水澇脅迫下歐李葉片內還原性糖的變化

李麗霞++程小愛++張海平

摘 要：為研究歐李葉片內水澇脅迫下還原性糖的變化，從事先準備好的歐李中取樣，用硫酸-苯酚定糖法測定歐李葉片中還原性糖，與對照比較還原糖的變化。結果顯示，歐李葉片內還原性糖含量在水澇脅迫下先增多，而后再減少。研究認為歐李葉片內還原性糖的變化，使歐李對水澇脅迫產生了抗性。

關鍵詞： 歐李；水澇脅迫；硫酸苯酚法；還原性糖

中圖分類號：S662.3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.003

Changes of the Reducing Sugar in Prunus humilis Leaves under Waterlogging Stress

LI Lixia1， CHENG Xiaoai2， ZHANG Haiping1

（1.Dingxiang County State Forest of Shanxi Province， Dingxiang， Shanxi 035400，China； 2.Taigu County Agricultural Commission， Taigu， Shanxi 030801，China）

Abstract： The changes of the reducing sugar in leaves of Prunus humilis were studied. Reducing sugar was isolated from leaves of Prunus humilis， and changes of the reducing sugar was detected by the method of phenol- sulfuric acid in the waterlogging stress. The results showed that the content of the reducing sugar was increased in the early stage but decreased in the later during waterlogging stress. The changes of reducing sugar could reflect the physiological changes and this can provide theoretical basis for introducing the Prunus humilis.

Key words： Prunus humilis； waterlogging stress； phenol-sulfuric acid method； reducing sugar

隨著全球氣候不斷上升，海嘯、洪水等災害的爆發(fā)頻率不斷增加，世界各國在防澇抗洪、水土保持等問題的研究上注入大量金錢和精力。我國一直以來都是個洪澇災難比較嚴重的國家，有將近2/3的土地受到不同程度的澇害，嚴重影響我國國民的生活[1]。植物對水分的需求有一定的標準，水分過多或者過少都會對植物的新陳代謝、光合作用等造成一定的影響。植物過度地受到水澇脅迫，可能使其發(fā)芽率降低、生長不好，甚至爛苗[2]，并且水澇脅迫會嚴重影響植物的生長發(fā)育，使其遺傳潛力難以發(fā)揮。水澇脅迫不但影響植物的產量，而且限制了植物的廣泛分布。因而，開展植物水澇脅迫研究，可以了解和研究植物對水澇脅迫的響應機制，從而為合理選擇性和定向培育耐澇新品種提供理論依據(jù)。

歐李（鈣果）Prunus humilis Bunge. 屬于薔薇科，李屬（Prunus.L），是中國特有的一個薔薇科櫻桃屬灌木樹種，野生地區(qū)主要包括中西部地區(qū)的山西、陜西、河北、內蒙以及東北等地。歐李（鈣果）作為這種植物的專業(yè)名字是植物分類學家陳嶸先生命名的。

歐李（鈣果）的推廣發(fā)展前景好，作為我國特有的一個野生經(jīng)濟植物具備產業(yè)化開發(fā)潛力。人們對鈣、對鐵、對方便綠色飲料日漸增長的普遍需求，為歐李（鈣果）深加工提供了極為廣闊和可能的發(fā)展前景，給醫(yī)療保健和食品飲料業(yè)提供了無限的商機。在對歐李（鈣果）研究時發(fā)現(xiàn)：歐李（鈣果）果汁、果酒、果脯等消費必將普及且長久不衰；鈣果的種仁具有消腫、利尿、通便的功能，是一種很好的藥材，藥材市場收購價格不扉，醫(yī)藥工業(yè)也可以進行加工；其果實中含有多種對人體有益的礦質元素，尤其是鈣的含量比一般的水果高，為了突出其鈣含量高的特點，便誕生了其商品名“鈣果”。

中國中西部地區(qū)廣大廉價的荒山荒坡，使好栽易活易結實的歐李（鈣果）大面積種植成為可能，為其深加工提供了豐富的生產原料，同時，巨大的市場需求也給加工業(yè)注入了足夠的動力，歐李（鈣果）要產業(yè)化也將成為越來越多人士的共識。鈣果的莖葉可以喂牛，可以利用其生物量大的特點，帶動畜牧業(yè)的發(fā)展。相信我國在歐李（鈣果）的規(guī)模發(fā)展之后，將會在歐李加工產業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、畜牧業(yè)及種苗業(yè)等方面形成系統(tǒng)產業(yè)化開發(fā)的良好局面。

