梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的克隆及IRAP分子標(biāo)記體系的建立

周　鵬，張士偉，翟　銳，王志剛，徐凌飛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100)

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梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的克隆及IRAP分子標(biāo)記體系的建立

周鵬，張士偉，翟銳，王志剛，徐凌飛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100)

[摘要]【目的】 從早酥梨及其紅皮芽變基因組中分離Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)序列，分析序列特點(diǎn)，并基于其中長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)建立IRAP分子標(biāo)記體系?！痉椒ā?以早酥梨及其紅皮芽變和極早熟芽變植株葉片為試材，根據(jù)已知的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，利用同源克隆技術(shù)得到目的基因。根據(jù)基因兩端LTR序列設(shè)計(jì)引物，建立IRAP分子標(biāo)記體系，并對(duì)早酥梨及其芽變進(jìn)行遺傳分析?！窘Y(jié)果】 從早酥梨基因組中獲得2條Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)序列，分別命名為PbTYZS1和PbTYZS2，長(zhǎng)度分別是9 363和9 632 bp。從紅色芽變基因組中獲得1條序列，命名為PbTYRM1，長(zhǎng)度為9 652 bp。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析，獲得的3條序列都是典型的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，但其開放閱讀框(ORF)的完整性發(fā)生了變化。利用反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物成功建立了IRAP分子標(biāo)記體系，早酥梨與紅皮芽變的平均遺傳距離為0.104，與極早熟芽變的遺傳距離為0.115，并且早酥梨與極早熟芽變的多態(tài)性為20.41%，較之與紅皮芽變的多態(tài)性(18.89%)更為豐富。【結(jié)論】 早酥梨及其紅皮芽變基因組中都含有完整結(jié)構(gòu)的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，建立的IRAP分子標(biāo)記體系可以得到清晰穩(wěn)定的多態(tài)性指紋圖譜。

[關(guān)鍵詞]梨；芽變；反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子；進(jìn)化分析；IRAP

反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是植物基因組中可以以RNA為中介發(fā)生轉(zhuǎn)座的基因序列，轉(zhuǎn)座后將形成大量重復(fù)序列，并成為基因組的主要組成部分。迄今為止，已有許多反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在果樹中被分離和鑒定[1-4]，并研究了其在果樹基因組組成[5]、系統(tǒng)進(jìn)化[6-7]以及基因表達(dá)調(diào)控方面[8]的重要作用。兩端含有長(zhǎng)末端重復(fù)序列的Copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子占梨基因組大小的16.9%，且廣泛分布在富含基因組區(qū)，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可以利用其甲基化、高異質(zhì)性和插入多態(tài)性特點(diǎn)[9-11]，通過(guò)改變等位基因或調(diào)控基因表達(dá)以改變果樹性狀。

IRAP(Inter-retrotransposon amplified polymorphism)分子標(biāo)記最早是由Kalendar等[12]根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列開發(fā)的，用于檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的多態(tài)性，現(xiàn)已用于大麥[13]、葡萄[14]和蘋果[15]的品種鑒別及基因定位[16]等方面的研究。

本研究擬從早酥梨及其紅色芽變基因組中分離克隆Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列，運(yùn)用生物信息學(xué)分析其特點(diǎn)，根據(jù)所獲序列設(shè)計(jì)引物，建立并優(yōu)化IRAP分子標(biāo)記技術(shù)，分析研究早酥梨與其芽變品種間的遺傳差異。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以早酥梨(PyrusbretschneideriRehd.)及其紅皮芽變和極早熟芽變植株葉片為試材，2012-04從西北農(nóng)林科技大學(xué)種質(zhì)資源圃采集幼葉，立即用液氮速凍后，-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2梨基因組DNA的提取

