Smad7修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝硬化大鼠治療及其機(jī)制研究①

蘇冬娜　吳詩(shī)品

(深圳市人民醫(yī)院暨南大學(xué)第二臨床學(xué)院感染內(nèi)科，深圳518020)

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Smad7修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝硬化大鼠治療及其機(jī)制研究①

蘇冬娜吳詩(shī)品

(深圳市人民醫(yī)院暨南大學(xué)第二臨床學(xué)院感染內(nèi)科，深圳518020)

[摘要]目的：探討Smad7修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝硬化大鼠的治療作用，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床治療方法提供理論依據(jù)。 方法：選取80只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為4組，對(duì)照組(C)：不采取任何干預(yù)措施；肝硬化組(LC)：行大鼠肝硬化模型制備；空載體轉(zhuǎn)染組(Ad-eGFP-LC)：行大鼠肝硬化模型制備后給予Ad-eGFP空載體修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療；治療組(Ad-Smad7-eGFP-LC)：行大鼠肝硬化模型制備后給予Ad-Smad7-eGFP修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療。取各組大鼠的肝臟組織，行HE染色。檢測(cè)各組大鼠體重和肝濕重，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)含量以及肝組織TGFβ1、Smad3以及Smad7 mRNA表達(dá)量。 結(jié)果：BMSCs移植入大鼠體內(nèi)后，Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠肝臟組織病理學(xué)有明顯改善，肝臟纖維化和干細(xì)胞變性壞死的程度明顯降低；Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體重低于C組(P<0.05)，均高于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠肝濕重高于C組(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)ALT、AST表達(dá)均高于C組(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)Alb 及TP表達(dá)量低于C組(P<0.05)，均高于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)TGFβ1、Smad3 mRNA表達(dá)均高于C組(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC組；Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)Smad7 mRNA表達(dá)量均高于C組，Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)。 結(jié)論：Smad7修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入肝硬化大鼠體內(nèi)可減輕疾病的發(fā)生，其機(jī)制可能與減弱TGFβ-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]Smad7；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝硬化

肝硬化是各種慢性肝病發(fā)展的晚期階段，具有發(fā)病率高、治療療效差及死亡率高的特點(diǎn)，我國(guó)是肝硬化的高發(fā)國(guó)家，疾病嚴(yán)重威脅著居民的健康，給家庭和社會(huì)造成了極大地負(fù)擔(dān)，因此研究肝硬化新的治療方法十分迫切。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種具有自我更新、多向分化潛能的多能干細(xì)胞，具有多種免疫調(diào)節(jié)能力，可促進(jìn)肝細(xì)胞再生、轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞和抑制肝纖維化，可部分恢復(fù)肝功能逆轉(zhuǎn)肝硬化，是除了肝移植手術(shù)外從根本上治療肝硬化有效途徑[1]。Smad7是TGFβ-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制因子，與肝硬化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，因此本研究觀察Smad7修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝硬化大鼠的治療作用并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取80只健康SD大鼠，體重160～200 g，均給予普通食料，在恒溫、固定濕度及良好通風(fēng)條件下飼養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，其中對(duì)照組(C)，不采取任何干預(yù)措施；肝硬化對(duì)照組(LC)，行大鼠肝硬化模型制備，并行開腹腔手術(shù)，注射0.4 ml PBS；空載體轉(zhuǎn)染組(Ad-eGFP-LC)：行大鼠肝硬化模型制備后，開腹腔手術(shù)，腹腔注射(3～5)×106(10×106ml-1，0.4 ml)Ad-eGFP空載體修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；治療組(Ad-Smad7-eGFP-LC)：行大鼠肝硬化模型制備后，開腹腔手術(shù)，取(3～5)×106(10×106ml-1,0.4 ml)個(gè)Ad-Smad7-EGFP修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，肝內(nèi)多點(diǎn)注射。

1.1.2主要試劑攜有Smad7的腺病毒(Ad-Smad7-eGFP)及增強(qiáng)綠色熒光蛋白腺病毒(Ad-eGFP)均由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，TRIZOL裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)及TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購(gòu)于TaKaRa公司。Smad7及β-actin抗體均購(gòu)于Abcam公司。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)試劑盒均購(gòu)于Life公司。