在歐李等植物中，糖是一切物質代謝的基礎，因此，本論文研究歐李（鈣果）葉片內還原性糖的變化。在糖類中，能夠還原斐林（H.von Fehling）試劑或托倫斯（B.Tollens）試劑的糖稱為還原糖。所有的單糖（除二羥丙酮），不論醛糖還是酮糖，都是還原糖。大部分雙糖也是還原糖，蔗糖例外。斐林試劑是含Cu2+ 絡合物的溶液，還原性糖被還原后得到磚紅色Cu2O的沉淀。苯酚-硫酸法利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，它們都可以用來鑒定和測量還原性糖的含量，并且它們各有優(yōu)缺點[3]。所以，分子結構中含有還原性基團（如游離醛基或游離酮基基）的糖，叫還原糖。還原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖等，都是光合作用的產物，是一切物質代謝的基礎。研究表明，植物體內的還原性糖是植物進行呼吸、光合等能量交換和新陳代謝的物質基礎，與植物的生長發(fā)育與抗性緊密相關[4]。近年來，學者對其在苗木水澇脅迫過程中所起的作用進行了研究：隨著水澇脅迫的加深，花旗松、馬尾松、北美喬松苗木針葉內還原性糖的含量呈上升趨勢[5]；荔枝葉片內還原性糖含量增加[6]；通過多經(jīng)濟作物葡萄[7]、櫻桃[8]、蘋果[9]等樹的研究表明，水澇脅迫能使還原性糖在植物體內積累，從而使植物在水澇脅迫下能夠適應并產生抗性。

由于國內外很少對歐李這一經(jīng)濟植物進行研究，因此，筆者對歐李葉片在水澇脅迫下的還原性糖、可溶性蛋白、SOD、POD等的變化進行試驗。硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法由于方法簡單、快速，試驗成本較低，且無需多糖純品等優(yōu)點被廣泛采用。本試驗采用硫酸-苯酚法。傳統(tǒng)的硫酸-苯酚定糖法中，由于平行樣板間的吸光度值相差太大，使其檢測的結果重現(xiàn)性和準確性較差，也容易出現(xiàn)誤差，因此，用改進的硫酸-苯酚定糖法[10]。苯酚-硫酸法是利用硫酸在高溫下使多糖水解并形成糖醛，糖醛在與苯酚形成穩(wěn)定的顯色，生成橙黃色化合物[11]，然后再以比色法測定。測定的還原性糖吸光度OD值，再通過硫酸-苯酚定糖法測定還原性糖的標準曲線差的還原性糖的含量，就可以計算出水澇條件下歐李葉片內還原性糖的變化。

1 材料和方法

1.1 試驗樣品

盆栽歐李（成都大學提供）10株，均分成試驗組和對照組2組，試驗組水澇脅迫（雙套盆法），對照組空白對照，放置于實驗室向陽處。

1.2 試驗儀器和藥品

7200可見分光光度計。蔗糖、硫酸、苯酚均為分析純。

1.3 試驗試劑的配制

（1）100 μg·L-1蔗糖標準溶液的配制。精密稱取蔗糖（105 ℃干燥至恒質量）0.05 g，加入蒸餾水溶解，用蒸餾水定容于500 mL容量瓶中，備用。（2）顯色液的配制。將50 mL濃硫酸緩緩加入蒸餾水中，冷卻至室溫，加入0.6 g苯酚晶體使其溶解配成顯色液。然后置于錐形瓶中，備用。

1.4 還原性糖的提取

（1）樣品處理。將10顆盆栽歐李平均分成兩組：一組根全部浸入水中，編號為試驗組；一組放入正常條件下，編號為對照組，將其放入實驗室向陽處。24 h后開始取材，摘取試驗組的歐李葉片用剪刀粉碎混勻，精確稱取0.1～0.3 g（精確到0.000 1 g）3份樣品分別裝入試管中，編號為1、2、3；用同樣的方法摘取對照組的歐李葉片，粉碎混勻，稱取0.1～0.3 g 3份分別裝入試管中，編號為4、5、6。

（2）還原性糖的提取。于上述的試管中加入2～3 mL蒸餾水，用封袋封住試管口，放入水浴鍋內蒸餾45 min后，放入冷水浴中冷卻至室溫，用漏斗過濾，分別收集濾液于25 mL錐形瓶中編號為1、2、3、4、5、6重復此操作3次。將3次得到的編號分別位1、2、3、4、5、6中的漏液收集，定容于25 mL容量瓶并編號為1、2、3、4、5、6，制成待測液，備用。

