蛋白質(zhì)與多酚相互作用研究進(jìn)展

劉夫國，馬翠翠，王迪，高彥祥

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

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蛋白質(zhì)與多酚相互作用研究進(jìn)展

劉夫國，馬翠翠，王迪，高彥祥*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

摘要植物多酚因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗病毒等多種生理功能，在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。多酚可以與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物從而導(dǎo)致2種化合物的結(jié)構(gòu)、功能和營養(yǎng)特性的變化。影響蛋白質(zhì)與多酚非共價(jià)相互作用的因素包括溫度、pH、蛋白質(zhì)的類型和濃度，以及酚類化合物的類型和結(jié)構(gòu)。與非共價(jià)相互作用相比，蛋白質(zhì)與多酚共價(jià)相互作用將不可逆地改變2種分子的理化性質(zhì)和功能特性。文中介紹了蛋白質(zhì)和多酚之間相互作用的生化機(jī)制，討論了用于研究蛋白質(zhì)與多酚相互作用的方法及所面臨的主要挑戰(zhàn)。同時(shí)，指出了分析蛋白質(zhì)-多酚產(chǎn)物應(yīng)考慮的主要問題。

關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)；多酚；相互作用；機(jī)理；功能特性

酚類化合物是植物體內(nèi)一類最重要的次生代謝產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，以及明顯的抑菌、抗癌、抗衰老和抑制膽固醇升高等功效。攝取一定量的植物多酚能夠有效地預(yù)防和抑制疾病的發(fā)生。隨著現(xiàn)代分離提取技術(shù)的迅猛發(fā)展，大量植物多酚已從植物中分離鑒定出來。科學(xué)研究表明，多元酚結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，如能與蛋白質(zhì)、多糖、生物堿等結(jié)合，能與金屬離子絡(luò)合，具有還原性，能清除羥自由基等[1]。在食品加工及人體消化過程中，多酚能與多種化合物發(fā)生相互作用，其中蛋白質(zhì)是最主要的化合物。

蛋白質(zhì)與多酚通過可逆和不可逆的方式發(fā)生相互作用。可逆的復(fù)合過程通常涉及非共價(jià)相互作用，而大分子和多酚之間形成共價(jià)鍵的過程是不可逆的。共價(jià)復(fù)合物的形成主要源于多酚的氧化和親核加成過程。但是，在多數(shù)情況下，共價(jià)和非共價(jià)相互作用可能同時(shí)發(fā)生，例如綠原酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合[2-3]。本文將重點(diǎn)介紹蛋白質(zhì)與多酚的相互作用、蛋白質(zhì)與多酚相互作用的潛在機(jī)制及相互作用對(duì)蛋白質(zhì)和多酚性質(zhì)的影響。

1蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

蛋白質(zhì)是生命存在和運(yùn)動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是高度復(fù)雜的聚合物。自然界中，生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)由20種結(jié)構(gòu)不同的氨基酸組成。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的不同主要取決于氨基酸的種類、數(shù)量、排列順序和肽鏈的空間結(jié)構(gòu)。在食品體系中，蛋白質(zhì)能夠與其他食品組分復(fù)合，例如多糖和多酚等，復(fù)合方式包括共價(jià)與非共價(jià)相互作用，如圖1所示。研究表明，蛋白質(zhì)與多酚相互作用會(huì)引起蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，溶解性降低而熱穩(wěn)定性可能會(huì)提高[4]。

圖1　蛋白質(zhì)與食品組分間的相互作用示意圖Fig.1　Schematic diagram of interactions between proteins and food ingredients

多酚類化合物是植物中一組化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱，通常含有羥基基團(tuán)連接苯環(huán)的結(jié)構(gòu)，常見的多酚化合物如圖2所示。多酚可分為兩大類：一類是多酚單體，即非聚合物，包括各種黃酮類化合物、綠原酸類、沒食子酸和鞣花酸，也包括一些接有糖苷基的復(fù)合類多酚化合物(如蕓香苷等)；另一類則是由單體聚合而成的低聚體或多聚體，統(tǒng)稱單寧類物質(zhì)，包括縮合型單寧中原花青素和水解型單寧中沒食子單寧和鞣花單寧等。

