基于線粒體COⅠ和COⅡ基因的沙果小食心蟲與梨小食心蟲的分子鑒定

王　康，李玉婷，鄭　燕，段辛樂，張　蒙，彭　雄，陳茂華

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，植保資源與病蟲害治理教育部重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

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基于線粒體COⅠ和COⅡ基因的沙果小食心蟲與梨小食心蟲的分子鑒定

王康，李玉婷，鄭燕，段辛樂，張蒙，彭雄，陳茂華

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，植保資源與病蟲害治理教育部重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 建立基于線粒體COⅠ和COⅡ基因序列的沙果小食心蟲、梨小食心蟲分子鑒定方法?！痉椒ā?田間采集試蟲，利用PCR和基因測序技術(shù)，擴增2種食心蟲的線粒體COⅠ和COⅡ基因，將獲得的COⅠ和COⅡ基因序列在GenBank中進行BLAST比對，并通過GeneDoc軟件分析基因序列相似性，利用Mega 5.05軟件分別計算基于COⅠ和COⅡ基因序列的遺傳距離，并分別構(gòu)建COⅠ和COⅡ基因的系統(tǒng)發(fā)育樹?！窘Y(jié)果】 在分析的2種食心蟲樣本中，沙果小食心蟲COⅠ基因的種內(nèi)相似度在99.4%以上，梨小食心蟲COⅠ基因的種內(nèi)相似度在99.6%以上，2種食心蟲COⅠ基因的種間相似度為95.0%～95.6%；沙果小食心蟲COⅡ基因的種內(nèi)相似度在 99.0% 以上，梨小食心蟲COⅡ基因的種內(nèi)相似度在99.3%以上， 2種食心蟲COⅡ基因的種間相似度為94.6%～95.5%；2種食心蟲COⅠ基因種間存在30個穩(wěn)定變異位點，COⅡ基因種間有26個穩(wěn)定變異位點。2種食心蟲種內(nèi)遺傳距離為 0.001～0.006(COⅠ)和0.001～0.010(COⅡ)，種間遺傳距離為0.046～0.052(COⅠ)和0.047～0.057(COⅡ)，基于COⅠ和COⅡ基因的種間遺傳距離均顯著大于種內(nèi)遺傳距離。分別構(gòu)建COⅠ和COⅡ基因單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，在2個基因的系統(tǒng)發(fā)育樹上，2種食心蟲的基因序列分別位于不同的進化支，且置信度均達到100%，同種食心蟲的基因序列位于相同的進化枝?！窘Y(jié)論】 可以根據(jù)本研究所用的COⅠ和COⅡ基因序列的差異性，進行沙果小食心蟲和梨小食心蟲的分子鑒定。

[關(guān)鍵詞]沙果小食心蟲；梨小食心蟲；COⅠ基因；COⅡ基因；單倍型；分子鑒定

沙果小食心蟲(GrapholitadimorphaKomai)和梨小食心蟲(GrapholitamolestaBusck)是重要的蛀果害蟲，二者均屬于鱗翅目(Lepidoptera)卷蛾科(Tortricidae)。沙果小食心蟲寄主植物為蘋果、沙果、李等，在我國部分地區(qū)報道有發(fā)生[1-2]。梨小食心蟲又名東方果蛀蛾，寄主植物主要為桃、蘋果、梨、杏、李、山楂等，是世界性的主要蛀果害蟲之一，在我國分布廣泛[3]。沙果小食心蟲和梨小食心蟲經(jīng)?；旌习l(fā)生，而且發(fā)生期部分重疊，二者幼蟲和成蟲外部形態(tài)都非常相似，而且性信息素主要成分亦相似[4-5]，因此在田間調(diào)查和監(jiān)測種群動態(tài)時，準(zhǔn)確鑒定這2種食心蟲十分困難[1,6-7]。

