豬源乳酸菌的分離及其生物學(xué)性能研究

李琳琳，王雅婷，楊　欣，周羅雄，王利紅，杜恩岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，b 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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豬源乳酸菌的分離及其生物學(xué)性能研究

李琳琳a，王雅婷a，楊欣b，周羅雄b，王利紅b，杜恩岐a

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，b 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 從豬新鮮糞便和腸道黏膜中篩選乳酸菌，為豬益生劑飼料添加劑提供理論依據(jù)和可靠菌種。【方法】 采集陜西八眉豬的糞便和腸道組織，分離純化乳酸菌，通過體外耐酸、耐膽汁試驗(yàn)以及抑菌試驗(yàn)和黏附試驗(yàn)，篩選特性優(yōu)良的益生菌，用16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹確定其分類地位。采用小鼠安全性檢驗(yàn)試驗(yàn)，檢測篩選菌株的安全性?！窘Y(jié)果】 篩選出一株耐受性和抑菌性良好，生長曲線穩(wěn)定且黏附性較好的乳酸菌，命名為FB027；另一株抑菌性和黏附性良好，生長曲線穩(wěn)定且耐酸、耐膽鹽較好的乳酸菌，命名為SE013。16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B027為非解乳糖鏈球菌(Streptococcus alactolyticus)，進(jìn)化與同屬的血紅鏈球菌Streptococcus sanguinis (GenBank登錄號(hào)CP000387.1)同源性最高，SE013為腸系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，進(jìn)化與同屬的偽明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides (GenBank登錄號(hào)AB572039.1)同源性最高。小鼠安全性檢驗(yàn)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)2周口服乳酸菌FB027和SE013，小鼠健康狀況良好，行為、生長、采食量和病理組織剖檢均無明顯異常。【結(jié)論】 分離獲得了性能優(yōu)良的2株乳酸菌，其在豬飼料添加劑方面有潛在的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]豬；乳酸菌；分離鑒定；生物學(xué)特性

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是指一類可發(fā)酵碳水化合物，產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性球菌或桿菌的統(tǒng)稱，包括乳桿菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬和雙歧桿菌屬等。乳酸菌是國際公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物(GRAS)，對(duì)人類、動(dòng)物和植物的健康都有益[1]。作為重要的工業(yè)微生物，乳酸菌及其代謝產(chǎn)物被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、精細(xì)化學(xué)品等工業(yè)領(lǐng)域中，應(yīng)用較廣泛的有乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、明串珠菌和嗜熱鏈球菌[2-3]。乳酸菌可發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸(乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等)和抗菌肽等生物活性分子，這些代謝產(chǎn)物不僅可以抑制食物中有毒細(xì)菌和腐敗細(xì)菌的生長，防止食物腐敗變質(zhì)，還能起到解毒作用，分解食物中的毒素分子[4-5]。眾所周知，臨床應(yīng)用抗生素取得了很好的預(yù)防和治療效果，但長期使用也產(chǎn)生諸多副作用，一方面使耐藥菌株增加，耐藥因子迅速擴(kuò)散；另一方面引起腸道菌群紊亂，造成腸道功能失調(diào)。而乳酸菌作為微生態(tài)制劑的菌種之一，由其所生產(chǎn)的微生態(tài)制劑可直接飼喂動(dòng)物，它以活菌形式在動(dòng)物消化道中與病原菌通過競爭性抑制作用增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，并直接參與胃腸道微生態(tài)的平衡，調(diào)節(jié)胃腸道功能。因此，乳酸菌的應(yīng)用越來越被重視。

八眉豬主要分布于陜西涇河流域、甘肅隴東和寧夏的固原等西北地區(qū)。該品種豬具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性好、產(chǎn)仔多、保育性好、肉質(zhì)好、肉味香、易于飼養(yǎng)管理、性狀遺傳穩(wěn)定、與國內(nèi)外良種豬雜交雜種優(yōu)勢明顯等特性，是我國西北地區(qū)優(yōu)良的地方品種，具有很高的保護(hù)和利用的價(jià)值[6-7]。本研究以陜西八眉豬為試驗(yàn)對(duì)象，從其糞便和腸道內(nèi)分離乳酸菌，并對(duì)乳酸菌耐受性、黏附特性、抑菌性、安全性等進(jìn)行檢測，以期為進(jìn)一步研制豬用微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑主要培養(yǎng)基有MRS培養(yǎng)基、含5 g/L碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基(以下簡稱CaCO3-MRS)、LB培養(yǎng)基。膽汁，Sigma；異硫氰酸熒光素(FITC)，北京全式金生物技術(shù)有限公司；鼠傷寒沙門氏菌、Caco-2細(xì)胞和胎牛血清，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院趙辛老師實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物BALB/c 小鼠，購于西安交通大學(xué)；陜西八眉豬，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究中心提供。