1.2方法

1.2.1肝硬化動(dòng)物模型建立大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行模型試驗(yàn)的制備，大鼠腹腔注射四氯化碳橄欖油溶液，按標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)[3]。

1.2.2大鼠BMSCs培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染取2周齡、體重30～40 g雄性SD大鼠，頸椎脫位處死，在無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨，剔除表面肌肉組織，減去骨頭兩端，用1 ml注射器吸取10%血清的1640培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞。離心細(xì)胞懸液后加入紅細(xì)胞裂解液，再次離心收集細(xì)胞后重懸，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，接種于6孔板內(nèi)，置于37℃，5%的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2～3 d進(jìn)行換液一次。培養(yǎng)至12～14 d時(shí)，觀察是否形成較大的細(xì)胞克隆，此時(shí)棄掉原有培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞，并加入0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，然后進(jìn)行首次傳代，直至傳至第三代時(shí)，收集細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度以2×105個(gè)細(xì)胞接種至六孔板,待細(xì)胞基本融合后去除培養(yǎng)基，以PBS清洗2次后等待轉(zhuǎn)染。每孔加入Smad7或空質(zhì)粒慢病毒載體和助轉(zhuǎn)染劑，10 h后換液，2 d后加入新霉素進(jìn)行篩選。在熒光顯微鏡下觀察每孔綠色熒光的表達(dá)情況。

1.2.3BMSCs移植與取樣制備對(duì)于Ad-eGFP-LC及Ad-Smad7-eGFP-LC鼠，在模型構(gòu)建成功的第1天、第5天、第10天行尾靜脈給予相關(guān)質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs注射，對(duì)照組及肝硬化對(duì)照組在相同時(shí)間給予生理鹽水注射，操作第8周時(shí)，稱量大鼠體重記錄，并應(yīng)用10%水合氯醛(0.2 ml/kg)麻醉大鼠，取肝組織稱量記錄肝濕重，并-80℃保存，主動(dòng)脈取血，離心取血清-80℃保存，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4Real-Time RCR測(cè)定實(shí)驗(yàn)所需器械均經(jīng)高壓去RNA酶處理，并經(jīng)0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理，且實(shí)驗(yàn)均在冰塊上操作，降低溫度對(duì)結(jié)果的影響。取待檢測(cè)的細(xì)胞及組織，加入1 ml TRIZOL裂解5 min，一次加入三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇進(jìn)行獲取RNA，10 μl DEPC水溶解RNA沉淀，紫外分光光度儀測(cè)定濃度及純度。應(yīng)用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并應(yīng)用TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，進(jìn)行PCR體系的擴(kuò)增及反應(yīng)。其中，引物序列為：β-actin： 5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′和5′-TGTGGACTTGGGAGA-GGACT-3′； TGFβ1：5′- TGCTAATGGTGGACCGCAA-3′和5′-CACTGCTTCCCGAATGTCTG-3′； Smad3：5′-ATGGAGCTCTGTGAGTTTGCCT-3′和5′-TGGAGG-TAGAACTGGCGTCTCT-3′； Smad7：5′-TTCCTCCGC-TGAAACAGGG-3′和5′-CCTCCCAGTATGCCACCA-C-3′,試驗(yàn)時(shí)每個(gè)樣本和基因做2個(gè)相同的復(fù)孔。

1.2.5Western blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)取待檢測(cè)的細(xì)胞及組織，加入RIPA裂解液，裂解半小時(shí)，高速離心后去上清，即為蛋白提取物。應(yīng)用Brdaofdr法測(cè)定總蛋白量，每孔加樣量為20 μg蛋白,然后進(jìn)行SDS-PAGE分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉后，4℃孵育相應(yīng)的一抗抗體，過(guò)夜。洗液漂洗后，室溫2 h孵育二抗，加入顯色底物，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6HE染色組織塊脫水后石蠟包埋及切片，片厚5 μm，HE染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞壞死程度。

1.2.7冰凍切片觀察肝臟組織中綠色熒光表達(dá)組織冰凍包埋后，入恒冷切片機(jī)內(nèi)開始進(jìn)行切片，片厚18 nm，在熒光顯微鏡下觀察切片并采圖。