基于PCR技術(shù)的分子鑒定可以檢測不同物種間及相同物種內(nèi)不同個體間的細微差異，這為物種鑒定提供了新的手段[8-10]。線粒體DNA具有基因序列相對保守、無重組和單拷貝、進化速率適中、易于檢測等優(yōu)點，因此常被應(yīng)用于昆蟲的分子鑒定與系統(tǒng)進化研究之中，其中線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)和線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅱ(COⅡ)等基因應(yīng)用較為廣泛[11-12]。常虹等[13]基于線粒體COⅠ基因構(gòu)建了齒小蠹屬(Ips)昆蟲的快速鑒定方法，很好地解決了植物檢疫中截獲的齒小蠹幼蟲或殘缺成蟲的鑒定難問題；游中華等[14]報道了基于線粒體COⅠ基因的9種薊馬的分子鑒定方法；通過COⅠ基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，弄蝶(Astraptesfulgerator)是由多個物種組成的混合種[15]；王戎疆等[16]利用線粒體COⅡ基因構(gòu)建蛺蝶屬(Polyura) 5種蝴蝶的系統(tǒng)發(fā)育樹并進行聚類關(guān)系分析，結(jié)果和形態(tài)學(xué)結(jié)果相一致；楊飛龍等[17]通過比較大量中華按蚊(Anophelessinensis)標(biāo)本的COⅠ、COⅡ基因及幾種核糖體基因序列，建立了該蟲基于COⅡ等基因的分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

本研究從田間采集沙果小食心蟲和梨小食心蟲試蟲，提取試蟲的基因組DNA，PCR擴增試蟲的線粒體COⅠ和COⅡ基因序列，并對擴增的序列進行測序，以此建立沙果小食心蟲和梨小食心蟲分子鑒定方法，為這2種害蟲的準(zhǔn)確鑒定及預(yù)測預(yù)報提供了重要依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣本采集

利用沙果小食心蟲(GrapholitadimorphaKomai)和梨小食心蟲(GrapholitamolestaBusck)信息素誘捕器(誘捕器為三角膠粘式，購自北京中捷四方生物科技公司)，在2種害蟲的發(fā)生期，于陜西省的5個蘋果園，分別誘集2種食心蟲成蟲樣本(表1)。誘芯的載體中空，由硅橡膠制成，每個質(zhì)量0.3～0.5 g，每個誘芯的性信息素含量不低于0.001 g，純度90%～97%。選擇較為完整的試蟲，在實驗室利用體視顯微鏡進行準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定后的樣本保存于無水乙醇中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1　沙果小食心蟲和梨小食心蟲樣本的采集信息

1.2基因組DNA提取

在采集的樣本中，隨機選取沙果小食心蟲和梨小食心蟲樣本，利用EasyPureTMGenomic DNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取單頭試蟲基因組DNA，基因組DNA的提取方法按照試劑盒說明書步驟進行，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質(zhì)量，提取的基因組DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴增及序列測定

參照已有的報道，選用擴增2種食心蟲COⅠ和COⅡ基因的引物[18]，稍作修改。擴增2種食心蟲COⅠ基因的上、下游引物序列分別為：5′-CAA-CATTTATTTTGATTTTTTGG-3′，5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′；擴增2種食心蟲COⅡ基因的上、下游引物序列分別為：5′-ATG-GCAGATTATATGTAATGG-3′，5′-GTTTAAG-AGACCAGTACTTG-3′。

PCR擴增反應(yīng)總體系為25 μL，其中含2×PCR master mix 12.5 μL，上、下游引物各3 μL，DNA模板2 μL(含20～50 ng DNA)，加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，(CO Ⅰ 基因：52 ℃/CO Ⅱ 基因：57 ℃)退火延伸30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

將擴增的PCR產(chǎn)物直接進行測序，測序由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.4序列分析

將所測2種食心蟲COⅠ和COⅡ基因在GenBank中進行BLAST搜索，并將獲得的COⅠ和COⅡ基因登錄到GenBank。通過GeneDoc軟件分析基因序列相似性，利用Mega 5.05軟件中的Kimura2-parameter(K2P)雙參數(shù)模型計算遺傳距離，并利用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

