脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型的建立

王玉明

酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅 酒泉735000

脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型的建立

王玉明

酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅 酒泉735000

急性肺損傷是由創(chuàng)傷、感染、休克等諸多非心源性因素導(dǎo)致的一種急性、進(jìn)行性呼吸障礙。該病的主要特點(diǎn)是出現(xiàn)頑固型低氧血癥、促進(jìn)呼吸頻數(shù)升高、呼吸加重、呼吸困難、X線分析結(jié)果顯示肺泡多出現(xiàn)彌漫性浸潤等。本實(shí)驗(yàn)通過氣管滴注脂多糖的方法建立急性肺損傷動(dòng)物模型，通過HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化、測(cè)定肺組織濕干重比值(W/D)、試劑盒檢測(cè)肺組織MPO活性變化及促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生變化，以驗(yàn)證小鼠急性肺損傷模型是否建立成功。結(jié)果表明，脂多糖刺激顯著破壞了肺臟組織結(jié)構(gòu)、促進(jìn)了大量炎性細(xì)胞浸潤并伴有肺泡壁增厚。脂多糖可以顯著提高肺濕干重比率(W/D)，促進(jìn)BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，并提高肺組織的MPO活性。這些結(jié)果表明，我們成功利用脂多糖建立了小鼠急性肺損傷模型。

急性肺損傷；脂多糖；RAW264.7；核轉(zhuǎn)錄因子-κB; 絲裂原活化蛋白激酶

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型，通過觀察肺組織病理學(xué)變化、測(cè)定肺組織濕干重比值(W/D)、肺組織MPO活性變化及炎性細(xì)胞數(shù)量、促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生變化，以驗(yàn)證小鼠急性肺損傷模型是否建立成功。

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)BALB/c小鼠(6-8周齡，體重20-23 g)，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，小鼠飼養(yǎng)一周左右以適應(yīng)新環(huán)境，給予充足的飼料和飲水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備及生產(chǎn)廠家 -80℃超低溫冰箱日本SANYO公司生產(chǎn)；低溫高速冷凍離心機(jī)德國SORVALL公司生產(chǎn)；顯微鏡，奧林巴斯品牌；酶標(biāo)儀美國BIO-RAD公司生產(chǎn)；水平離心機(jī)長沙湘麓儀器有限公司生產(chǎn)；XW-80A漩渦混合器上海精科實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；Microchemi 4.2以色列DNA BIOIMAGE SYSTERM公司生產(chǎn)；HPS-250生化培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 藥品和試劑及生產(chǎn)廠家 脂多糖(LPS)美國Sigma公司生產(chǎn)；地塞米松磷酸鈉(DEX)注射液新鄉(xiāng)長樂制藥有限公司；MPO測(cè)試盒南京建成科技有限公司生產(chǎn)；TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒美國Biolegend公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均由北京化工廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 ALI模型的構(gòu)建 小鼠禁食8 h，隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、LPS刺激組、LPS+DEX組，每組6只小鼠。DEX組小鼠腹腔注射DEX(5 mg/kg)，而空白對(duì)照組和LPS刺激組小鼠則分別腹腔注射相同體積的生理鹽水，1 h后，用乙醚將小鼠輕微麻醉，LPS組，LPS刺激組和DEX組小鼠分別鼻孔滴入LPS(500μL/kg)，而空白對(duì)照組小鼠鼻孔滴入50 μL生理鹽水。

1.2.2 小鼠肺組織濕干重比值(W/D)的測(cè)定 LPS刺激7 h，頸椎脫臼法處死小鼠，取出肺臟，用吸水紙吸去肺表面的血液后稱重，即其濕重，后將其置入恒溫箱中，80oC烘烤48小時(shí)達(dá)恒重，即其干重。按下列公式W/D:肺W/D=濕重/干重。

1.2.3 小鼠肺組織的病理學(xué)評(píng)估 病理切片制作步驟(1)取材：LPS刺激7 h后頸椎脫臼法處死小鼠，取出肺臟，PBS沖洗干凈，放入固定液中。(2)固定：放入10%甲醛固定液固定24 h，并于石蠟板上修塊，裝填入組織處理盒中。(3)漂洗：自來水沖洗24 h。(4)脫水和透明：將組織處理盒依次做以下處理：分別于70%乙醇、80%乙醇處理12h，90%乙醇、95%乙醇處理2h，100%乙醇Ⅰ處理1 h，100%乙醇Ⅱ處理1 h，而后放入二甲苯中透明30 min。(5)浸蠟、包埋：將組織處理盒浸入石蠟以取代二甲苯，然后從組織盒中取出肺組織，用融化的石臘進(jìn)行包埋，待其凝固。(6)切片：將修整好的組織塊放入切片機(jī)，切片。(7)貼片：用眼科鑷將切片輕輕放入40℃的水面上，待切片在水面上充分展平后，用載玻片將其撈起，使其平整的貼在載玻片上。(8)烘片：將載玻片置于烘箱內(nèi)烤片15～30分鐘，脫去溶化組織間隙的石蠟。