采用改良的SDS酚法提取不同梨品種的基因組DNA[17]。

1.3Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因全長(zhǎng)的克隆

根據(jù)Kim等[18]已上傳至NCBI的沙梨基因組中Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子AB550651-AB550658序列中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物(表1)，PCR體系總體積為25 μL，內(nèi)含早酥梨或其紅皮芽變DNA模板100 ng，10×Buffer 2.5 μL，MgCl20.2 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L，引物 1 μmol/L，TaqDNA聚合酶(Tiangen)1 U。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，根據(jù)不同引物的退火溫度復(fù)性雙鏈50 s，72 ℃延伸2 min， 35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃保持延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，目的片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Biomiga)回收，16 ℃條件下與pGM-T(Tiangen)載體連接，轉(zhuǎn)化到Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，從經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性克隆中隨機(jī)選取4個(gè)，分裝成2份，送往北京奧科鼎盛生物科技有限公司，利用 T7 或 SP6 引物測(cè)序，獲得目的基因序列。

1.4序列分析

利用NCBI ( http://www.ncbi.nlin.nih.gov)網(wǎng)站查找載體，通過(guò)contigexpress軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)和重疊區(qū)去除拼接。利用GenBank網(wǎng)站中的BLAST工具對(duì)所獲得的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索分析。預(yù)測(cè)分析登錄PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)[19]，對(duì)獲得的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析其中可能包含的調(diào)控元件，選取預(yù)測(cè)概率80%～85%為參考結(jié)果。

1.5IRAP體系的建立

1.5.1引物設(shè)計(jì)與合成利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)獲得的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物。引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。

表 1　擴(kuò)增Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的引物

1.5.2IRAP的建立PCR體系總體積為25 μL，內(nèi)含模板DNA 100 ng，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 0.2 mmol/L，引物0.4 pmmol/L，TaqDNA聚合酶(Tiangen)1.25 U。擴(kuò)增反應(yīng)在梯度PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，41 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min， 35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。IRAP標(biāo)記體系的PCR產(chǎn)物在3%聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測(cè)，GelDoc-It凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)觀察并攝影記錄。

1.5.3早酥梨與其芽變品種的多態(tài)性與遺傳距離分析為進(jìn)一步說(shuō)明早酥梨與其芽變品種間的差異程度，對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。采用Nei和Li的遺傳相似系數(shù)(Genetic Similarity，GS)計(jì)算公式[20]：GS=2Nij/(Ni+Nj)，對(duì)多態(tài)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中Nij表示樣本i和j的公共條帶數(shù)，Ni、Nj分別是樣本i、j的條帶數(shù)。遺傳距離D=1-GS。

多態(tài)性=多態(tài)性條帶數(shù)/總條帶數(shù)×100%=(Ni+Nj-2Nij)/(Ni+Nj-Nij)×100%，式中Nij、Ni、Nj含義同上。

2結(jié)果與分析

2.1梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的克隆與比較

根據(jù)已知的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)引物，分別以早酥梨及其紅皮芽變總基因組DNA為模板進(jìn)行同源克隆。經(jīng)過(guò)測(cè)序，查找引物并與已知序列比較，獲得的序列大小如圖1所示。從獲得的序列中刪除重疊部分拼接獲得3條梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)序列。將來(lái)自于早酥梨的序列命名為PbTYZS1和PbTYZS2(登錄號(hào)分別為KF270888和KF270889)，長(zhǎng)度分別是9 363和 9 632 bp；而將來(lái)自于芽變的序列命名為PbTYRM1(登錄號(hào)為KF270890)，長(zhǎng)度為9 652 bp，與以上2條母本序列的同源性分別為92.13%和 94.64%。

圖 1　分步克隆早酥梨及其紅皮芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列的電泳結(jié)果

經(jīng)過(guò)相似度比較發(fā)現(xiàn)，早酥梨的2條反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相似度為95.61%，早酥梨芽變與母本反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列的相似度分別為92.08%和94.64%。導(dǎo)致差異的原因除了個(gè)別堿基不同以外，還在于序列存在缺失突變和終止子位點(diǎn)不同的現(xiàn)象。

2.2梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的基因結(jié)構(gòu)及與其他物種同源性