圖2　常見多酚化合物的結(jié)構(gòu)Fig.2　Chemical structures of the common polyphenolic compounds

多酚與蛋白質(zhì)非共價(jià)和共價(jià)相互作用是2個(gè)影響富含多酚食品品質(zhì)的根本因素。在加工食品中，多酚與大分子非共價(jià)相互作用主要源于弱結(jié)合，即氫鍵和疏水性相互作用的結(jié)果。同時(shí)，由于含酚羥基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，多酚具有高反應(yīng)活性，它們很容易經(jīng)過酶和非酶途徑被氧化，形成鄰醌或鄰半醌，與蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。

2蛋白質(zhì)與多酚非共價(jià)相互作用

蛋白質(zhì)與多酚非共價(jià)鍵的作用包括疏水相互作用、氫鍵、范德華力等。雖然非共價(jià)相互作用很弱(一般小于10 kJ/mol，比通常的共價(jià)鍵鍵能小1～2個(gè)數(shù)量級(jí))，作用范圍為0.3～0.5 nm，但這些分子間弱相互作用力可在一定條件下起協(xié)同作用，形成具有一定方向性和選擇性的強(qiáng)作用力[5]。 例如啤酒、葡萄酒、茶飲料、果蔬汁等在銷售期間容易形成混濁，嚴(yán)重影響到產(chǎn)品的質(zhì)量和貨架期，而蛋白質(zhì)與多酚非共價(jià)相互作用即是引起混濁或沉淀最常見、最重要的原因之一[6]。由于多酚分子結(jié)構(gòu)的多樣性及蛋白質(zhì)分子中存在多種不同功能基團(tuán)，原則上氫鍵、疏水鍵、共價(jià)鍵都可能發(fā)生于蛋白質(zhì)與多酚的相互作用中。至于共價(jià)鍵的形成則是一個(gè)不可逆變化過程，而許多由冷卻造成的混濁當(dāng)重新加熱后又會(huì)部分或全部溶解，這表明在蛋白質(zhì)與多酚的相互作用中沒有共價(jià)鍵合[6]。

2.1分析方法

為了探究蛋白質(zhì)-多酚的相互作用和形成復(fù)合物的性質(zhì)，在分子水平上認(rèn)知蛋白質(zhì)與多酚體系是非常重要的。蛋白質(zhì)與多酚的非共價(jià)相互作用主要通過3種方法來進(jìn)行研究：直接研究溶液中蛋白質(zhì)與多酚形成的復(fù)合物；通過多酚來沉淀蛋白質(zhì)；間接研究蛋白質(zhì)與多酚相互作用對(duì)蛋白質(zhì)活性(主要是酶)造成的影響[4]。由于蛋白質(zhì)-多酚的相互作用較為復(fù)雜，沒有單一的技術(shù)能提供全面的信息，一般通過多種技術(shù)進(jìn)行表征。這些技術(shù)包括熒光光譜、圓二色光譜、傅立葉變換紅外(FTIR)光譜、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、等溫滴定量熱法(ITC)、核磁共振、平衡透析法、濁度測定法、蛋白質(zhì)沉淀法、體積排阻色譜和親和色譜等，表1描述了這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1　直接用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)-多酚非共價(jià)結(jié)合方法的對(duì)比

