松墨天牛核糖體蛋白(RPS15A)cDNA的克隆及農(nóng)藥脅迫對(duì)其表達(dá)的影響

羅淋淋,蔡紫玲,林　同

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院,廣東 廣州 510642)

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松墨天牛核糖體蛋白(RPS15A)cDNA的克隆及農(nóng)藥脅迫對(duì)其表達(dá)的影響

羅淋淋,蔡紫玲,林同

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院,廣東 廣州 510642)

[摘要]【目的】 研究不同類型農(nóng)藥脅迫下松墨天牛核糖體蛋白基因表達(dá)的變化，為靶標(biāo)防治松樹重要害蟲松墨天牛提供理論依據(jù)和參考?！痉椒ā?從構(gòu)建的松墨天牛 cDNA 文庫中獲得表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，用 Blast 程序從GenBank數(shù)據(jù)庫中查找同源序列，克隆得到松墨天牛的一個(gè)核糖體蛋白基因；用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR) 檢測(cè) 11 種農(nóng)藥脅迫下該基因的表達(dá)?！窘Y(jié)果】 從松墨天牛 cDNA 文庫中獲得1條 EST 序列與昆蟲核糖體蛋白 S15A (RPS15A)同源的基因，命名為MaRPS15A。MaRPS15A cDNA長504 bp，含有 5′、 3′ 非編碼區(qū)和長 393 bp 的開放閱讀框，編碼 130個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為 14.75 ku，理論等電點(diǎn)為 9.95。MaRPS15A與赤擬谷盜(Tribolium castaneum)核糖體蛋白R(shí)PS15A的相似性為98%，與其他昆蟲核糖體蛋白R(shí)PS15A的相似性大于88%。除溴氰菊酯外，其他農(nóng)藥脅迫導(dǎo)致MaRPS15A相對(duì)表達(dá)量下降。【結(jié)論】 成功克隆了松墨天牛核糖體蛋白基因MaRPS15A (GenBank登錄號(hào):KJ930032)。大多數(shù)農(nóng)藥抑制了MaRPS15A的表達(dá)，表明松墨天牛受到了不利影響。

[關(guān)鍵詞]松墨天牛；核糖體蛋白；RPS15A；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR)；農(nóng)藥脅迫

核糖體(Ribosome)是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成的重要細(xì)胞器。在真核生物中，核糖體由一個(gè) 60S 大亞基和一個(gè) 40S 小亞基組成。其中，大亞基約包含 49 種蛋白質(zhì)，此外還有28S rRNA、5S rRNA和5.8S rRNA 3種rRNA；小亞基約包含 34 種蛋白質(zhì)和一種 18S rRNA[1-2]。核糖體蛋白 (Ribosomal protein，RP) 和核糖體研究一直是遺傳學(xué)研究的重要領(lǐng)域。RPS15A 是 40S 小亞基的組成成分之一，屬于核糖體蛋白 S8P 家族，它位于細(xì)胞質(zhì)中，是高度保守的核糖體蛋白。松墨天牛(MonochamusalternatusHope)又名松褐天牛、松天牛，是我國松樹的重要蛀干害蟲，也是毀滅性病害松材線蟲病(Bursaphelenchusxylophilus) 的主要媒介昆蟲。本研究從松墨天牛 cDNA 文庫中克隆到了松墨天牛的一個(gè) RP 基因，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)，分析農(nóng)藥對(duì)松墨天牛核糖體蛋白基因表達(dá)的影響，旨在為松墨天牛的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

松墨天牛幼蟲由廣東省林業(yè)科學(xué)研究院惠贈(zèng)，在人工氣候箱設(shè)置溫度為 25 ℃、相對(duì)濕度為 75%、黑暗條件下，用人工飼料飼喂至成蟲[3]。

Total RNA KitⅡ總RNA 提取試劑盒，購自 OMEGAS 生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR染料法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM，均購自TaKaRa生物有限公司。

1.2基因克隆和 RT-qPCR引物設(shè)計(jì)