將拼接得到的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列輸入到NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源搜索，通過(guò)多重比對(duì)查找特征結(jié)構(gòu)序列，得知3條序列都具有Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)特征，符合其基因特殊結(jié)構(gòu)的排列順序，引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS)和多嘌呤位點(diǎn)(PPT)之間是主要發(fā)生功能的種屬特異性抗原(GAG)、聚合蛋白(POL)編碼區(qū)，編碼的蛋白按GAG、蛋白酶(PR)、整合酶(INT)、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、核糖核酸酶H(RNase H)順序合成作用。PbTYZS1、PbTYZS2和PbTYRM1與Ppcrt5(GenBank登錄號(hào)AB550655)、Ppcrt1(GenBank登錄號(hào)AB550651)、Ppcrt3(GenBank登錄號(hào)AB550653)、Ppcrt8(GenBank登錄號(hào)AB550658)有較高的同源性(98%)。

為了分析該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在梨基因組中的轉(zhuǎn)錄活性，查找序列中的開放閱讀框(ORF)，發(fā)現(xiàn)3條序列中最長(zhǎng)的開放閱讀框分別是1 081，1 080和1 395 bp。序列中有多處含有終止子或具移碼現(xiàn)象，破壞了原有基因的完整性，這可能預(yù)示所在宿主的轉(zhuǎn)座元件已失去了轉(zhuǎn)座活性。

同時(shí)，早酥梨及其芽變品種的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與其他物種的轉(zhuǎn)座子氨基酸序列也有較高的同源性。其中，早酥梨PbTYZS1全長(zhǎng)氨基酸序列與葡萄(Vitisvinifera，GenBank登錄號(hào)CAN69431)具有最高的同源性(40%)，與大豆(Glycinemax，GenBank登錄號(hào)ADB85429)和番茄(Solanumlycopersicum，GenBank登錄號(hào)ABO36622)的同源性均為34%。PbTYZS2與澳洲野生稻(Oryzaaustraliensis，GenBank登錄號(hào)BAA22288)的同源性最高(39%)，與玉米(Zeamays，GenBank登錄號(hào)AAD12997)的同源性為38%，與葡萄的同源性是36%，與大豆的同源性是33%。而與芽變反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子PbTYRM1同源性最高的是澳洲野生稻(36%)，其次是玉米和毛竹(Phyllostachysedulis，GenBank登錄號(hào)ADB85429)，同源性分別為35%和28%。

雖然每個(gè)正常的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子都具有1對(duì)相似的LTR序列，但在長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)和同源性上差異較大，且芽變3′端LTR的終止序列與母本不同(表2)。

表 2　早酥梨及其紅皮芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的LTR序列分析

2.3梨與其他物種Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守區(qū)域的比對(duì)

將PbTYZS1、PbTYZS2、PbTYRM1與不同物種的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列進(jìn)行多重比對(duì)，對(duì)特殊結(jié)構(gòu)的保守序列進(jìn)行同源性分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)在GAG保守區(qū)域中含有C-C-G-H-C的核酸結(jié)合域，而早酥梨中的氨基酸發(fā)生了突變，即H變?yōu)镽，最后一個(gè)C變?yōu)閅；但RT的3個(gè)保守基序都很完整；RNase H的保守區(qū)域也一致。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的PBS位點(diǎn)在5′端LTR下游的 0至3 bp處，常以“-TGGT-”的保守序列作為起點(diǎn)[21]。本研究克隆獲得的3條反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列都含有明顯的PBS特征序列，與5′端LTR相距2～3 bp堿基。PPT區(qū)域的多重比對(duì)顯示，早酥梨基因組中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中同樣含有PPT結(jié)合位點(diǎn)的保守基序“-GGGGA-”[22-23]。