1.2方法

1.2.1樣品采集用酒精棉消毒不銹鋼藥勺，用其取新鮮的陜西八眉豬糞便樣品2份裝入樣品袋，編號(hào)，低溫保存。截取宰后健康陜西八眉豬的十二指腸、空腸、回腸，剖開腸道并用無菌生理鹽水沖洗干凈，刮取腸壁內(nèi)表面黏膜樣品5份，收集到無菌管中，編號(hào)，低溫保存。

1.2.2乳酸菌的分離與純化稱取10 g樣品于90 mL無菌生理鹽水(含5 mm玻璃珠)中，37 ℃、180 r/min振蕩30～60 min，使樣品充分打散混勻。取1 mL懸浮液用生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。每個(gè)梯度取1 mL稀釋液，加入25 mL未凝固的CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基中，混勻倒平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。挑取有透明融鈣圈且形態(tài)、大小、顏色、光澤、邊緣、表面隆起度、透明度等各異的菌落，多次接種純化，至形成單一菌落，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3乳酸菌的耐酸性檢測將活化好的菌株，按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接入pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，以等量接入pH 6.2的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)2 h。處理組和對(duì)照組各取200 μL混合培養(yǎng)液涂板，用平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù)量，計(jì)算酸處理存活率。計(jì)算公式如下：

酸處理存活率=處理組活菌數(shù)/對(duì)照組活菌數(shù)×100%。

1.2.4乳酸菌耐膽汁性試驗(yàn)將活化好的菌株，按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接入含0.2%牛膽汁的MRS液體培養(yǎng)基中，以等量接入不加膽汁的MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)2 h。處理組和對(duì)照組各取200 μL混合培養(yǎng)液涂板，用平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù)量，計(jì)算膽汁處理存活率。計(jì)算公式如下：

膽汁處理存活率=處理組活菌數(shù)/對(duì)照組活菌數(shù)×100%。

1.2.5乳酸菌的抑菌性試驗(yàn)用牛津杯法檢測。以鼠傷寒沙門氏菌為指示菌，測定分離菌株的抑菌活性。將活化培養(yǎng)的指示菌按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接入100 mL LB固體培養(yǎng)基中，混勻，緩緩倒入均勻放置了3個(gè)無菌牛津杯的平板中，待培養(yǎng)基凝固后，用鑷子拔出牛津杯，一個(gè)牛津杯孔加入200 μL MRS液體培養(yǎng)基為對(duì)照，另2個(gè)孔加入200 μL分離菌株培養(yǎng)液，待孔內(nèi)液體完全擴(kuò)散后，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測量各孔抑菌圈直徑，用抑菌圈直徑大小表示菌株的抑菌性強(qiáng)弱。

1.2.6乳酸菌的細(xì)胞黏附試驗(yàn)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)：Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%熱滅活胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為2×105mL-1，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換1次培養(yǎng)液，至細(xì)胞貼壁生長為單層細(xì)胞(需5～7 d)[8]。

細(xì)菌標(biāo)記：培養(yǎng)細(xì)菌至對(duì)數(shù)生長期，收集菌體，用無菌PBS (pH 7.4)洗滌并調(diào)整菌液中細(xì)菌含量為1×108CFU/mL，將懸浮液與100 μg/mL FITC在37 ℃避光共孵育2 h。用PBS (pH 7.4)洗滌2次，以除去未結(jié)合的FITC，將標(biāo)記菌懸浮于5 mL PBS (pH 7.4)中[9-10]。