從松墨天牛幼蟲 cDNA 文庫[4]中隨機(jī)挑選陽性克隆測(cè)序，獲得表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags,ESTs)，通過 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 的 Blast程序搜索獲取核糖體蛋白基因。根據(jù)獲得的目的基因序列使用 Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物是：5′-GGGAAGATCGTTGTGAATTTG-3′，下游引物是： 5′-GGATTTTGCCTCCCAGATGT-3′，產(chǎn)物長度202 bp；內(nèi)參基因上游引物是：5′-CTCTGCTATGTAGCCCTTGACTT-3′，下游引物是：5′-GGAGTTGTAGGTGGTTTCGTG-3′。引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3農(nóng)藥處理

用7種化學(xué)農(nóng)藥和4種生物農(nóng)藥，分別作用于松墨天牛成蟲，農(nóng)藥規(guī)格、稀釋倍數(shù)和處理方法見表1。

表 1　供試農(nóng)藥規(guī)格及稀釋倍數(shù)

每種農(nóng)藥處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭試蟲，每個(gè)處理試蟲受藥12 h后，用液氮速凍，于-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4RT-qPCR檢測(cè)

以目標(biāo)基因在對(duì)照組 (未做處理的試蟲) 的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量，以微管蛋白 (β-actin) 基因(GenBank登錄號(hào):JZ143740) 為內(nèi)參基因，無菌超純水為陰性對(duì)照，用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)基因在11種農(nóng)藥脅迫后的相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，cDNA樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后采集目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的CT平均值，利用 2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[5]。

1.5克隆基因序列分析及其編碼蛋白性質(zhì)預(yù)測(cè)

用NCBI在線工具ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nib.gov/gorf/grof.html)進(jìn)行DNA序列開放閱讀框(ORF)查找；用ExPASyProtParam工具 (http://www.expasy.org/) 進(jìn)行蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分子質(zhì)量、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)等分析；用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)；用Clustal X和MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (NJ 法)。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003和DPS-6.5軟件的Duncan’s單因素方差分析法對(duì)RT-qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[6]。

2結(jié)果與分析

2.1松墨天牛MaRPS15A基因及序列分析

對(duì)松墨天牛幼蟲cDNA 文庫中的陽性克隆隨機(jī)測(cè)序獲得 EST序列，通過 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的 Blast 程序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在這些 EST 序列中，有1 條長度為 504 bp 的序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的昆蟲 40S 核糖體蛋白 S15A 相似，將該基因命名為MaRPS15A，GenBank登錄號(hào)為KJ930032。MaRPS15A基因從第 81-473 位核苷酸為開放閱讀框(ORF)(圖1)，長393 bp，編碼 130 個(gè)氨基酸，5′非編碼區(qū)(5′-UTR) 長度為 80 bp，3′非編碼區(qū) (3′-UTR) 長度為31 bp，在3′-UTR有典型的加尾信號(hào)aataaa，這是 mRNA 前體在翻譯后剪切所需要的。

圖 1松墨天牛MaRPS15A基因核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列起始密碼子atg用波浪線表示，絲氨酸和酪氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)分別以圓形和下劃線標(biāo)注，N-糖基化位點(diǎn)用三角形表示，終止密碼子用星號(hào)標(biāo)注，加尾信號(hào)aataaa加框標(biāo)注

Fig.1Nucleotides and deduced amino acid sequence ofMaRPS15AfromMonochamusalternatusThe translation start codon is indicated with wavy line,the serine sites are marked with circles and the tyrosine phosphorylation site is underlined,the glycosylation site is marked with triangle,the stop codon is marked with asterisk,and the polyadenylation signal is in rectangular

由ORF 核苷酸序列推測(cè)得到的 MaRPS15A 蛋白的分子式為C662H1 070N190O177S7，分子質(zhì)量為 14.75 ku，理論等電點(diǎn)為9.95，為堿性蛋白。疏水性分析顯示，平均親水性結(jié)果為-0.090，為兩性蛋白，MaRPS15A在29-48位氨基酸含有最強(qiáng)的疏水性區(qū)域；跨膜位點(diǎn)分析顯示，MaRPS15A 在29-48 位氨基酸之間存在 1 個(gè)從內(nèi)向外的跨膜位點(diǎn)，與該蛋白質(zhì)的疏水性區(qū)域分析結(jié)果一致；MaRPS15A蛋白性質(zhì)分析顯示，不穩(wěn)定指數(shù)為 35.22，屬于穩(wěn)定蛋白；MaRPS15A包含 2 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、1 個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和1 個(gè) N-糖基化位點(diǎn)。