1.2.8肝功能檢測(cè)取上清，依據(jù)試劑盒要求采用比色法，測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine a minotransferase， ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate a minotransferase，AST)、總蛋白(Total protein，TP)、白蛋白(Albumin,Alb)，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1各組BMSCs腺病毒轉(zhuǎn)染效率鑒定腺病毒轉(zhuǎn)染之后，熒光顯微鏡下可以清楚地觀察到，空病毒Ad-eGFP轉(zhuǎn)染組及Ad-Smad7-eGFP組BMSCs有明顯的綠色熒光表達(dá)，而對(duì)照組無(wú)熒光表達(dá)。并且，轉(zhuǎn)染之后，Ad-Smad7-eGFP組BMSCs的Smad7 蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組即空病毒Ad-eGFP轉(zhuǎn)染組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體詳見圖1～3。

2.2移植后大鼠肝臟綠色熒光表達(dá)熒光顯微鏡下可見，Ad-eGFP-LC及Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠肝臟可以很容易就找到綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞,它們主要聚集在血管、血竇及肝小葉等部位，而C組即LC組大鼠肝臟切片未見帶有熒光細(xì)胞,說(shuō)明BMSCs細(xì)胞成功在大鼠肝臟定植。具體見圖4。

2.3移植后大鼠病理組織切片HE染色可見，Ad-eGFP-LC及LC組，肝細(xì)胞排列紊亂,壞死明顯,有大量肝臟細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，肝臟組織內(nèi)有大量纖維組織生成,纖維束粗厚,有較多假小葉形成；而Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠肝臟組織病理學(xué)有明顯改善，肝臟纖維化和干細(xì)胞變性壞死的程度明顯降低。具體見圖5。

圖1　轉(zhuǎn)染后BMSCs 綠色熒光表達(dá)(×200)Fig.1　Green fluorescence expression in BMSCs after transfection(×200)Note: A.Control group；B.Ad-eGFP transfected BMSCs group；C.Ad-Smad7-eGFP transfected BMSCs group.

圖2　各組BMSCs Smad7的蛋白表達(dá)水平比較Fig.2　Relative Smad7 protein expression level in each group

圖3　各組BMSCs Smad7的mRNA表達(dá)水平比較Fig.3　Relative Smad7 mRNA expression level in each groupNote: Vs control group,*.P<0.05;vs Ad-eGFP transfected BMSCs group,#.P<0.05.

圖4　大鼠肝臟組織綠色熒光表達(dá)(×100)Fig.4　Green fluorescence expression of liver tissues(×100)Note: A.C group；B.LC group；C.Ad-eGFP-LC group；D.Ad-Smad7-eGFP-LC group.

2.4移植后大鼠體重和肝濕重BMSCs移植入大鼠體內(nèi)后，Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體重低于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均高于Ad-eGFP-LC及LC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠肝濕重高于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC組大鼠體重低于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC組大鼠肝濕重高于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC組大鼠體重和肝濕重均無(wú)差異(P>0.05)，具體見表1。

2.5移植后體內(nèi)肝功能變化BMSCs移植入大鼠體內(nèi)后，Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)ALT、AST表達(dá)均高于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)Alb及TP表達(dá)量低于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均高于Ad-eGFP-LC及LC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC組大鼠體內(nèi)ALT、AST表達(dá)均高于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC組大鼠體內(nèi)Alb 及TP表達(dá)量低于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC組大鼠體內(nèi)ALT、AST、Alb及TP表達(dá)量均無(wú)差異(P>0.05)，具體見表2。

圖5　大鼠病理組織切片(×100)Fig.5　Histopathologic slide of liver sections(×100)Note: A.Control group；B.LC group；C.Ad-eGFP-LC group；D.Ad-Smad7-eGFP-LC group.

GroupsBodyweightWetweightofliverC450.7±78.910.6±7.6LC300.9±79.41)19.7±7.81)Ad-eGFP-LC319.5±82.11)18.9±7.91)Ad-Smad7-eGFP-LC400.2±84.81)2)3)14.7±6.51)2)3)

Note：Vs C,1)P<0.05;vs LC,2)P<0.05;vs Ad-eGFP-LC,3)P<0.05.