黏附試驗(yàn)：將培養(yǎng)好的單層Caco-2細(xì)胞用無菌生理鹽水沖洗2次，并用1 mL DMEM懸浮，加入1 mL熒光標(biāo)記的乳酸菌，以加入等量無菌PBS (pH 7.4)的細(xì)胞為空白對(duì)照組，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中共孵育1 h。孵育結(jié)束后，用無菌PBS (pH 7.4)溫和洗滌2次，洗脫未黏附的細(xì)菌，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度，吸收光波長為485 nm，發(fā)射光波長為530 nm，測定相對(duì)熒光強(qiáng)度，計(jì)算黏附率[8-10]。每組設(shè)6個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)孔為1個(gè)重復(fù)。黏附率計(jì)算公式如下：

細(xì)菌的黏附率=細(xì)菌黏附Caco-2細(xì)胞并洗脫后細(xì)胞懸液的相對(duì)熒光強(qiáng)度/細(xì)菌黏附Caco-2細(xì)胞前細(xì)胞懸液的相對(duì)熒光強(qiáng)度×100%。

1.2.7乳酸菌菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析根據(jù)細(xì)菌類16S rRNA保守序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，引物由北京全式金生物技術(shù)有限公司合成。以分離菌株的DNA為模板，雙蒸水為陰性對(duì)照，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，在GenBank中進(jìn)行BLAST序列分析，并用貝葉斯法(Bayesian inference，BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：2×MixTaq酶25 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物各1.25 μL，雙蒸水補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min。

1.2.8乳酸菌生長曲線測定將活化后的菌株，按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接入新鮮MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)。以MRS空白液為對(duì)照，每隔2 h取細(xì)菌培養(yǎng)液于600 nm測定吸光度(OD600)，并取1 mL菌液進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，持續(xù)檢測24 h。

1.2.9小鼠安全性檢驗(yàn)試驗(yàn)取6～8周齡的BALB/c 雄性小鼠，體質(zhì)量(20±2) g/只，隨機(jī)分成2個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，共計(jì)3組，每組15只，整個(gè)試驗(yàn)過程自由采食和飲水。將2株待測乳酸菌(FB027和SE013)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長期，用無菌PBS (pH 7.4)洗滌并調(diào)整其含量為1×109CFU/mL。2個(gè)試驗(yàn)組小鼠每天分別口服1次200 μL的待測乳酸菌液，對(duì)照組小鼠每天口服1次200 μL的PBS (pH 7.4)，連續(xù)14 d，觀察小鼠生長情況。試驗(yàn)結(jié)束后，取各組小鼠十二指腸、回腸和結(jié)腸黏膜進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1豬源乳酸菌的分離純化

7份樣品(2份豬糞便、5份豬腸道黏膜刮取物)經(jīng)分離純化共獲得56株不同形態(tài)的乳酸菌，菌落形態(tài)為圓形或橢圓形、乳白色或半透明、邊緣整齊、表面光滑、中間隆起；有融鈣圈，接觸酶反應(yīng)均為陰性，革蘭氏染色均為陽性，菌體形態(tài)為桿狀或鏈球狀，無芽孢，單個(gè)、2個(gè)或多個(gè)一線排列。平板計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，糞便中乳酸菌數(shù)量高達(dá)108CFU/g，有21種不同的形態(tài)類型；腸道(十二指腸、空腸、回腸)黏膜內(nèi)乳酸菌數(shù)量為104CFU/g，有35種不同的形態(tài)類型。

2.2豬源乳酸菌的耐酸性試驗(yàn)

正常情況下，豬胃的pH約為 3.0, 流體食物在胃內(nèi)停留時(shí)間為1～2 h[11]，小腸pH在4.0～5.5，大腸pH大于5.0[12]，耐酸性是保障益生乳酸菌通過胃后能存活的先決條件。分離純化的56株菌，經(jīng)過pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基處理后，有27株菌存活率達(dá)到90%以上，其余菌株對(duì)酸較敏感，表明有27株菌對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)性較好。

2.3豬源乳酸菌的耐膽汁試驗(yàn)