2.2松墨天牛MaRPS15A相似性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

用DNAMAN 軟件對(duì)MaRPS15A氨基酸序列的相似性比對(duì)的結(jié)果見圖2。

圖 2松墨天牛MaRPS15與其他19種昆蟲RPS15A氨基酸序列的比對(duì)

圖中不同顏色陰影部分強(qiáng)調(diào)序列的相似性，黑色.相似性=100%；灰色.相似性 75%；白色.相似性 50%

Fig.2Amino acid sequence alignment of MaRPS15 and RPS15A fromMonochamusalternatusand other 19 of insects Different colors in the shadow highlight homology level,Black.Homology level=100%;Gray.Homology level=75%;White.Homology level=50%

圖2表明，MaRPS15A 與來源于GenBank數(shù)據(jù)庫的19 種昆蟲核糖體蛋白 RPS15A 相似性達(dá)到88%～98%，其中，與赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)、櫟實(shí)象鼻蟲 (Curculioglandium) 和白楊葉甲(Chrysomelatremulae) 等的相似性為98%，與黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster) 和家蠶 (Bombyxmori) 相似性分別為 95% 和 94%。用以上相同的基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，所有的昆蟲 RPS15A 起源于一個(gè)共同的祖先蛋白，首先進(jìn)化出 2 個(gè)原始分支，其中節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱無甲目鹵蟲(Artemiafranciscana) 單獨(dú)一個(gè)進(jìn)化分支；其他都屬于昆蟲綱，聚合成另一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支。其中松墨天牛與櫟實(shí)象鼻蟲在同一分支下，與白楊葉甲和赤擬谷盜親緣關(guān)系比較近，與蟻類(佛羅里達(dá)弓背蟻(Camponotusfloridanus)、切葉蟻 (Acromyrmexechinatior)、印度跳蟻 (Harpegnathossaltator)) 和蜂類(麗蠅蛹集金小蜂(Nasoniavitripennis)、茶足柄瘤蚜繭蜂 (Lysiphlebustestaceipes)) 親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)(圖3)。

2.3農(nóng)藥脅迫下松墨天牛MaRPS15A的表達(dá)

利用RT-qPCR分析了松墨天牛成蟲MaRPS15A基因在11種農(nóng)藥脅迫下的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖4。由圖4可見，以未處理組成蟲MaRPS15A基因的表達(dá)量為對(duì)照，殺蟲劑處理組的結(jié)果為：溴氰菊酯處理組MaRPS15A表達(dá)上調(diào)，相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的1.101倍，其余10個(gè)處理組MaRPS15A表達(dá)均下調(diào)，殺蟲雙、毒死蜱、氯氰菊酯、啶蟲脒、滅多威、噻蟲啉、印楝素、綠僵菌、白僵菌、Bt脅迫下MaRPS15A的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的30.39%,40.68%,66.65%,19.92%,14.50%,92.90%,54.79%,16.85%,52.00% 和42.19%。各處理間的相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P<0.5)。

圖 3　基于RPS15A氨基酸序列構(gòu)建的松墨天牛與其他19種昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖 4　農(nóng)藥脅迫下松墨天牛成蟲MaRPS15A基因的相對(duì)表達(dá)量

3討論

真核生物核糖體由 4 種 RNA 和大約 80 種核糖體蛋白組成。除了在蛋白質(zhì)合成和調(diào)控中發(fā)揮基本功能外，核糖體蛋白還參與核糖體以外的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、DNA 修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和 RNA加工[7]。