1.5 還原性糖的顯色

（1）還原性糖的顯色處理。另取6只試管，編號為7、8、9、10、11、12。再從編號1、2、3、4、5、6容量瓶取0.05 mL樣品待測液，分別加入試管7、8、9、10、11、12中。再于試管中加入0.25 mL顯色液，振蕩混勻后，放入沸水浴中保溫30～35 min，再放入冷水浴中冷卻至室溫，備用。

（2） 測定還原性糖的吸光度OD值。將試管7、8、9、10、11、12中的樣品待測液，用490 nm分光光度計測定其吸光度OD值，并記錄數(shù)據(jù)。

1.6 計算方法

利用M=（C×V）/（W×106）×100%，可以計算出歐李葉片中可溶性糖的含量百分比。式中V為樣品待測液的總體積；C為樣品提取液的還原性糖的密度；W為植物鮮質量；M為可溶性糖含量的百分比。

2 結果與分析

2.1 硫酸-苯酚定糖法測定還原性糖的結果

按表1制作還原性糖的標準曲線，結果如圖1。試驗測得歐李葉片內還原性糖的變化如表2。

試驗期間陽光等其它不定因素的變化如表3。

2.2 歐李葉片中還原糖的含量變化

通過試驗測得歐李葉片吸光度OD值，從圖1的標準曲線中查得歐李葉片的還原性糖含量，統(tǒng)計得歐李葉片內還原糖的含量百分比M的變化。從圖2中可以看出：（1）試驗開始的72 h試驗組歐李葉片內還原性糖百分含量分別是13.67%，40.24%，26.95%，而對照組歐李葉片內還原性糖的百分含量分別是26.13%，27.42%，31.33%，即試驗組歐李葉片的含糖百分比先增加然后減少，而對照組歐李葉片的含糖百分比幾乎不變；（2）試驗開始后72 h試驗組歐李葉片內還原性糖的百分含量分別是30.72%，38.26%，37.13%，而對照組歐李葉片內還原糖百分含量分別為30.70%，44.56%，39.79%，可以看出試驗組和對照組都發(fā)生了變化，且變化狀況都相似，即試驗組和對照組歐李葉片中的含糖百分比都是先增加再減少。

3 結論與討論

從結果分析中知，試驗的前期階段在未受到陽光等環(huán)境因素影響下，水澇脅迫引起的歐李葉片內淀粉減少，還原性糖增加，其主要生理作用是還原性糖參加歐李葉片內滲透調節(jié)[12-13]。植物的滲透作用使歐李等植物適應環(huán)境，增強抗逆性的基礎[14]。還原性糖增加的主要原因有幾點。（1）歐李在水澇脅迫下，使根缺氧，根缺氧會影響葉片的光合作用，這首先導致葉片氣孔關閉，增大CO2向葉片擴散的阻力，繼而影響相關酶的活性[15-17]。（2）淀粉等糖的主動水解，以維持樹木、葉片等體內的滲透勢，保持其生理代謝功能的正常進行。（3）水澇對植物造成脅迫，使可溶性糖不能被光合作用正常利用，造成可溶性糖的積累[15]。研究表明，還原性糖的積累是反抗水澇脅迫的有效指標之一[16]。

在水澇脅迫下，歐李葉片內還原性糖先增加后減少，可以看出植物對水澇脅迫的適應性。植物對水澇脅迫的適應性——抗性，有兩種方式。（1）避逆性：植物在水澇脅迫中，能夠建立起某種屏障，完全或者部分阻止脅迫因子進入它的內部，以避免脅迫因子對它造成傷害。（2）耐逆性：植物在水澇脅迫中，能夠完全或者部分忍受脅迫因子對它造成的傷害，而不至于受到脅迫的傷害，或引起比較小的傷害[17]。