反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中不同的區(qū)域結(jié)構(gòu)都含有其特殊的保守基序，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守序列如INT、RT和RNase H的差異，能直觀地反映物種之間的進(jìn)化關(guān)系[24]。不同物種反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各結(jié)構(gòu)的氨基酸比對(duì)結(jié)果為：GAG同源性52.38%，PR同源性61.67%，INT同源性46.67%，RT同源性 87.33%，RNase H同源性71.28%。其中，INT區(qū)域D-D-E序列對(duì)轉(zhuǎn)座到新位點(diǎn)起著至關(guān)重要的作用，但在比對(duì)的大多數(shù)序列中，并未找到該特征，可能與轉(zhuǎn)座子是否具有活性有關(guān)，比對(duì)中發(fā)現(xiàn)早酥梨與其芽變的氨基酸差異比較明顯。

圖 2不同物種Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守區(qū)域的多重比較

LTR.長(zhǎng)末端重復(fù)序列；GAG.種屬特異抗原；PR.蛋白酶；INT.整合酶；RT.逆轉(zhuǎn)錄酶；RNase H.核糖核酸酶H；PPT.多嘌呤位點(diǎn)；PBS.引物結(jié)合位點(diǎn)；PbTYZS1、PbTYZS2.早酥梨；PbTYRM1.紅皮芽變；Tto1、Tnt1.煙草；AAV88069-1.番薯；

TLC1.1.番茄；CIRE1.柑橘；BARE-1.大麥；Opie-2.玉米；AAF02855-A、Tal-3.擬南芥；CAC95126-P.楊；SIRE-1.鷹嘴豆；AAT38758-S.馬鈴薯；Copia.果蠅；RIRE1.澳洲野生稻;CTcmr1.蘋果

Fig.2Multiple alignments of conserved motifs of Ty1-copiaretrotransposon in different species

LTR.Long terminal repeat;GAG.Group-specific antigen;PR.Protease;INT.Integrase;RT.Reverse transcriptase;RNase H.Ribonuclease H;PPT.Polypurine tract;PBS.Primerv biding sites；PbTYZS1,PbTYZS2.‘Zaosu’ pear;PbTYRM1.Red mutant;Tto1,

Tnt1.Tobacco;AAV88069-1.Ipomoeabatatas;TLC1.1.Solanumlycopersicum;CIRE1.Citrussinensis;BARE-1.Hordeumvulgare;Opie-2.Zeamays;AAF02855-A,Tal-3.Thaliana;CAC95126-P.Populus

deltoids;SIRE-1.Cicersinensis;AAT38758-S.Solanumdemissum;Copia.Drosophilamelanogaster;RIRE1.Oryzaaustraliensis;CTcmr1.Malus×DomesticaPbTYZS1、PbTYZS2、PbTYRM1與不同物種的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子同源關(guān)系比對(duì)結(jié)果顯示，梨基因組中的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與大麥BARE-1序列的相似程度較高。

2.4梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的調(diào)控元件

通過(guò)PlantCARE網(wǎng)站對(duì)LTR序列中的啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，3條序列中所包含的啟動(dòng)子十分相似。LTR序列含有脫落酸響應(yīng)元件、光信號(hào)響應(yīng)元件及響應(yīng)干旱條件的調(diào)控元件或激素應(yīng)答元件，這表明反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達(dá)調(diào)控與逆境有關(guān)，而且LTR序列包含有大量CAAT-box的增強(qiáng)子元件，有助于轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座的發(fā)生。6條LTR序列共含有40種順式調(diào)控元件，包括損傷誘導(dǎo)增強(qiáng)子TGACY，赤霉素應(yīng)答元件TGAC、TAACAGA，激素響應(yīng)元件GAGAC、YTGTCWC和ACTTTA，水楊酸誘導(dǎo)元件TGACT，茉莉酸響應(yīng)元件GRWAAW，響應(yīng)低溫的調(diào)控元件ACCGACA，還包括能對(duì)多種脅迫響應(yīng)的整合基因調(diào)控元件，包括低溫、鹽的響應(yīng)元件TACCGACAT，LTR序列包含多種順式作用元件，說(shuō)明環(huán)境變化對(duì)其基因表達(dá)起著重要的作用。