RPS15A 基因編碼一種核糖體蛋白，該蛋白是 40S 核糖體亞基(真核生物核糖體小亞基)的組分。從GenBank數(shù)據(jù)庫相關(guān)基因的比對(duì)結(jié)果看，本研究獲得的MaRPS15A基因推測(cè)的蛋白屬于40S 核糖體亞基。真核生物的核糖體蛋白R(shí)PS15A與原核生物的 S8 蛋白同源[7-8]。原核生物的 S8 結(jié)合 30S 亞基中的 16S rRNA，在核糖體組裝中起關(guān)鍵作用[9-11]。真核生物中，RPS15A在轉(zhuǎn)錄起始時(shí)發(fā)揮功能[12]，它可以在翻譯早期啟動(dòng) mRNA 和核糖體的相互作用，并且通過與真核起始因子 4F (eIF-4F) 作用而增強(qiáng)翻譯進(jìn)程。RPS15A 也可能促進(jìn)細(xì)胞生長。斑馬魚(Daniorerio) 中RPS15A基因敲除后嚴(yán)重影響其大腦的發(fā)育和生長，循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)問題，尾部發(fā)育延遲[13]。由此獲得啟發(fā)：從防治的角度考慮，可以通過 RNA 干擾方法以抑制松墨天牛RPS15A基因的表達(dá)，為基因控制松墨天牛及阻斷松材線蟲的傳播提供參考。

核糖體蛋白 RPS15A 在原生動(dòng)物、細(xì)菌和真核生物間都高度保守[14]。從本研究中松墨天牛MaRPS15A與其他昆蟲同源序列比對(duì)結(jié)果來看，MaRPS15A與其他昆蟲 RPS15A 蛋白在進(jìn)化上也高度保守，相似性程度很高，達(dá)到88%～98%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，松墨天牛與櫟實(shí)象鼻蟲聚為一支，與白楊葉甲和赤擬谷盜遺傳距離也較近，與形態(tài)學(xué)上的分類相一致，即這些昆蟲同屬于鞘翅目。

核糖體蛋白基因表達(dá)異常將影響核糖體的功能，引發(fā)各種疾病，如腫瘤發(fā)生、免疫性疾病、代謝性疾病等。有研究表明，個(gè)體核糖體蛋白數(shù)量的減少會(huì)導(dǎo)致非致死性的畸形，這可能是轉(zhuǎn)錄效率下降所致[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)農(nóng)藥脅迫下MaRPS15A下調(diào)表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)松墨天牛出現(xiàn)明顯的個(gè)體畸形現(xiàn)象，這可能是由于觀察時(shí)間不足：農(nóng)藥處理 12 h 后，松墨天牛就被液氮冷凍用于MaRPS15A表達(dá)量分析；更為重要的是，如果在幼蟲期就進(jìn)行農(nóng)藥脅迫，保持亞致死狀態(tài)飼養(yǎng)，直到成蟲，就有可能觀測(cè)到松墨天牛個(gè)體出現(xiàn)畸形的現(xiàn)象。

孟飛等[15]研究了中華蜜蜂(Apisceranacerana)核糖體蛋白 L11基因AccRPLI1在不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)，結(jié)果表明，紫外線、高溫能在一定時(shí)間內(nèi)使AccRPLI1基因的表達(dá)量上升，不同種類的農(nóng)藥如菊酯、蚊蠅醚、辛硫磷、殺螨劑也對(duì)AccRPLI1基因 mRNA 的表達(dá)量產(chǎn)生不同的影響。本試驗(yàn)中所使用的7種化學(xué)農(nóng)藥分屬于擬除蟲菊酯類(溴氰菊酯、氯氰菊酯)，煙堿類(噻蟲啉，啶蟲脒)，有機(jī)氮類(殺蟲雙)，氨基甲酸酯類 (滅多威)，有機(jī)磷類農(nóng)藥 (毒死蜱)，4種生物農(nóng)藥分屬于真菌 (綠僵菌、白僵菌)、細(xì)菌 (Bt) 和植物源農(nóng)藥(印楝素)。這些農(nóng)藥代表了目前常用的主要農(nóng)藥類型，雖然大多數(shù)殺蟲機(jī)理已經(jīng)明確，但由于機(jī)理各異[16-21]，研究其對(duì)核糖體蛋白基因的影響就具有廣泛的代表性。從另一角度看，RPS15A 并不是這些農(nóng)藥傳統(tǒng)的直接作用靶標(biāo)，但農(nóng)藥對(duì)昆蟲的毒力作用不僅影響主要靶標(biāo)，還涉及其他代謝途徑和生理過程，因而可能有更多的生物分子受到影響。因此，本研究為探究非傳統(tǒng)靶標(biāo)的農(nóng)藥毒理學(xué)提供了分子學(xué)依據(jù)。