2結(jié)果與分析

2.12種試蟲線粒體COⅠ和COⅡ基因序列分析

在所有沙果小食心蟲和梨小食心蟲試蟲中都成功擴增到線粒體COⅠ和COⅡ基因序列，其中COⅠ基因序列長度為720 bp，COⅡ基因序列長度為682 bp，所有序列均無堿基插入和缺失。將所獲得的序列在GenBank中進行BLAST分析，結(jié)果顯示，本研究獲得的沙果小食心蟲COⅠ基因和COⅡ基因序列與GenBank中登錄的沙果小食心蟲COⅠ基因(登錄號：AB603522)和COⅡ基因(登錄號：JQ404438)對應(yīng)序列的相似性分別為99.17%～99.31%和 99.19%～100%；測序獲得的梨小食心蟲COⅠ基因和COⅡ基因序列與GenBank中登錄的梨小食心蟲線粒體全基因組(登錄號：HQ116416)上對應(yīng)的COⅠ基因和COⅡ基因序列的相似性分別為 99.72%～100%和99.56%～100%。

沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅠ和COⅡ基因序列的比對結(jié)果分別見圖1和圖2。供試樣本共獲得3個沙果小食心蟲COⅠ基因單倍型(GenBank登錄號：KC923197～KC923199)，這3個單倍型在4個堿基位點上具有多態(tài)性，3個單倍型之間的相似度在99.4%以上。供試樣本共獲得6個梨小食心蟲COⅠ基因單倍型(GenBank登錄號：KC923200～KC923205)，6個單倍型在5個堿基位點上具有多態(tài)性，6個單倍型之間的相似度在99.6%以上。沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅠ基因種間的相似度在95.0%～95.6%，COⅠ基因在2種食心蟲之間存在30個變異位點(圖1，表2)。

供試樣本共獲得4個沙果小食心蟲COⅡ基因單倍型(GenBank登錄號：KC923206～KC923209)，這4個單倍型在7個堿基位點上具有多態(tài)性，4個單倍型之間的相度在99.0%以上(表3)。

圖 1沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅠ基因序列比對

黑色顯示種間變異位點，下圖同

Fig.1Alignment of COⅠ sequences ofGrapholitadimorphaandGrapholitamolesta

The interspecific variation loci are indicated by black color.the same below

圖 2沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅡ基因序列比對

Fig.2Alignment of COⅡ sequences ofGrapholitadimorphaandGrapholitamolesta

供試樣本共獲得8個梨小食心蟲COⅡ基因單倍型(GenBank登錄號：KC923210～KC923217)，這8個單倍型在8個堿基位點上具有多態(tài)性，8個單倍型之間的相似度在99.3%以上。沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅡ基因種間的相似度在94.6%～95.5%，種間存在26個變異位點(圖2，表3)。

2.22種試蟲遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

由表2可以看出，沙果小食心蟲COⅠ基因序列間的遺傳距離在0.001～0.006，梨小食心蟲COⅠ基因序列間的遺傳距離在0.001～0.004，2種食心蟲COⅠ基因種間遺傳距離為0.046～0.052，種間遺傳距離顯著高于種內(nèi)遺傳距離(df=29,t=2.05，P<0.001)。

由表3可以看出，COⅡ基因中，沙果小食心蟲序列間遺傳距離在0.001～0.010，梨小食心蟲序列間遺傳距離在0.001～0.007，2種食心蟲COⅡ基因種間序列遺傳距離在0.047～0.057，種間遺傳距離顯著高于種內(nèi)遺傳距離(df=58,t=2.00，P<0.001)。

表 2　沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅠ基因單倍型間的相似度和遺傳距離

注：對角線上方為單倍型間相似度(%)，對角線下方為單倍型間遺傳距離。GD1～GD3為沙果小食心蟲COⅠ基因單倍型，其GenBank登錄號依次為KC923197～KC923199；GM1～GM6是梨小食心蟲COⅠ基因單倍型，其GenBank登錄號依次為KC923200～KC923205。

Note:The similarities between haplotypes (%) are above the diagonal,and the genetic distances between haplotypes are below the diagonal.GD1-GD3 are haplotypes ofG.dimorphaCOⅠ gene (GenBank accession No:KC923197-KC923199),and GM1-GM6 are the haplotypes ofG.molestaCOⅠ gene (GenBank accession No:KC923200-KC923205).

表 3　沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅡ基因單倍型間的相似度和遺傳距離

注：對角線上方為單倍型間相似度(%)，對角線下方為單倍型間遺傳距離。GD1～GD4為沙果小食心蟲COⅡ基因單倍型，其GenBank登錄號依次為KC923206～KC923209；GM1～GM8是梨小食心蟲COⅡ基因單倍型，GenBank登錄號依次為KC923210～KC923217。

Note:The similarities between haplotypes (%) are above the diagonal,and the genetic distances between haplotypes are below the diagonal.GD1-GD4 are haplotypes ofG.dimorphaCOⅡ gene (GenBank accession No:KC923206-KC923209),and GM1-GM8 are the haplotypes ofG.molestaCOⅡ gene (GenBank accession No:KC923210-KC923217).

以蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)COⅠ基因序列(GenBank登錄號：JQ928797)作外類群，將本研究獲得的沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅠ基因單倍型序列和1個已登錄的沙果小食心蟲COⅠ基因序列(GenBank登錄號：AB603522)，以及3個已登錄的梨小食心蟲COⅠ基因序列(GenBank登錄號：AB603521、FJ449660、HQ700338)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖3)顯示，沙果小食心蟲和梨小食心蟲的COⅠ基因單倍型各自聚在一支。

以蘋果蠹蛾(C.pomonella)線粒體全基因(GenBank登錄號：JX407107)中COⅡ基因序列作外類群，將本研究獲得的2種食心蟲COⅡ基因單倍型序列和已登錄的相應(yīng)沙果小食心蟲COⅡ基因序列(GenBank登錄號：JQ404438)和梨小食心蟲COⅡ基因序列(GenBank登錄號：EU671060)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖4)表明，所有的沙果小食心蟲COⅡ基因單倍型聚為一支，所有的梨小食心蟲單倍型聚為另外一支。

圖 3　基于沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅠ基因單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹GD1～GD3和GM1～GM6為本研究獲得的沙果小食心蟲和梨小食心蟲COⅠ基因單倍型；AB603522為GenBank已登錄的相應(yīng)沙果小食心蟲COⅠ基因序列；AB603521、FJ449660、HQ700338為GenBank已登錄的相應(yīng)梨小食心蟲COⅠ序列；JQ928797為GenBank已登錄的相應(yīng)蘋果蠹蛾COⅠ基因序列

3討論

線粒體COⅠ和COⅡ基因序列目前已廣泛地應(yīng)用到昆蟲近緣種的鑒定之中[20]。在利用線粒體基因進行分子鑒定時，不同物種間相同的線粒體基因核苷酸序列差異是最重要的標(biāo)準(zhǔn)[21-22]。Hebert等[23]通過分析比較200種鱗翅目昆蟲COⅠ基因序列后發(fā)現(xiàn)，COⅠ基因核苷酸序列3%的差異可以作為鑒定不同物種的標(biāo)準(zhǔn)，即不同物種COⅠ基因差異大于3%，同一物種COⅠ基因序列差異小于3%，目前大量的相關(guān)研究證實了這一標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性[24-25]。本研究中，2種食心蟲COⅠ和COⅡ基因種內(nèi)核苷酸差異小于1.0%，而種間核苷酸差異大于4.4%，因此本研究的COⅠ和COⅡ基因序列可以準(zhǔn)確地應(yīng)用于沙果小食心蟲和梨小食心蟲的分子鑒定中。

Aliabadian等[26]研究指出，當(dāng)種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離不存在重疊區(qū)域，且分離程度較高時，目標(biāo)片段能準(zhǔn)確鑒定物種。本研究結(jié)果顯示，基于COⅠ和COⅡ基因的沙果小食心蟲和梨小食心蟲的種內(nèi)遺傳距離均小于0.010，而種間遺傳距離大于0.046，基于COⅠ和COⅡ基因的種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離不存在重疊區(qū)域，并且種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離差異顯著(P<0.001)。另外，有分析認為，種間平均遺傳距離一般為種內(nèi)平均遺傳距離的10倍以上[27]，本研究基于COⅠ基因的種間平均遺傳距離(0.050 0)為種內(nèi)平均遺傳距離(0.002 7)的18.2倍，基于COⅡ基因的種間平均遺傳距離(0.050 6)為種內(nèi)平均遺傳距離(0.003 8)的13.2倍。因此，基于COⅠ和COⅡ基因的沙果小食心蟲和的梨小食心蟲種間和種內(nèi)遺傳距離分析結(jié)果表明，COⅠ和COⅡ基因可以用于這2種食心蟲的分子鑒定。另外，穩(wěn)定的種間差異位點是確定種的重要手段。朱振華等[28]通過比較6種果實蠅mtCytb基因序列，發(fā)現(xiàn)種間存在30個比較穩(wěn)定的變異位點，并以此作為鑒定不同種的標(biāo)準(zhǔn)。本試驗發(fā)現(xiàn)，2種食心蟲在COⅠ基因序列上有30個穩(wěn)定變異位點，COⅡ基因序列上有26個穩(wěn)定差異位點，這些位點的堿基及其變化可以作為梨小食心蟲和沙果小食心蟲分子鑒定時的重要參考。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，沙果小食心蟲、梨小食心蟲的COⅠ和COⅡ基因種內(nèi)的相似度在99.0%以上，種間相似度在95.6%以下，且2個基因的種間遺傳距離顯著高于種內(nèi)遺傳距離，2種食心蟲的COⅠ基因單倍型和COⅡ基因單倍型分別在系統(tǒng)發(fā)育樹上明顯各自聚為一支，因此，本研究采用的沙果小食心蟲、梨小食心蟲的COⅠ和COⅡ基因可以用于這2種害蟲的分子鑒定之中。