2.2非共價(jià)相互作用機(jī)理及影響因素

蛋白質(zhì)與多酚的相互作用受到蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)構(gòu)、相對(duì)濃度、溶劑組成以及溶液參數(shù)(pH、離子強(qiáng)度、溫度等)的影響[7]。所有這些因素可以用來解釋蛋白質(zhì)與多酚相互作用的機(jī)理。溶劑組成對(duì)蛋白質(zhì)和單寧相互作用的影響表明，復(fù)合物的形成主要源于氫鍵和疏水相互作用[8]。疏水相互作用被認(rèn)為是蛋白質(zhì)與多酚相互作用最主要的驅(qū)動(dòng)力，氫鍵會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)這種作用。疏水相互作用主要是由多酚的芳香環(huán)和蛋白質(zhì)的疏水位點(diǎn)引起的，如脯氨酸殘基的吡咯環(huán)。氫鍵主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的氫原子受體位點(diǎn)和多酚的羥基基團(tuán)上；其他的相互作用比如離子鍵主要發(fā)生在蛋白質(zhì)帶正電的基團(tuán)(如賴氨酸的ε-氨基基團(tuán))和多酚帶負(fù)電的羥基基團(tuán)上[4]。

氫鍵和疏水鍵都受溫度的影響，因此，在蛋白質(zhì)和多酚形成非共價(jià)復(fù)合物的過程中，溫度是重要因素之一。SASTRY等[9]研究指出，溫度顯著影響葵花籽11S蛋白與綠原酸的結(jié)合。當(dāng)溫度從30 ℃增加到45 ℃，葵花籽11S蛋白與綠原酸的結(jié)合能力顯著降低，在55℃下無相互作用力。Prigent等[10]研究了在5 、25和60 ℃條件下牛血清白蛋白(BSA)與綠原酸非共價(jià)相互作用，結(jié)果表明，隨著溫度的增加，兩者結(jié)合能力降低。

pH也是影響蛋白質(zhì)與多酚非共價(jià)相互作用的重要因素之一。在低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)0.3～3.1時(shí)，蛋白質(zhì)-多酚非共價(jià)復(fù)合物的溶解度最低[11]。低pH值時(shí)，蛋白質(zhì)有更多的結(jié)合位點(diǎn)，蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)合程度較大。在pH≤7條件下，綠原酸能夠與BSA、溶菌酶和α-乳清蛋白非共價(jià)結(jié)合，當(dāng)pH值較低時(shí)，綠原酸與BSA結(jié)合量較多[2]。在較高pH值條件下，由于綠原酸被氧化形成自由基或醌類化合物，綠原酸和蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合能力也較強(qiáng)[3]。

多酚和蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度也會(huì)影響兩者的相互作用。當(dāng)一種蛋白質(zhì)和一種多酚以各種比例混合時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)以下現(xiàn)象：如果蛋白質(zhì)濃度保持恒定，隨著多酚添加量的增加，混濁形成量先是增加，到達(dá)一個(gè)最大值后開始下降；同樣，如果多酚添加量保持不變，改變蛋白質(zhì)濃度，混濁形成量的變化具有類似的趨勢。Siebert等[12]采用模型解釋了這種現(xiàn)象。如圖3所示，假設(shè)蛋白質(zhì)含有固定數(shù)目的多酚結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)多酚含有2個(gè)能與蛋白質(zhì)結(jié)合的末端，當(dāng)末端數(shù)目與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)相等時(shí)，此時(shí)就會(huì)形成很大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生較大的膠體粒子和最強(qiáng)的光散射。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量高于多酚含量，如啤酒體系，每個(gè)多酚可以橋連2個(gè)蛋白質(zhì)分子，但是蛋白質(zhì)不能連接到其他蛋白質(zhì)上，因此形成蛋白質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生少量混濁。當(dāng)多酚含量超過蛋白質(zhì)含量，如蘋果汁體系，幾乎所有的蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)都被多酚所占據(jù)。因此，只被結(jié)合了一個(gè)末端的多酚分子很難在另一個(gè)蛋白質(zhì)上找到合適的位點(diǎn)而把2個(gè)蛋白質(zhì)連起來，同樣也只是形成很小的膠體粒子。該模型能夠預(yù)測蛋白質(zhì)與多酚濃度增加時(shí)溶液體系濁度的變化。例如，當(dāng)單寧酸與BSA相互作用時(shí)，過度增加BSA的含量，不溶復(fù)合物出現(xiàn)溶解現(xiàn)象[13]。

圖3　蛋白質(zhì)與多酚相對(duì)濃度對(duì)其相互作用的影響Fig.3　Effect of relative concentration of proteins to polyphenols on their interactions