本研究中，滅多威脅迫使松墨天牛MaRPS15A下調(diào)表達(dá)，這是因?yàn)樵S多氨基甲酸鹽類農(nóng)藥具有基因毒性，滅多威屬于基因毒性制劑，在亞致死濃度下可導(dǎo)致DNA損害和細(xì)胞凋亡[22]。滅多威可引起人類周圍血液染色體畸變、姊妹染色單體互換、DNA單鏈斷裂[23]。

包括真菌在內(nèi)的昆蟲病原物的殺蟲效能不僅依賴于病原物合成的不同毒力因子作用，還依賴于昆蟲抑制感染進(jìn)程或減弱中毒效應(yīng)的機(jī)理。從這個(gè)角度而言，昆蟲自身的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)可以影響藥物對(duì)其殺害作用[24]。但本研究中綠僵菌作用下松墨天牛MaRPS15A表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為綠僵菌素可能發(fā)揮重要作用。綠僵菌素是從綠僵菌胞外培養(yǎng)基中分離到的真菌毒素，其通過昆蟲與真菌之間的進(jìn)化競(jìng)爭來特異性抑制昆蟲的免疫反應(yīng)成分[25]。

Tan 等[26]的研究認(rèn)為，尖音庫蚊淡色亞種(Culexpipienspallens) 抗溴氰菊酯品系中的核糖體蛋白 RPL39 的轉(zhuǎn)錄水平是敏感品系的 23.4 倍，因而 RPL39 與抗藥性的產(chǎn)生有關(guān)。改變基因表達(dá)可以產(chǎn)生抗性，即基因拷貝數(shù)沒有發(fā)生變化，而是基因調(diào)節(jié)發(fā)生了改變，從而抗藥品系比敏感品系的轉(zhuǎn)錄水平更高，表達(dá)量更多[27]。本研究中，溴氰菊酯脅迫下松墨天牛MaRPS15A表達(dá)上調(diào)，松墨天牛是否因此會(huì)產(chǎn)生抗藥性，這需要以后的試驗(yàn)驗(yàn)證。田海生等[28]研究發(fā)現(xiàn)，某些核糖體蛋白基因(40S 核糖體蛋白S4 基因等) 在抗性蚊中高表達(dá)，而40S 核糖體蛋白S29 基因則在敏感蚊品系中高表達(dá)。核糖體蛋白表達(dá)量與殺蟲劑抗性的關(guān)系究竟如何，是通過核糖體蛋白與殺蟲劑結(jié)合起作用，還是通過核糖體蛋白質(zhì)間的作用而發(fā)揮抗性作用，抑或?yàn)槠渌饔脵C(jī)制值還需進(jìn)一步探究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Alberts B,Johnson A,Lewis J,et al.The molecular biology of the cell [M].New York and London:Garland Publishing,2002:342.

[2]Doudna J A,Rath V L.Structure and function of the eukaryotic ribosome:The next frontier [J].Cell,2002,109(2):153-156.

[3]徐金華,黃秀鳳,徐華潮,等.松墨天牛室內(nèi)人工飼養(yǎng)及其生物學(xué)特性觀察 [J].浙江林業(yè)科技,2009,29(4):86-88.

Xu J H,Huang X F,Xu H C,et al.Rearing and biological properties ofMonochamusalternatus[J].Journal of Zhejiang Forestry Science and Technology,2009,29(4):86-88.(in Chinese)

[4]韋春梅,羅淋淋,吳華俊,等.松墨天牛幼蟲cDNA文庫的構(gòu)建及EST分析 [J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2014,33(1):113-120.

Wei C M,Luo L L,Wu H J,et al.Construction and analysis ofMonochamusalternatuslarvae EST cDNA library [J].Genomics and Applied Biology,2014,33(1):113-120.(in Chinese)

[5]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod [J].Methods,2001,25(4):402-408.

[6]羅梅，林進(jìn)添，賓淑英.扶桑綿蚡蚧環(huán)指蛋白基因的克隆及其序列特征與表達(dá)譜分析 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2014,42(4):125-131.

Luo M,Lin J T,Bin S Y.Molecular cloning, sequence characteristics and expression of ring finger protein gene ofPhenacoccussolenopsisTinsley [J].Journal of Northwest A&F University: Nat Sci Ed,2014,42(4):125-131.(in Chinese)

[7]Wool I G,Chan Y L,Glück A.Structure and evolution of mammalian ribosomal proteins [J].Biochemistry and Cell Biology,1995,73:933-947.