2.5早酥梨及其芽變的多態(tài)性與遺傳距離

表3結(jié)果表明，5組引物在3個(gè)不同早酥梨品種中共擴(kuò)增出268條帶，其中29條顯示多態(tài)性，平均每條引物得到0.108 2個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)。5組引物相比，多態(tài)性最高的是IR5，為13.89%；最低的是IR3，只有7.35%。IR1、IR2、IR4的多態(tài)性分別是 10.20%，12.90%和10.42%。圖3為早酥梨及其芽變的IRAP多態(tài)性分析電泳圖譜。

表 3　不同引物在早酥梨IRAP分析中的多態(tài)性

圖 3　早酥梨及其芽變的IRAP多態(tài)性分析

依據(jù)遺傳相似系數(shù)計(jì)算早酥梨與其芽變的遺傳距離和多態(tài)性。早酥梨與紅皮芽變的平均遺傳距離為0.104，與極早熟芽變的遺傳距離為0.115，大于紅皮芽變。早酥梨與極早熟芽變的多態(tài)性為 20.41%，較之與紅皮芽變的多態(tài)性(18.89%)更為豐富。

3討論

3.1梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)序列分析

根據(jù)Kim等[18]公布的沙梨基因組中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列，運(yùn)用同源克隆手段，成功地從早酥梨及其芽變基因組中獲得3條Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列。通過(guò)分析序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可知其與已報(bào)道的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)完全一致，并在相應(yīng)區(qū)域找到了各保守基序，從而確定所克隆的序列屬于同一家族。序列由于堿基突變或終止子突變導(dǎo)致開放閱讀框變短，這可能影響轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座能力和活性，但序列突變導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子喪失活性是有積極意義的，可以保證物種的穩(wěn)定遺傳。植物一方面采取各種方式抑制逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件的發(fā)生，以防止轉(zhuǎn)座造成致死突變；另一方面，脅迫條件下逆轉(zhuǎn)座子不斷地進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)座，為基因組的多樣性和遺傳變異奠定了基礎(chǔ)[25]。

PbTYZS1、PbTYZS2和PbTYRM1中GAG-POL編碼區(qū)蛋白符合Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的基因結(jié)構(gòu)特征，是按照GAG-PR-INT-RT-RNase H的順序排列，但ORF的完整性發(fā)生了變化，出現(xiàn)移碼和重疊的現(xiàn)象，體現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性的特點(diǎn)。雖然不同物種的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子都具有不同結(jié)構(gòu)的保守基序，但氨基酸GAG-POL編碼區(qū)的同源性為27%～40%。3條轉(zhuǎn)座子元件兩端的LTR序列在長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)和同源性方面存在差異。其他保守基序GAG區(qū)域的C-C-G-H-C發(fā)生了變異。PR區(qū)域的D ( T/S ) G、INT包含鋅指結(jié)構(gòu)域H-H-C-C，RT包含的保守區(qū)域TAFLHG、YGLKQ和YVDDML，RNase H保守區(qū)域包含的KHFD和ADPLTK，PBS區(qū)域包含的TGGT和PPT區(qū)域包含的AGGGG，都存在于PbTYZS1、PbTYZS2和PbTYRM1中。多重比對(duì)反映了不同物種反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的親緣關(guān)系[26]。

3.2梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列含有的調(diào)控轉(zhuǎn)座元件

Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是基因組中十分活躍的可移動(dòng)元件，兩端的LTR中包含了大量響應(yīng)環(huán)境或非環(huán)境因素的啟動(dòng)元件，從而實(shí)現(xiàn)了植物對(duì)環(huán)境變化的應(yīng)激反應(yīng)。有人推斷，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是從植物防御相關(guān)基因中獲取的啟動(dòng)子，因此能夠響應(yīng)環(huán)境的變化[4,27-28]，所以反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子將作為研究植物防御機(jī)制的重要途徑[29-30]。例如，Tnt1A的LTR U3區(qū)域含有2個(gè)應(yīng)答元件，對(duì)應(yīng)答茉莉酸(JA)具有重要的作用。Bare1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子5′端 LTR中包含脫落酸的響應(yīng)元件ABRE。本研究在分析早酥梨基因組中的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)了大量順式作用元件，分析結(jié)果表明其與激素、低溫、光照、病原、干旱等多種環(huán)境變化有關(guān)。如果能驗(yàn)證其確切的功能，相信可以十分有效地用于對(duì)基因表達(dá)的研究。