此外，多酚和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也影響兩者的結(jié)合[14]。多酚含有大量的酚羥基使其具有一定的親水性，在水中以膠體形式存在。而低親水性多酚能與蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，同時(shí)多酚分子質(zhì)量越高，越能有效地沉淀蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)與多酚結(jié)合取決于蛋白質(zhì)的分子大小、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性及氨基酸的組成。一般來說，具有高堿性殘基含量、高脯氨酸含量、分子質(zhì)量較大、疏水性較強(qiáng)，且結(jié)構(gòu)展開的蛋白質(zhì)更易與多酚發(fā)生非共價(jià)相互作用[4]。

3蛋白質(zhì)與多酚共價(jià)相互作用

酚類化合物具有較高的反應(yīng)活性，許多多酚都能夠被氧化成其相應(yīng)的半醌和醌，它們能夠與親核試劑發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，如蛋白質(zhì)的側(cè)鏈賴氨酸或半胱氨酸基團(tuán)[15]。在食品加工中(例如熱處理)，醌的形成是一個(gè)重要因素，它可能成為分子相互反應(yīng)的底物。例如阿魏酸或香豆酸被氧化形成半醌，然后通過自由基可參與非酶反應(yīng)，包括聚合及分解反應(yīng)等[16]。反應(yīng)的先決條件是產(chǎn)生親電物質(zhì)，進(jìn)行親核(邁克爾型Michael-type)加成[15]。一般來講，反應(yīng)的酚類化合物結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，反應(yīng)產(chǎn)物越復(fù)雜。

由于反應(yīng)產(chǎn)物難以拆分，因此蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)復(fù)合物的分析具有一定的挑戰(zhàn)性。目前，多采用理化方法和光譜特征相結(jié)合的方法來分析反應(yīng)產(chǎn)物。

3.1分析方法

研究蛋白質(zhì)與多酚反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，可采用理化分析或質(zhì)譜分析。理化分析方法集中于評(píng)價(jià)修飾的氨基酸，分析酚類化合物結(jié)合程度或者評(píng)價(jià)2種化合物性質(zhì)的變化。質(zhì)譜分析常常用于鑒定蛋白質(zhì)特定的結(jié)合位點(diǎn)。目前2種方法仍有一定的局限性，其主要原因在于：(1)反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜；(2)蛋白質(zhì)以及酚類化合物在反應(yīng)后仍然能保持一定的活性。

3.1.1理化分析方法

評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)反應(yīng)程度最簡單的方法是分析反應(yīng)前后氨基酸側(cè)鏈的變化。因此可以通過分析氨基酸組成，或通過簡單的比色法來完成。例如采用三硝基苯磺酸測定游離氨基的變化。研究表明，與不同植物多酚共價(jià)結(jié)合后，乳清蛋白的游離氨基含量顯著下降[17]。同時(shí)可以通過熒光法來分析巰基含量的變化。與游離氨基基團(tuán)的分析類似，蛋白質(zhì)與多酚共價(jià)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致游離巰基基團(tuán)下降[18]。熒光測量也可用于色氨酸修飾的變化。在295 nm處激發(fā)的色氨酸是唯一吸收熒光的芳香族氨基酸，通?？稍?20 nm和390 nm之間發(fā)射熒光。因此采用熒光測定可以表征色氨酸基團(tuán)的熒光淬滅。為了證實(shí)形成的鍵是共價(jià)鍵，常在含8 mol/L尿素的條件下測定色氨酸熒光的變化(排除非共價(jià)相互作用)。

同時(shí)，可以通過測定多酚含量來分析多酚與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合，常用的方法有：(1)通過福林酚法測定結(jié)合的酚酸含量；(2)通過堿水解獲得酚酸底物。另外可以利用紫外可見吸收光譜表征蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物來確定結(jié)合的多酚[19]。