2.6移植后體內(nèi)TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)BMSCs移植入大鼠體內(nèi)后，Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)TGFβ1、Smad3 mRNA表達(dá)均高于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均低于Ad-eGFP-LC及LC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)Smad7 mRNA表達(dá)量均高于C組、Ad-eGFP-LC及LC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC組大鼠體內(nèi)TGFβ1，Smad3 mRNA表達(dá)均高于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC組大鼠體內(nèi)Smad7 mRNA表達(dá)均低于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-eGFP-LC及LC組大鼠體內(nèi)TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)量均無(wú)差異(P>0.05)，具體見圖6。

圖6　各組TGFβ1，Smad3，Smad7 mRNA水平比較Fig.6　Relative levels of TGFβ1，Smad3，Smad7 mRNA in each ±s,n=20)Note: Vs C,*.P<0.05;vs LC,#.P<0.05;vs Ad-eGFP-LC,&.P<0.05.

GroupsALT(U/L)AST(U/L)Alb(g/dl)TP(g/dl)C24.8±10.167.9±7.841.7±9.671.7±7.5LC120.6±11.31)139.4±7.11)22.4±8.61)44.8±6.91)Ad-eGFP-LC115.7±10.41)132.7±6.31)23.8±9.11)45.9±6.11)Ad-Smad7-eGFP-LC60.3±11.91)2)3)80.9±7.91)2)3)30.7±8.11)2)3)60.6±5.91)2)3)

Note：Vs C,1)P<0.05;vs LC,2)P<0.05;vs Ad-eGFP-LC,3)P<0.05.

3結(jié)論

肝硬化是一種以彌漫性纖維化的肝組織、再生結(jié)節(jié)和假小葉為特點(diǎn)的慢性疾病，是復(fù)雜的病理過(guò)程，機(jī)制至今不明，現(xiàn)在臨床上針對(duì)性治療仍存在諸多弊處及風(fēng)險(xiǎn)，因此尋找治療肝硬化的替代療法尤為重要。BMSCs是一種具有自我更新、多向分化潛能的多能干細(xì)胞，具有多種免疫調(diào)節(jié)能力，其由德國(guó)病理學(xué)家Cohnheim首次提出，發(fā)現(xiàn)這種貼壁細(xì)胞具有自我復(fù)制更新、高度增殖和多向分化的能力，可分化為多種骨骼及附屬器官組織，參與機(jī)體的多項(xiàng)功能調(diào)節(jié)[4]。最新研究表明，BMSCs是一種免疫特許細(xì)胞，自身不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體及其他共刺激分子，具有對(duì)自然殺傷細(xì)胞及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的逃逸功能，在骨髓抑制的替代治療中有很大的應(yīng)用前景[5]。已有研究表明，BMSCs可通過(guò)多種途徑影響機(jī)體反應(yīng)，針對(duì)BMSCs移植治療可顯著減輕肝硬化大鼠的發(fā)病機(jī)率，但其機(jī)制卻仍未有定論。

在肝硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肌成纖維母細(xì)胞在其中起著重要作用，可通過(guò)合成分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)(Extracelluar matrix,ECM) 導(dǎo)致肝臟纖維化，在這個(gè)過(guò)程中TGFβ-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起著關(guān)鍵作用。TGFβ1是導(dǎo)致肝硬化的最重要的細(xì)胞因子，其可通過(guò)以下途徑導(dǎo)致ECM堆積：①促進(jìn)ECM合成細(xì)胞大量合成ECM；②通過(guò)增強(qiáng)抑制ECM降解酶的活性，減少ECM的降解；③促進(jìn)ECM受體的表達(dá)，從而加強(qiáng)ECM在體內(nèi)致纖維化的作用[6,7]。Smad7是TGF-β下游的效應(yīng)分子，通過(guò)與受體的結(jié)合及磷酸化介導(dǎo)TGF-β信號(hào)傳入細(xì)胞核，作為TGFβ-Smad信號(hào)傳導(dǎo)中重要的負(fù)性調(diào)控蛋白參與肝硬化的治病過(guò)程[8]。Smad7在肝臟中可通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和多種膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而達(dá)到抗纖維化作用。Smad7可通過(guò)以下方式阻斷TGFβ-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：①與Smad2、3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，阻止Smad磷酸化，從而使信號(hào)傳導(dǎo)受阻；②增加泛素介導(dǎo)的TGFβ受體的降解，中斷信號(hào)通路；③減少組蛋白乙?；瘉?lái)抑制信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄；④Smad7可與激活的Smad競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體，阻止通路的磷酸化或多聚化，從而阻斷TGFβ-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，達(dá)到抑制肝臟纖維化的作用[9,10]。