3.3IRAP標(biāo)記的應(yīng)用

已有許多報(bào)道證明反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與植物無(wú)性系變異有關(guān)[2,17,27,31]，通過(guò)分子標(biāo)記分析計(jì)算不同無(wú)性系品種間的遺傳距離，可以揭示反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在其遺傳多樣性中的作用。若相似系數(shù)為1，則可能多樣性并非由反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子所致。但是設(shè)計(jì)用于IRAP 的特異引物，必須先知道該物種的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR。本研究根據(jù)前期獲得的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)序列，開發(fā)了5組不同引物，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證都可以用于早酥梨及其芽變品種的遺傳分析。

在利用IRAP分析不同梨品種的遺傳多樣性時(shí)，若IRAP標(biāo)記的擴(kuò)增條帶太多，會(huì)出現(xiàn)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)難以分辨的問(wèn)題，因此宜采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，故本試驗(yàn)選用3%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)[13]。

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Cloning of Ty1-copiaretrotransposons in pear (PyrusbretschneideriRehd.) and establishment of the inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP) marker system

ZHOU Peng,ZHANG Shi-wei,ZHAI Rui,WANG Zhi-gang,XU Ling-fei

(CollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,KeyLaboratoryofHorticulturalPlantBiologyandGermplasmInnovationinNorthwestChina,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 The aim of this study was to clone Ty1-copia retrotransposons,analyze the characteristics in genome of ‘Zaosu’ pear (Pyrus bretschneideri Rehd.) and its red mutants,and establish inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP) molecular marker system using long terminal repeat (LTR) sequences of Ty1-copia retrotransposon.【Method】 DNA were extracted from the leaves of ‘Zaosu’ pear,its red mutants and extremely early mutants.The primers were designed according to the known conserved regions of Ty1-copia retrotransposons and the desired genes were obtained by homology-based cloning technology.According to both ends of retrotransposons,primers were designed from the LTR sequences to establish IRAP molecular marker system for genetic analysis of ‘Zaosu’ pear and its mutants.【Result】 Two Ty1-copia retrotransposons full-length sequences obtained from ‘Zaosu’ pear genome were named PbTYZS1(9 363 bp) and PbTYZS2(9 632 bp),respectively.One sequence obtained from the red mutant pear genome was named PbTYRM1(9 652 bp).Structural analysis showed that all three sequences were typical Ty1-copia retrotransposons with changes in ORF integrity.Based on PbTYZS1 sequence, IRAP molecular marker was established and 5 pairs of IRAP marker primers were developed.The average genetic distance between ‘Zaosu’ pear and the red mutants was 0.104 and that between ‘Zaosu’ pear and the extremely precocious mutants was 0.115.The polymorphism of ‘Zaosu’ pear and the red mutants was 18.89%,and that of ‘Zaosu’ pear and the extremely precocious mutants was 20.41%.【Conclusion】 The genomes of ‘Zaosu’ pear and its red mutants contained complete structure of Ty1-copia retrotransposons.The established IRAP molecular marker system showed clear and stable fingerprint.

Key words:pear;bud mutant;retrotransposon;phylogenetic analysis;IRAP

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.014

[收稿日期]2014-06-19

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171925)；高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(ZD2013005)

[作者簡(jiǎn)介]周鵬(1986-),男，山西太原人，碩士，主要從事園藝植物種質(zhì)資源遺傳改良研究。E-mail:macao1986@126.com[通信作者]徐凌飛(1969-),男，陜西乾縣人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事果樹育種和生物技術(shù)改良等研究。

[中圖分類號(hào)]S661.2；Q78

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)02-0097-08

E-mail：lingfxu2013@sina.com