zhuǎn)染si-miR-373-3p 4 h后換液為含10 μmol/LNE的培養(yǎng)基。按照Lipfectamine 2000 Transfection 試劑盒要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加NE后24 h,48 h和72 h使用MTT法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1NE促進(jìn)RKO細(xì)胞增殖

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理組細(xì)胞增殖活性高于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，見圖1)。

2.2NE促進(jìn)RKO細(xì)胞遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μmol/L NE促進(jìn)細(xì)胞遷移(見圖2)。

圖1　NE對(duì)RKO細(xì)胞增殖的影響　Figure 1　Effects of NE on RKO proliferation

圖2　NE對(duì)RKO細(xì)胞遷移的影響Figure 2　Effects of NE on RKO cells migration

2.3NE對(duì)RKO細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，處理組細(xì)胞的S期比例上升(P<0.05)，G2期比例上升(見圖3)。

2.4NE使RKO細(xì)胞miR-373-3p表達(dá)量上調(diào)

RT-PCR結(jié)果顯示，處理組的細(xì)胞miR-373-3p的表達(dá)量上升，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，見圖4)。

2.5si-miR-373-3p抑制RKO細(xì)胞增殖

si-miR-373-3p組細(xì)胞與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比較，增殖活力下降(P<0.05)，si-miR-373-3p+NE組細(xì)胞增殖活力與陽性對(duì)照組相比顯著下降(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染si-miR-373-3p后細(xì)胞中miR-373-3p表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05，見圖5)。

圖3　NE對(duì)RKO細(xì)胞周期的影響Figure 3　Effects of NE on cells cycle distribution

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖4　NE對(duì)miR-373-3p表達(dá)量的影響Figure 4　Effects of NE on miR-373-3p expression in RKO cells

B. 轉(zhuǎn)染si-miR-373-3p后miR-373-3p的表達(dá)量與對(duì)照組比較，*P<0.05圖5　si-miR-373-3p，si-miR-373-3p+NE對(duì)RKO細(xì)胞增殖的影響Figure 5　Effects of si-miR-373-3p,si-miR-373-3p+NE on RKO cells proliferation

3討論

隨著醫(yī)學(xué)模式的改變，精神應(yīng)激與疾病的關(guān)系越來越引起人們的注意。精神應(yīng)激是指機(jī)體在各種內(nèi)外界環(huán)境及社會(huì)、心理因素刺激下所表現(xiàn)出的全身性非特異性反應(yīng)。面臨精神應(yīng)激時(shí)，機(jī)體的所有器官最終都會(huì)發(fā)生改變，但神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的改變是其他器官功能改變的先導(dǎo)和基礎(chǔ)。應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)內(nèi)分泌變化錯(cuò)綜復(fù)雜，但主要包括腎素-血管緊張素和HPA軸的激活，兒茶酚胺類物質(zhì)(腎上腺素和去甲腎上腺素)的增加是非常典型的表現(xiàn)之一[8]。去甲腎上腺素作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其在癌癥發(fā)展中的作用受到越來越多的研究。Fitzgerald等[9]和Pai等[10]的文章均發(fā)現(xiàn)，使用去甲腎上腺素削弱藥品的病人，其癌癥發(fā)生率下降，這提示去甲腎上腺素濃度升高可能是癌癥發(fā)生發(fā)展的原因之一。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去甲腎上腺素可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的體外增殖，劃痕實(shí)驗(yàn)顯示去甲腎上腺素促進(jìn)了RKO細(xì)胞的遷移，這與Shan等[11]在胃癌中的研究結(jié)果一致。細(xì)胞周期分析顯示處理組細(xì)胞S期和G2期均上升，說明其促進(jìn)DNA合成，加速了細(xì)胞分裂過程。進(jìn)一步證明去甲腎上腺素具有促進(jìn)RKO細(xì)胞體外增殖的功能。然而，其促進(jìn)細(xì)胞增殖的具體機(jī)制并不明確。

去甲腎上腺素與細(xì)胞膜上的β2受體結(jié)合后，通過G蛋白偶聯(lián)受體，引起cAMP濃度上升，激活cAMP依賴性蛋白激酶PKA，導(dǎo)致其下游的蛋白磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的各項(xiàng)功能[12]。CREB作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，被PKA激活后，進(jìn)入胞核內(nèi)，引起目的基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。Zhang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，CREB可以調(diào)控miR-373的表達(dá)，引起其下游基因TP53INP1，CD44等的表達(dá)量改變。據(jù)此，我們推測(cè)miR-373可能是去甲腎上腺素誘導(dǎo)的RKO細(xì)胞體外增殖的調(diào)控機(jī)制之一。

miR-373位于第19號(hào)染色體上，是miR-371-373家族中的一員，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系較為復(fù)雜，在不同的腫瘤中，其表達(dá)情況不盡相同，但在大部分腫瘤中，其與癌癥的發(fā)生發(fā)展是正相關(guān)的[14]。通過實(shí)時(shí)定量PCR，我們發(fā)現(xiàn)在處理組細(xì)胞中miR-373-3p的表達(dá)量顯著上調(diào)，初步說明miR-373-3p可能參與了去甲腎上腺素促進(jìn)的RKO細(xì)胞增殖的過程。為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-373-3p的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了miR-373-3p的抑制劑，將其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,結(jié)果表明，抑制劑組的細(xì)胞，其增殖活性明顯下降。對(duì)轉(zhuǎn)染過抑制劑的細(xì)胞，去甲腎上腺素不再促進(jìn)其細(xì)胞增殖。為了確保抑制效率，我們對(duì)轉(zhuǎn)染si-miR-373-3p的細(xì)胞進(jìn)行了總RNA抽提和RT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其miR-373-3p表達(dá)量顯著下調(diào)，說明抑制劑設(shè)計(jì)合理。這些結(jié)果表明，miR-373-3p的確參與了由去甲腎上腺素誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，去甲腎上腺素能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞RKO的體外增殖，且在其調(diào)控過程中有miR-373-3p的參與。我們推測(cè)miR-373-3p可能通過去甲腎上腺素-β2受體-cAMP-CREB-miR-373-3p-目的基因的通路，在RKO細(xì)胞的增殖過程中起到調(diào)控作用。這將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中深入研究，同時(shí)也將為癌癥的靶向治療提供新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]Stintzing S.Management of colorectal cancer[J].F1000Prime Rep,2014,6:108.