乳酸菌隨著食物進(jìn)入口腔，最終到達(dá)小腸末端，豬小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%內(nèi)波動(dòng)[12]，因此乳酸菌要到達(dá)并定殖于腸壁，必須對(duì)膽鹽有一定的耐受力，而膽汁是膽鹽的主要成分。從試驗(yàn)結(jié)果可知，酸耐受性較好的27株菌經(jīng)含體積分?jǐn)?shù)0.2%牛膽汁的MRS液體培養(yǎng)基處理后，有8株菌的耐受性較好，其余菌株對(duì)膽汁較敏感，其中SE013的耐膽汁性存活率最高達(dá)到54.20%(表1)。

表 1　分離乳酸菌的生物學(xué)性能

2.4豬源乳酸菌的抑菌試驗(yàn)

以上述耐酸性和耐膽汁性較好的8株菌作為試驗(yàn)菌株，以鼠傷寒沙門氏菌為指示菌，進(jìn)行抑菌性的分析，抑菌圈直徑的大小反映了待測菌株對(duì)致病菌體外抑制能力的強(qiáng)弱。試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，KC015、SE013、SE007這3株菌的抑菌圈直徑均較大，說明其對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有較強(qiáng)的抑制作用。

2.5豬源乳酸菌的細(xì)胞黏附試驗(yàn)

乳酸菌要在腸壁上定殖并大量繁殖，必須對(duì)宿主細(xì)胞有較強(qiáng)的黏附性。由表1中不同乳酸菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率可知，F(xiàn)B027的黏附能力最強(qiáng)(黏附率為9.713%)， FB048、SE013次之，說明這3株菌可以很好的在腸壁定殖。

2.6豬源乳酸菌的鑒定

通過上述生物學(xué)性能分析，對(duì)篩選的8株菌進(jìn)行16S rRNA序列分析，均擴(kuò)增出1.5 kb左右的片段(圖1)，測序結(jié)果經(jīng)過GenBank比對(duì)分析， 3株菌(FB027、FB034、FB048)為非解乳糖鏈球菌；腸道來源的5株菌中，4株菌(KC004、KC015、SE001、SE007)為魏斯氏菌，1株菌(SE013)為腸系膜明串珠菌(表1)。

圖 1　豬源乳酸菌16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.7豬源乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

細(xì)菌16S rRNA具有功能和進(jìn)化上的同源性，在整體結(jié)構(gòu)上極端保守，攜帶的生物信息可用來進(jìn)行可靠的系統(tǒng)進(jìn)化分析，以準(zhǔn)確定位細(xì)菌菌株的分離地位[13]。本研究選擇豬源乳酸菌FB027和SE013為代表菌株，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

從GenBank中提取鏈球菌屬代表菌株的16S rRNA序列，包括停乳鏈球菌Streptococcusdysgalactiae(GenBank登錄號(hào)：AP011114.1，下同)、化膿性鏈球菌Streptococcuspyogenes(CP003116.1)、唾液鏈球菌Streptococcussalivarius(AB608747.1)、豬鏈球菌Streptococcussuis(AF009507.1)、乳房鏈球菌Streptococcusuberis(AM946015.1)、血紅鏈球菌Streptococcussanguinis(CP000387.1)、巴黎鏈球菌Streptococcuslutetiensis(JN713319.1)、無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae(NC_004116.1)，以乳桿菌Lactobacillussunkii(AB366385.1)為外群，用ClustaⅨ進(jìn)行多序列比對(duì)，貝葉斯法(Bayesian inference，BI)進(jìn)行進(jìn)化分析，用Tree View程序構(gòu)建FB027與以上菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，F(xiàn)B027(Streptococcusalactolyticus)與血紅鏈球菌Streptococcussanguinis(CP000387.1)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近。

圖 2　基于部分16S rRNA基因序列的豬源乳酸菌FB027的系統(tǒng)發(fā)育樹

從GenBank中提取明串珠菌屬代表菌株的16S rRNA序列，包括冷明串珠菌Leuconostocgelidum(AB022921.1)、肉色明串珠菌Leuconostoccarnosum(AB022925.1)、檸檬明串珠菌Leuconostoccitreum(AB022923.1)、偽明串珠菌Leuconostocpseudomesenteroides(AB572039.1)、棕櫚明串珠菌Leuconostocpalmae(AM940225.1)、乳酸明串珠菌Leuconostoclactis(NR_040823.1)、inhae明串珠菌Leuconostocinhae(AY117686.1)、阿根廷明串珠菌Leuconostocargentinum(AF175403.1)，以saguini明串珠菌Bifidobacteriumsaguini(AB559504.2)為外群，用ClustaⅨ進(jìn)行多序列比對(duì)，用Tree View程序構(gòu)建SE013與以上菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，SE013(Leuconostocmesenteroides)與偽明串珠菌Leuconostocpseudomesenteroides(AB572039.1) 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近。