[8]Tishchenko S V,Vassilieva J M,Platonova O B,et al.Isolation,crystallization,and investigation of ribosomal protein S8 complexed with specific fragments of rRNA of bacterial or archaeal origin [J].Biochemistry,2001,66(9):948-953.

[9]Held W A,Ballou B,Mizushima S,et al.Assembly mapping of 30S ribosomal proteins fromEscherichiacolifurther studies [J].Journal of Biological Chemistry,1974,249(10):3103-3111.

[10]Svensson P,Changchien L M,Craven G R,et al.Interaction of ribosomal proteins,S6,S8,S15 and S18 with the central domain of 16S ribosomal RNA [J].Journal of Molecular Biology,1988,200(2):301-308.

[11]Brodersen D E,Clemons W M,Carter A P,et al.Crystal stru-cture of the 30S ribosomal subunit fromThermusthermophilus:Structure of the proteins and their interactions with 16S RNA [J].Journal of Biological Chemistry,2002,316(3):725-768.

[12]Lavoie C,Tam R,Clark M,et al.Suppression of a temperature-sensitive cdc33 mutation of yeast by a multicopy plasmid expressing aDrosophilaribosomalprotein [J].Journal of Biological Chemistry,1994,269(20):14625-14630.

[13]Uechi T,Nakajima Y,Nakao A,et al.Ribosomal protein gene knockdown causes developmental defects in zebrafish [J].PLoS ONE,2006,1:37.

[14]Hulm J L,Kerri B M,Peta C B.Variation in transcript abundance among the four members of theArabidopsisthalianaribosomal proteinS15agene family [J].Plant Science,2005,169:267-278.

[15]孟飛,蒼保華,部興啟.中華蜜蜂核糖體蛋白L11基因的克隆及在不同環(huán)境脅迫下的表達(dá) [C].華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì) 2010 年學(xué)術(shù)交流會(huì).南昌:江西省生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì),2011.

Meng F,Cang B H,Bu X Q.CloningApisceranaceranaribosomal protein L11 gene and its expression in different environmental stress [C].East China Provinces and One City of Biochemistry and Molecular Biology 2010 Symposium.Nanchang:Jiangxi Institute of Biochemistry and Molecular Biology,2011.(in Chinese)

[16]李瑾,李鳳良,焦東旭,等.溴氰菊酯脅迫下小菜蛾幼蟲體內(nèi)差異表達(dá)蛋白的分析 [J].昆蟲學(xué)報(bào),2014,57(1):36-44.

Li J,Li F L,Jiao D X,et al.Proteomic analysis of differentially expressed proteins in larvae of the diamondback moth，Plutellaxylostella(Lepidoptera:Plutellidae)，under deltamethrin stress [J].Acta Entomologica Sinica,2014,57(1):36-44.(in Chinese)

[17]Zhang Z Y，Zhang C Z，Liu X J，et al.Dynamics of pesticide residues in the autumn Chinese cabbage(BrassicachinensisL.)grown in open fields [J].Pest Management Science,2006,62:350-355.

[18]Villar D,Balvin D,Giraldo C,et al.Plasma and brain cholinesterase in methomyl-intoxicated free-ranging pigeons (Columbaliviaf.domestica) [J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,2010,22(2):313-315.

[19]Padilla S,Marshall R S,Hunter D L,et al.Time course of cholinesterase inhibition in adult rats treated acutely with carbaryl,carbofuran,formetanate,methomyl,methiocarb,oxamyl or propoxur [J].Toxicology and Applied Pharmacology,2007,219(2/3):202-209.

[20]樊會(huì)丹,張從海,嚴(yán)勝驕,等.印楝素的合成、結(jié)構(gòu)修飾及生物活性研究進(jìn)展 [J].有機(jī)化學(xué),2009,29(1):20-33.

Fan H D,Zhang C H,Yan S J,et al.Advances of synthesis and structure modification and bioactivity of azadirachtin [J].Chinese Journal of Organic Chemistry,2009,29(1):20-33.(in Chinese)

[21]趙淑英,盛永麗,姜潤田.印楝粗提物的毒性研究 [J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,6(1):398-399.