[2]Pu J,Bai D,Yang X,etal.Adrenaline promotes cell proliferation and increases chemoresistance in colon cancer HT29 cells through induction of miR-155[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,428:210-215.

[3]Yang R,Lin Q,Gao HB,etal.Stress-related hormone norepinephrine induces interleukin-6 expression in GES-1 cells[J].Braz J Med Biol Res,2014,47:101-109.

[4]Stock AM,Powe DG,Hahn SA,etal.Norepinephrine inhibits the migratory activity of pancreatic cancer cells[J].Exp Cell Res,2013,319:1744-1758.

[5]Okamura K,Phillips MD,Tyler DM,etal.The regulatory activity of microRNA* species has substantial influence on microRNA and 3′ UTR evolution[J].Nat Struct Mol Biol,2008,15:354-363.

[6]Wang LQ,Zhang Y,Yan H,etal.MicroRNA-373 functions as an oncogene and targets YOD1 gene in cervical cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,459:515-520.

[7]Seol HS,Akiyama Y,Shimada S,etal.Epigenetic silencing of microRNA-373 to epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer through IRAK2 and LAMP1 axes[J].Cancer Lett,2014,353:232-241.

[8]Eng JW,Kokolus KM,Reed CB,etal.A nervous tumor microenvironment: the impact of adrenergic stress on cancer cells,immunosuppression,and immunotherapeutic response[J].Cancer Immunol Immunother,2014,63:1115-1128.

[9]Fitzgerald PJ.Is norepinephrine an etiological factor in some types of cancer[J].Int J Cancer,2009,124:257-263.

[10]Pai PY,Hsieh VC,Wang CB,etal.Long term antihypertensive drug use and prostate cancer risk:A 9-year population-based cohort analysis[J].Int J Cardiol,2015,193:1-7.

[11]Shan T,Cui X,Li W,etal.Novel regulatory program for norepinephrine-induced epithelial-mesenchymal transition in gastric adenocarcinoma cell lines[J].Cancer Sci,2014,105:847-856.

[12]Siddiq MM,Hannila SS.Looking downstream:the role of cyclic AMP-regulated genes in axonal regeneration[J].Front Mol Neurosci,2015,8:26-32.

[13]Zhang Y,Yang J,Cui X,etal.A novel epigenetic CREB-miR-373 axis mediates ZIP4-induced pancreatic cancer growth[J].EMBO Mol Med,2013,5:1322-1334.

[14]Wei F,Cao C,Xu X,etal.Diverse functions of miR-373 in cancer[J].J Transl Med,2015,13:162-170.

The miR-373-3p participated in the regulation of norepinephrine(NE) on RKO proliferationinvitro

MA Ruili1,2, HAN Jia1, HOU Ni1, HUANG Chen1,3*

(1DepartmentofCellBiologyandGenetic,Xi’anJiaotongUniversityschoolofMedicine,Xi’an710061,China;2CollegeofBasicMedicalScience,Xi’anMedicalUniversity;3CardiovascularResearchCenter,Xi’anJiaotonguniversityschoolofMedicine;*Correspondingauthor,E-mail:hchen@mail.xjtu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo confirm whether miR-373-3p was involved in the regulation of norepinephrine(NE) on RKO proliferation in vitro. MethodsRKO cells were divided into NE group and control group. RKO cells were cultured in medium containing final concentration of 10 μmol/L NE in NE group and normal medium in control group. Cell proliferation was measured by MTT. Wound healing was used to observe the migration ability. Flow cytometry was adopted to analyze the change of cell cycle distribution. The level of miR-373-3p was detected by real-time PCR. The si-miR-373-3p was synthesized and then transfected into cells to observe its effect on cell proliferation. SPSS22.0 was chosen to analyze the data,and P<0.05 was considered as statistically significant difference.ResultsThe 10 μmol/L NE promoted proliferation(P<0.05) and migration ability of RKO cells in vitro. In NE group, the percentage of S phase and G2 phase cells were higher than in control group, and the relative expression of miR-373-3p was up-regulated(P<0.05). The si-miR-373-3p caused a decline of cell proliferation(P<0.05). NE didn’t promote the proliferation of RKO cells after transfected with si-miR-373-3p.ConclusionThe miR-373-3p may participate in the regulation of NE on RKO cells proliferation in vitro.

Key words:norepinephrine(NE);colorectal cancer;cell proliferation;miR-373-3p

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(31100969)

作者簡(jiǎn)介：馬瑞麗，女，1985-05生，本科，助理實(shí)驗(yàn)師，E-mail:mary3578@163.com

收稿日期：2016-03-03

中圖分類號(hào)：R735.35

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)05-0429-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.007