圖 3　基于部分16S rRNA基因序列的豬源乳酸菌SE013的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.8豬源乳酸菌的生長曲線測定結(jié)果

選擇豬源乳酸菌FB027和SE013為試驗(yàn)菌株，進(jìn)行生長曲線測定。由圖4可以看出，F(xiàn)B027、SE013這2菌株的生長趨勢較一致， 2～10 h為對(duì)數(shù)生長期，12 h左右進(jìn)入穩(wěn)定生長期。平板計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果顯示，在10 h時(shí)2株菌的活菌數(shù)均達(dá)到109CFU/mL以上，具有很強(qiáng)的增殖能力。

2.9豬源乳酸菌的安全性檢驗(yàn)

選擇豬源乳酸菌FB027和SE013為試驗(yàn)菌株，進(jìn)行動(dòng)物安全性試驗(yàn)檢測。試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的生長情況均正常，行為活動(dòng)和采食量沒有明顯變化，也無相關(guān)疾病或死亡發(fā)生。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠內(nèi)臟器官?zèng)]有明顯差異，均無肝臟或脾臟腫大現(xiàn)象。取各組小鼠的十二指腸(SE)、回腸(HC)和結(jié)腸(JC)黏膜進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)，結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組(口服FB027和SE013)小鼠腸道中乳酸菌數(shù)量均明顯高于對(duì)照組(口服PBS)，說明這2株乳酸菌均可改善小鼠腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，更利于乳酸菌的生長。

圖 4　豬源乳酸菌FB027和SE013的生長曲線

3討論

近年來，乳酸菌類益生菌被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè)，使用的乳酸菌類型也是多種多樣。有學(xué)者認(rèn)為，腸道菌與寄主之間存在特殊的相互關(guān)系，所以理想的益生菌菌種應(yīng)該來自同源動(dòng)物，這樣才能增強(qiáng)益生菌的特異性功效[14]。因此，本研究以健康豬的糞便和腸道黏膜為樣本，篩選特性優(yōu)良的乳酸菌，為選擇更合適的豬用微生態(tài)飼料添加劑提供理論依據(jù)及可靠菌種。

本試驗(yàn)從陜西八眉豬的7份樣品中最終分離得到3株非解乳糖鏈球菌(Streptococcusalactolyticus)、4株融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)和1株腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。通過酸和膽汁耐受試驗(yàn)及細(xì)胞黏附試驗(yàn)，篩選出了1株黏附能力較強(qiáng)的菌株FB027(非解乳糖鏈球菌)和1株酸和膽汁耐受性較強(qiáng)的菌株SE013(腸系膜明串珠菌)，小鼠口服試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了以上2株菌的安全性，因此推測FB027、SE013這2株菌具有作為豬飼料添加劑的潛力。

非解乳糖鏈球菌最早由Farrow等[15]從豬腸道和雞糞便中分離并報(bào)道，后來Rinkinen等[16]從狗的空腸和糞便中也發(fā)現(xiàn)非解乳糖鏈球菌是主要菌群。Czerwiński等[17]報(bào)道雞盲腸的主要定殖微生物是非解乳糖鏈球菌。在本試驗(yàn)中，3株非解乳糖鏈球菌均分離自豬糞便，其中FB027對(duì)Caco-2細(xì)胞有較高的黏附性，且經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，與血紅鏈球菌Streptococcussanguinis(CP000387.1)親緣關(guān)系最近。明串珠菌在植物產(chǎn)品發(fā)酵中的應(yīng)用已經(jīng)較為廣泛，但是將其作為益生菌，應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)的報(bào)道很少。Kekkonen等[18]經(jīng)過臨床試驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用明串珠菌作為益生菌誘導(dǎo)細(xì)胞因子的功效明顯優(yōu)于乳酸桿菌。Allameh等[19]首次嘗試了將分離自墨魚腸道的腸系膜明串珠菌作為益生菌添加劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中提高了魚產(chǎn)量。本試驗(yàn)所分離的腸系膜明串珠菌SE013對(duì)酸和膽汁具有較高的耐受性，且經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，SE013與偽明串珠菌Leuconostocpseudomesenteroides(AB572039.1)親緣關(guān)系最近。