Zhao S Y,Sheng Y L,Jiang R T.Studies on toxicity of extracts of neem [J].Jiangsu Agricultural Sciences,2009,6(1):398-399.(in Chinese)

[22]Xiang G G,Li D Q,Yuan J Z,et al.Carbamate insecticide methomyl confers cytotoxicity through DNA damage induction [J].Food and Chemical Toxicology,2013,53:352-358.

[23]Bonatti S,Bolognesi C,Degan P,et al.Genotoxic effects of the carbamate insecticide methomyl:Ⅰ.Invitrostudies with pure compound and the technical formulation “Lannate 25” [J].Environmental and Molecular Mutagenesis,1994,23:306-311.

[24]Beckage N E.Insect immunology [M].Boston:Academic Pre-ss Elsevier,2008:152-160.

[25]Pal S S,Leger R J,Wu L P.Fungal peptide destruxin A plays a specific role in suppressing the innate immune response inDrosophilamelanogaster[J].Journal of Biological Chemistry,2007,282(12):8969-8977.

[26]Tan W B,Sun L X,Zhang D H,et al.Cloning and overexpression of ribosomal protein L39 gene from deltamethrin-resistantCulexpipienspallens[J].Experimental Parasitology,2007,115:369-378.

[27]胡文濤.家蠅對(duì)高效氯氰菊酯抗藥性機(jī)制的探索 [J].中華衛(wèi)生殺蟲藥械,2008,14(2):87-90.

Hu W T.Resistance mechanisms ofMuscadomesticaagainst beta-cypermethrin [J].Chin J Hyg Insect & Equip,2008,14(2):87-90.(in Chinese)

[28]田海生,朱昌亮,高曉紅,等.淡色庫蚊對(duì)溴氰菊酯抗藥性和敏感性相關(guān)基因克隆和序列分析 [J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2001,19(4):193-197.

Tian H S,Zhu C L,Gao X H,et al.Cloning and identification of deltamethrin-resistance or susceptibility associated genes ofCulexpipienspallens[J].Chin J Parasitol Parasit Dis,2001,19(4):193-197.(in Chinese)

Cloning cDNA of ribosomal protein (RPS15A) fromMonochamusalternatusand effects of insecticides on its expression

LUO Lin-lin,CAI Zi-ling,LIN Tong

(CollegeofForestryandLandscapeArchitecture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China)

Abstract:【Objective】 This study explored the expression of ribosomal protein gene under different insecticide stresses to provide theoretical information for control of Monochamus alternatus as an important of pines.【Method】 Expressed sequence tags (ESTs) screened from the formerly constructed cDNA library of M.alternatus were selected randomly for sequencing.The homogenous sequences were obtained from GenBank by Blast.Real time quantitative RT-PCR (RT-qPCR) was used to determine transcript abundance patterns after treatment by 11 insecticides.【Result】 A EST from GenBank relating to insect ribosomal protein S15A (RPS15A) was obtained and named MaRPS15A.The isolated cDNA of MaRPS15A containing both 5′ and 3′ untranslated regions was 504 nucleotide long with an open reading frame of 393 bp and 130 amino acids.The calculated molecular weight was 14.75 ku and the pI was 9.95.The deduced protein sequence of MaRPS15A showed 98% amino acid identity to Triboliumc astaneum RPS15A and >88% identity to RPS15A ribosomal proteins of other insects.All insecticides resulted in decreased transcript abundances except deltamethrin.【Conclusion】 The ribosomal protein gene MaRPS15A was successfully cloned from M. alternatus (GenBank No.KJ930032).Most of the tested insecticides suppressed MaRPS15A expression,indicating that adverse impact on M.alternatus.

Key words:Monochamus alternatus;ribosomal protein;RPS15A;RT-qPCR;treatment with insecticides

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.023 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.024

[收稿日期]2014-06-20

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170612)

[作者簡介]羅淋淋(1988-)，女，河南許昌人，碩士，主要從事昆蟲分子生物學(xué)研究。[通信作者]林同(1969-)，男，黑龍江通河人，副教授，主要從事昆蟲分子生物學(xué)研究。E-mail:lintong@scau.edu.cn

[中圖分類號(hào)]S763.38；Q78

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)02-0165-07