在水澇脅迫下，可使歐李發(fā)生生理和結構的變化，得出植物對水澇脅迫的耐性。（1）水澇脅迫下，植物由于缺氧其呼吸代謝以乙醇發(fā)酵為主，中間產物乙醛和末端產物乙醇過多積累對細胞產生毒素，一些植物可以通過其它代謝途徑，如蘋果酸發(fā)酵、乳酸發(fā)酵等代替乙醇發(fā)酵，減少乙醛、乙醇等積累以減少傷害，適應缺氧環(huán)境[18-21]。（2）水澇脅迫下，一些對水澇脅迫敏感的植物的無氧呼吸加強，有氧呼吸下降，有氧呼吸的場所中線粒體結構發(fā)生顯著的變化，內膜消失，內膜脊腫脹，形狀不規(guī)則。（3）水澇脅迫下，一些對水澇適應較好的植物，一方面可以加快體內乙烯的合成，另一方面在體內擴散能力減少。與此同時，土壤厭氧微生物釋放的乙烯被植物吸收，而乙烯對植物沒有毒害作用，反而可以增加植物適應水澇環(huán)境。（4）水澇脅迫下，有些植物的某些基因才能夠完全表達，這能夠使植物適應水澇環(huán)境[17]。

試驗后期階段，由于歐李受到陽光等不定因素變化的影響，使其葉片內還原性糖變化受到影響。由于陽光等的變弱，使葉片的蒸騰作用減弱，葉片氣孔關閉，光合作用減弱，葉片為了維持其滲透勢，加快多糖等的水解，使還原性糖增加。

參考文獻：

[1]馮道俊.植物水澇脅迫研究進展[J].中國水運（學術版），2006，6（10）：253-254， 252.

[2]趙可夫.植物對水澇脅迫的適應[J].生物學通報，2003，38（12）：11-14.

[3]李雪梅，楊俊慧，張利群，等.還原糖測定方法的比較[J].山東科學，2008，21（2）：18-20.

[4]趙江濤，李曉峰，李航，等.可溶性糖在高等植物代謝調節(jié)中的生理作用[J].安徽農業(yè)科學，2006，34（24）：6423-6425， 6427.

[5]喻方圓，徐錫增，ROBERT D G.水分和熱脅迫對苗木針葉可溶性糖含量的影響[J].南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2004，28（5）：1-5.

[6]陳立松，劉星輝.水分脅迫對荔枝葉片糖代謝的影響及其與抗旱性的關系[J].熱帶作物學報，1999，20（2）：31-36.

[7]劉崇懷.水分脅迫對葡萄幾個生化指標的影響[J].葡萄栽培與釀酒，1991 （3）：12-17.

[8] RANNEY T G， BASSUK N L， WHITLE T H. Osmotic adjustment and solute constituents in leaves and roots of water-stressed cherry tress[J].J Amer Soc Hort Sci，1991，116：684-688.

[9]徐迎春，李紹華，柴成林，等.水分脅迫期間及脅迫解除后蘋果樹源葉碳同化物代謝規(guī)律的研究[J].果樹學報，2001，18（1）：1-6.

[10]徐光域，顏軍，郭曉強，等.硫酸-苯酚定糖法的改進與初步應用[J].食品科學，2005，26（8）：342-346.

[11]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州：浙江大學出版社，1999.

[12]JONES O R，HANSER V L.No-tillage effects on infiltration，runoff and water conservation on dryland[J].American Society of Agriculture Engineers，1994，37（2）：473-479.

[13]童方平，方偉，馬履一，等.濕地松優(yōu)良半同胞家系蛋白質及糖類對水分脅迫的生理響應[J].中國農學通報，2006，22（12）：459-464.

[14]常濤，張玉鑫，趙鵬.根區(qū)溫度對甜瓜幼苗膜脂過氧化和滲透調節(jié)物質的影響[J].北方園藝，2009 （7）：160-162.

[15]霍仕平，晏慶九，宋光英，等.玉米抗旱鑒定的形態(tài)和生理生化指標研究進展[J].干旱地區(qū)農業(yè)研究，1995，13（3）：67-73.

[16]姚遠，閔義，胡新文，等.低溫脅迫對木薯幼苗葉片轉化酶及可溶性糖含量的影響[J].熱帶作物學報，2010，31（4）：556-560.

[17]趙可夫.植物對水澇脅迫的適應[J].生物學通報，2003，38（12）：11-14.

[18]利容千，王建波.植物逆境細胞及生理學[M].武漢：武漢大學出版社，2002.

[19]王玉芬，李娟，路戰(zhàn)遠，等.玉米高產品種光合特性及抗氧化系統(tǒng)對水分脅迫的響應[J].華北農學報，2015 （6）：97-104.

[20]杜紅陽，程明明，楊青華，等.外源亞精胺對澇脅迫下玉米幼苗根系無氧呼吸代謝的調控效應[J].華北農學報，2015 （4）：110-116.

[21]宋新穎，鄔爽，張洪生，等.土壤水分脅迫對不同品種冬小麥生理特性的影響[J].華北農學報，2014 （2）：174-180.