根據(jù)Rammelsberg等[20]抑菌性分析的標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑< 11 cm為弱抑菌，抑菌圈直徑11～16 cm為中抑菌, 抑菌圈直徑>17 cm為強(qiáng)抑菌。本試驗(yàn)中，F(xiàn)B027、SE013抑菌圈直徑分別為14.0和 15.5 cm，抑菌能力相近且均達(dá)到中等標(biāo)準(zhǔn)。由 Caco-2 細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)B027黏附率最高(9.713%)，具有很高的黏附特性，而SE013黏附率為1.518%，基本可以附著在腸壁細(xì)胞。

根據(jù)FAO/WHO (2006)標(biāo)準(zhǔn)，益生菌篩選須滿足以下3個(gè)基本特點(diǎn)：(1)耐受胃腸黏膜的選擇性環(huán)境；(2)黏附宿主的腸壁細(xì)胞；(3)分泌物或者分解產(chǎn)物為抗菌物質(zhì)[21-22]。而且不同性能的菌株混合使用時(shí)，有互補(bǔ)作用，效果更佳[23]。本試驗(yàn)所分離的2株菌(FB027、SE013)生物學(xué)性能各有優(yōu)勢，而且分離自健康豬糞便或腸道，采用從豬體內(nèi)分離的乳酸菌作為豬飼料活性菌添加劑，來提高豬產(chǎn)量和質(zhì)量，具有更好的潛在應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步通過擴(kuò)大采樣數(shù)量和采樣范圍，有望篩選到同時(shí)具備以上3個(gè)基本特性,且更具應(yīng)用潛力、高效安全的乳酸菌。

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Isolation and characterization of lactic acid bacteria from swine

LI Lin-lina,WANG Ya-tinga,YANG Xinb,ZHOU Luo-xiongb,WANG Li-hongb,DU En-qia

(aCollegeofVeterinaryMedicine,bCollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study isolated lactic acid bacteria from feces and intestinal mucosa of Bamei swine to provide theoretical support and reliable strains for swine probiotic feed additive.【Method】 Feces and intestinal tissue of Shaanxi Bamei swain were collected and lactic acid bacteria were purified.Then,excellent lactic acid bacteria strains were selected by acid and bile resistance,cell adherence and antimicrobial activity experiments,and their taxonomic status was identified by the phylogenetic tree of 16S rRNA.At last,oral administration experiment of mice was conducted to confirm the safety of selected strains. 【Result】 Two excellent lactic acid bacteria strains were selected.The one named FB027 had good tolerance and antibacterial ability,stable growth curve,and better cell adherence activity.The other one named SE013 had good antibacterial and cell adherence activity,stable growth curve,and good acid and bile resistance.According to the phylogenetic tree of 16S rRNA,FB027 was identified as Streptococcus alactolyticus and was highly similar to Streptococcus sanguinis (GenBank No CP000387.1) while SE013 was identified as leuconostoc mesenteroides and was highly similar to Leuconostoc pseudomesenteroides (GenBank No AB572039.1).Furthermore,the two-week continuous oral administration of FB027 and SE013 to mice confirmed that the two strains were healthy without obviously abnormal behaviors,growth,declining food intake and typical anatomy pathological changes.【Conclusion】 The two strains had the potential to be used as feed additives for swine in the future.

Key words:swine;lactic acid bacteria;isolation;biological characterization

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.001

[收稿日期]2014-05-04

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201939)

[作者簡介]李琳琳(1989-)，女，山東濟(jì)寧人，在讀碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail:lill.sky@163.com[通信作者]杜恩岐(1977-)，男，陜西西安人，副教授，博士，主要從事新型動(dòng)物疫苗及納米抗體的研究。

[中圖分類號(hào)]S852.6

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)02-0001-07

E-mail:duenqi227@126.com