H.E. 染色(1)脫蠟：將載玻片放入二甲苯Ⅰ中處理10 min后，再放入二甲苯Ⅱ中處理10 min。(2)水化：將載玻片依次做以下處理：95%乙醇處理3 min→90%乙醇處理3 min→80%乙醇處理3 min→75%乙醇處理3 min，蒸餾水短暫漂洗2～3次。(3)蘇木精染色：將載玻片放入蘇木精水溶液中染色3 min。(4)分化：將載玻片放入酸水及氨水中分色1～3 s。(5)反藍(lán)：流水沖洗載玻片1小時(shí)后入蒸餾水1～3 s，漂洗2～3次。(6)伊紅染色：將載玻片放入伊紅染色液中染色3 min。(7)脫水透明：將載玻片依次做以下處理：95%乙醇Ⅰ處理30 s→95%乙醇Ⅱ處理30 s→無水乙醇Ⅰ處理3 min→無水乙醇Ⅱ處理3 min。后放入二甲苯中透明30 min。(8)中性樹膠封片：將已透明的載玻片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固(9)鏡下觀察肺臟的組織病理學(xué)變化，采集圖像。

1.2.4 小鼠髓過氧化物酶(MPO)活性的測(cè)定 LPS刺激7h后頸椎脫臼法處死小鼠，取出肺臟，稱取100 mg的肺臟組織。將組織放入勻漿器中，加入1.9 mL的萃取液進(jìn)行勻漿處理，冰上操作每個(gè)標(biāo)本勻漿10 min，勻漿結(jié)束后取0.9 mL的組織勻漿加入0.1 mL磷酸緩沖液，充分混勻后于37℃水浴鍋中水浴15 min，按MPO測(cè)試盒說明書檢測(cè)其活性，操作方法如下：(1)取出酶標(biāo)版，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔以及待測(cè)樣品孔。分別加入樣品稀釋液100 μL、標(biāo)準(zhǔn)品100 μL、待測(cè)樣品100 μL，放置37℃孵育2 h。(2)移除液體，甩干并拍板。然后向各孔加入100 μL配好的檢測(cè)溶液A，貼上覆封孔，37℃反應(yīng)1 h。洗板3次，甩干。(3)每孔加入100 μL檢測(cè)溶液B工作液，37℃反應(yīng)1 h。洗板3次，甩干。(4)每孔加入100 μL底物溶液，37℃避光顯色。(5)每孔再加入50 μL 終止液結(jié)束反應(yīng)。(6)酶標(biāo)儀于450 nm波長處測(cè)定OD值。(7)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析并計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。

1.2.4 BALF中TNF-α、 IL-1β及IL-6細(xì)胞因子的測(cè)定 (1) 樣本的制備 LPS刺激7 h后頸椎脫臼法處死小鼠，分離氣管并進(jìn)行氣管插管。用PBS分3次進(jìn)行肺泡灌洗，所得沖洗液即肺泡灌洗液，4℃ 3 000 rpm離心10 min，取上清液，后按ELISA操作說明書測(cè)其濃度。(2)細(xì)胞因子的測(cè)定①準(zhǔn)備工作：于實(shí)驗(yàn)開始前30 min從冰箱中取出ELISA試劑盒，溫度下降至室溫，所需試劑分別在臨用前15 min按所需濃度配好。②1× 包被液稀釋一抗，每孔100 μL，每組3個(gè)重復(fù)，包被，封板后4℃過夜。③Wash buffer洗板4次，每次200 μL，洗滌1 min，洗滌手法保持一致。④加入稀釋好的待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，每孔100 μL，密封后室溫孵育1 h。⑤Wash buffer洗板4次，每次200 μL，洗滌1 min，洗滌手法保持一致。⑥將二抗用樣品稀釋液稀釋，每孔100 μL，密封后室溫孵育1 h。⑦Wash buffer洗板4次，每次200 μL，洗滌1 min，洗滌手法保持一致。⑧HRP用樣品稀釋液稀釋，每孔100 μL，密封后室溫孵育30 min。⑨Wash buffer洗板4次，每次200 μL，洗滌1 min，洗滌手法保持一致。⑩加入底物顯色液TMB，每孔100 μL，室溫避光孵育15～30 min。最后兩項(xiàng)是至陽性對(duì)照顯現(xiàn)藍(lán)色，立即加入終止液，每孔100 μL。然后測(cè)定A450 nm。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì) 將以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果用Means±SEM形式表示。數(shù)據(jù)差異性均采用方差分析和Student′s檢驗(yàn)進(jìn)行分析。\%P<0.05 和 P\%<0.01 分別代表差異顯著和差異極顯著。