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Molecular identification ofGrapholitadimorphaKomai (Lepidoptera:Tortricidae) andGrapholitamolestaBusck (Lepidoptera:Tortricidae) based on mitochondrial COⅠ and COⅡ genes

WANG Kang，LI Yu-ting，ZHENG Yan，DUAN Xin-le，ZHANG Meng，PENG Xiong，CHEN Mao-hua

(CollegeofPlantProtection,KeyLaboratoryofCropPestIntegratedPestManagementontheLoessPlateauofMinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofPlantProtectionResourcesandPestManagementofMinistryofEducation,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to establish a method for identifing Grapholita dimorpha Komai and Grapholita molesta Busck based on mitochondrial COⅠ and COⅡ genes.【Method】 PCR and gene sequencing methods were used to obtain COⅠ and COⅡ sequences from the samples of the two species collected from apple orchards.The acquired COⅠ and COⅡ sequences were verified by BLAST program in GenBank.GeneDoc was also used to analyze the similarity between the obtained sequences.Mega 5.05 was used to analyze the genetic distances between sequences and to construct the phylogenetic trees of COⅠ and COⅡ gene haplotypes,respectively.【Result】 The intraspecific similarities of COⅠ sequences of G.dimorpha and G.molesta were above 99.4% and 99.6%,respectively,whilst the interspecific similarity of COⅠ gene sequences between them was 95.0%-95.6%.The intraspecific similarities of COⅡ sequences of G.dimorpha and G.molesta were above 99.0% and 99.3%,while its interspecific similarity between them was 94.6%-95.5%.A total of 30 variable sites were detected in COⅠ gene sequences from samples of the two species,and 26 were detected in COⅡ sequences.The intraspecific genetic distances were 0.001-0.006 (COⅠ) and 0.001-0.010 (COⅡ),whereas the interspecific genetic distances were 0.046-0.052 (COⅠ) and 0.047-0.057 (COⅡ).The interspecific genetic distance was significantly higher than intraspecific genetic distance.Phylogenetic trees based on COⅠ gene haplotypes and COⅡ gene haplotypes indicated that gene sequences from the same species were clustered in the same branch,whereas gene sequences from different species were clustered in different branches, with the bootstrap value of 100%.【Conclusion】 The COⅠ and COⅡ gene sequences used in this study can be applied in the molecular identification of G.dimorpha and G.molesta.

Key words:Grapholita dimorpha;Grapholita molesta;COⅠ gene;COⅡ gene;haplotypes;molecular identification

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.022

[收稿日期]2014-06-30

[基金項目]國家自然科學(xué)基金項目(31071687)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(博導(dǎo)類)項目(20110204110001)；西北農(nóng)林科技大學(xué)人才引進項目；國家科技支撐計劃項目(2012BAK11B03)

[作者簡介]王康(1989-)，男，陜西咸陽人，在讀碩士，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲和害蟲防治研究。E-mail:kangwang@nwsuaf.edu.cn[通信作者]陳茂華(1971-)，男，湖北武漢人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事昆蟲種群遺傳學(xué)和分子毒理學(xué)研究。

[中圖分類號]S763.42；Q78

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)02-0156-09

E-mail:maohua.chen@nwsuaf.edu.cn