本研究可以看出，Smad7修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入肝硬化大鼠后，可通過(guò)保護(hù)肝功能，降低體內(nèi)炎性細(xì)胞因子分泌從而對(duì)抗肝硬化，具體表現(xiàn)為：①Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體重均高于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)；②Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠肝濕重均低于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)；③Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)ALT、AST表達(dá)均低于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)；④Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)Alb 及TP表達(dá)量均高于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)。并且，由病理切片可以看出，Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠肝臟組織病理學(xué)有明顯改善，肝臟纖維化和干細(xì)胞變性壞死的程度明顯降低。繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，Ad-Smad7-eGFP-LC組大鼠體內(nèi)TGFβ1、Smad3 mRNA表達(dá)均低于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)，Smad7 mRNA表達(dá)量均高于Ad-eGFP-LC及LC組(P<0.05)，提示Smad7修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)控TGFβ-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)干預(yù)肝硬化的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明Smad7修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入肝硬化大鼠體內(nèi)可減輕疾病的發(fā)生，其機(jī)制可能與減弱TGFβ-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。

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[收稿2015-09-01修回2015-11-17]

(編輯倪鵬)

Experimental research of therapeutic effect of Smad7 gene modified bone marrow mesenchymal stem cells on liver cirrhosis rats

SUDong-Na，WUShi-Pin.

DepartmentofInfectiousDiseases，ShenzhenPeople′sHospital，theSecondClinicalMedicineCollege，JinanUniversity，Shenzhen518020，China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of Smad7 gene modified bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) on liver cirrhosis rats，thereby explaining the mechanism of immunoloregulation of BMSCs in vivo.Methods: 80 male Wistar rats were randomly divided into 4 groups,the control group(C),the liver cirrhosis group(LC),adenovirus Ad-eGFP transfected into liver cirrhosis group (Ad-eGFP-LC),and adenovirus Ad-Smad7-eGFP transfected into liver cirrhosis group(Ad-Smad7-eGFP-LC).And then detect HE staining,body weight and wet weight of liver;the expression of ALT,AST,TP,and Alb;the expression of TGFβ1，Smad3,and Smad7 mRNA in all groups. Results: HE staining showed that Ad-Smad7-eGFP-LCs group′s amount of pseudolobules,degree of cell degeneration and adipose degeneration was the lowest under average visual fields.The body weight in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was lower than that in C group(P<0.05),higher than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05);the wet weight of liver in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was higher than that in C group(P<0.05),lower than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05).The expression of ALT,and AST in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was higher than that in C group(P<0.05),lower than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05);the expression of Alb and TP in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was lower than that in C group(P<0.05),higher than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05);the expression of TGFβ1 and Smad3 mRNA in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was higher than that in C group(P<0.05),lower than that in Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05).The expression of Smad7 mRNA in Ad-Smad7-eGFP-LCs group was higher than that in C group,Ad-eGFP-LC and LC group(P<0.05). Conclusion: Smad7 gene modified BMSCs could reduce symptoms of liver cirrhosis rats,and the mechanism maybe involve the inhibition of the signal transduction pathway of TGFβ-Smad.

[Key words]Smad7;Bone marrow mesenchymal stem cells;Liver cirrhosis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.020

作者簡(jiǎn)介：蘇冬娜(1977年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事感染性疾病臨床及基礎(chǔ)研究，E-mail:sudona@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：吳詩(shī)品(1963年-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事感染性疾病臨床及基礎(chǔ)研究，E-mail:wupoem@126.com。

中圖分類號(hào)R657.3+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0692-05

①本文為深圳市科創(chuàng)委立項(xiàng)課題20140320101246。