1.3 結(jié)果

1.3.1 小鼠肺濕干重比率的測(cè)定 肺濕干重比率(W/D)可以用來評(píng)估肺水腫的程度。于LPS滴注7h后，對(duì)其肺濕干重比率(W/D)進(jìn)行測(cè)定。如圖1.1(A)所示，與空白對(duì)照組相比，LPS組W/D值顯著升高(﹟\%p\%<0.05))，而DEX組W/D值顯著低于LPS組(\%p*<0.05 或 p\%**<0.01)。

1.3.2 小鼠肺組織病理學(xué)變化 LPS 滴注7 h后，對(duì)肺組織進(jìn)行HE染色。結(jié)果如圖1.1(B)所示，與空白對(duì)照組相比，LPS刺激組肺臟組織破壞較嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤并伴有肺泡壁增厚。

圖1.1 (A)肺濕干重比率(W/D)(\%p*<0.05 或 p\%**<0.01)(B)小鼠肺組織切片(HE染色)。

圖1.2 小鼠肺組織MPO活性(#：\%P<0.05，**：P\%<0.01)

1.3.3 小鼠MPO活性的測(cè)定 LPS 滴注7 h后，對(duì)肺組織進(jìn)行MPO活性測(cè)定。結(jié)果如圖1.2所示，LPS刺激組MPO活性與空白對(duì)照組相比顯著升高(﹟\%p\%<0.05)，DEX組MPO活性明顯低于LPS刺激組(*\%p<0.05，**p\%<0.01)。

1.3.4 小鼠BALF中細(xì)胞因子的測(cè)定 LPS 滴注7 h后，對(duì)BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖1.3所示，與空白對(duì)照組相比，LPS組BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平明顯升高(﹟\%P\%<0.05)，但DEX組BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平明顯降低(* \%P <0.05，** P\% <0.01)。

1.4 結(jié)論

引起ALI的致病因素很多，其高致死率已引起人們的廣泛關(guān)注，也是醫(yī)學(xué)研究中的熱點(diǎn)之一，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。目前，多種動(dòng)物種類已被用來研究ALI，其中，嚙齒類小鼠急性肺損傷模型應(yīng)用最廣泛。由于小鼠體型小，生長迅速，來源容易，已成為ALI實(shí)驗(yàn)研究中一種有效的手段。

圖1.3 小鼠BALF中炎性細(xì)胞因子測(cè)定(#：\%P<0.05，**：P\%<0.01)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠?qū)е路谓M織發(fā)生水腫，伴有中性白細(xì)胞浸潤，損傷上皮組織的完整性等。水腫是急性肺損傷的一個(gè)主要病理特征。本實(shí)驗(yàn)采用氣管滴注的方法建立肺損傷動(dòng)物模型。通過測(cè)定小鼠肺組織濕干重比值(W/D)來評(píng)價(jià)肺組織的水腫程度。結(jié)果顯示LPS能夠顯著地增加肺組織的W/D比值。肺組織病理切片顯示，在LPS組中能夠發(fā)現(xiàn)大量的嗜中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚，且具有明顯的充血淤血現(xiàn)象。髓過氧化物酶(MPO)能夠反映中性粒細(xì)胞的數(shù)量，通過測(cè)定肺組織的MPO活性，來判斷肺組織中中性粒細(xì)胞浸潤的程度，結(jié)果顯示LPS刺激后，MPO活性明顯升高。細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中扮演著重要的作用，如TNF-α、IL-1β和IL-6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在BALF中LPS刺激能夠產(chǎn)生大量的 TNF-α、IL-1β和IL-6。綜合以上結(jié)果表明，利用LPS成功建立了小鼠急性肺損傷模型。

[1] 馬李杰, 李王平, 金發(fā)光. 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展 [J].中華肺部疾病雜志(電子版), 2013(1): 65-68.

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Modeling of Acute Lung Injury in Mice Challenged with LPS

WANG Yu-ming

(JiuquanVocationlandTechnicalCollege,JiuquanGansu735000China)

Acute lung injury (ALI) is an acute and progressive respiratory dysfunction, which is usually caused by trauma, infection, shock, and many other non-cardiac causes. The main features of the disease are stubborn hypoxemia, the breath frequency increases, heavy breathing, dysonea, X-ray analysis showed a diffuse infiltration of alveolar. Model of acute lung injury was established in mice by instilling weasand with LPS. The acute lung injury in mice was evaluated by H.E dyeing, lung tissue for wet dry weight ratio (W/D), MPO activity and inflammatory cytokines were determined. The results showed that lung organization structure damage, inflammatory cells infiltration and alveolar walls thickness were significantly induced by LPS. These results suggested that model of acute lung injury were successfully established in mice by instilling weasand with LPS.

Acute lung injury; LPS; RAW264.7; NF-κB; MAPK

2016-06-20

王玉明( 1974 - ) , 男, 甘肅酒泉人, 講師,碩士, 從事動(dòng)物病理及獸醫(yī)臨床教學(xué)和研究工作。

S 852.3

A

1004-6704(2016)06-0028-00