蛋白質(zhì)與多酚生成共價(jià)復(fù)合物會(huì)改變蛋白質(zhì)的理化和功能特性，因此共價(jià)反應(yīng)的結(jié)果可以通過蛋白質(zhì)性質(zhì)的變化來進(jìn)行評(píng)價(jià)。蛋白質(zhì)與多酚共價(jià)結(jié)合后，親水-疏水性和溶解性會(huì)發(fā)生改變，并且這些變化會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)(例如乳化性、起泡性)[18]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化可通過采用熒光探針來研究蛋白質(zhì)的表面疏水性，蛋白質(zhì)表面疏水性增加與溶解度的降低通常呈良好的相關(guān)性[15]。

這些理化分析方法可以反映蛋白質(zhì)在共價(jià)相互作用中被修飾的程度，但存在較大的缺點(diǎn)是具有不同氨基酸側(cè)鏈的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)尚未被系統(tǒng)地表征。

3.1.2質(zhì)譜分析方法

分析蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)復(fù)合物的主要目的在于檢測特定的反應(yīng)產(chǎn)物并鑒定相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。通常，質(zhì)譜技術(shù)具有一定的優(yōu)勢。研究表明，添加不同分子后，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)能夠揭示不同分子質(zhì)量的變化[20]。在一定程度上，通過使用蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，通過比對(duì)修飾的和未修飾肽的指紋圖譜，可以鑒定蛋白質(zhì)的反應(yīng)位點(diǎn)[21]。研究表明，在反應(yīng)產(chǎn)物中，未修飾的蛋白質(zhì)仍然占主導(dǎo)地位，因此樣本的純化成為產(chǎn)物分析不可缺少的部分[15]。然而，MALDI-TOF-MS和色譜為基礎(chǔ)的表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)也有其局限性。它們的分辨率取決于蛋白質(zhì)是否被修飾以及修飾程度。多數(shù)情況下只有少量的與蛋白質(zhì)復(fù)合物具有較大差異的反應(yīng)產(chǎn)物被成功鑒定。

3.1.3其他分析方法

目前，熒光猝滅、多光譜方法、電泳、電噴霧質(zhì)譜、高性能親和層析和NMR光譜等已被用來表征蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)相互作用[4, 22]。然而，鑒定多酚在蛋白質(zhì)序列中的特定的結(jié)合位點(diǎn)和相應(yīng)的構(gòu)象仍然具有一定的挑戰(zhàn)性。高性能薄層色譜(HPTLC)作為一種新型的分析方法，在多酚-蛋白質(zhì)相互作用表征方面具有一定的應(yīng)用潛力。一維HPTLC和二維HPTLC已經(jīng)成功地應(yīng)用于肽圖譜的測定[23]，其分離機(jī)理不僅取決于電荷，同樣取決于蛋白質(zhì)的親水/疏水性，因此可通過種類繁多的吸附劑、溶劑和色譜技術(shù)來進(jìn)行優(yōu)化[15]。

3.2共價(jià)相互作用的復(fù)雜性及反應(yīng)機(jī)理

如前所述，在與氨基酸反應(yīng)之前，酚類化合物可能被氧化并反應(yīng)到一定程度。同時(shí)，當(dāng)多酚與蛋白質(zhì)反應(yīng)后，酚類化合物仍保持活性，因此具有再次被氧化的可能性，并進(jìn)一步與蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。這種蛋白質(zhì)交聯(lián)會(huì)生成高相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，反應(yīng)混合物可能包含3種類型的反應(yīng)產(chǎn)物：簡單的反應(yīng)產(chǎn)物，其中酚類化合物被結(jié)合到特定的氨基酸側(cè)鏈；混合的反應(yīng)產(chǎn)物，由結(jié)合的低聚物及底物組成；復(fù)雜的交聯(lián)蛋白質(zhì)及其衍生物等。

制備蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)復(fù)合物的方法主要包括堿法[18]、酶法[3]和自由基法[24]。堿法和酶法的應(yīng)用較早，通常是在氧氣存在的條件下，通過堿處理或者酶催化的方法誘導(dǎo)多酚氧化形成醌，再與蛋白質(zhì)的親核側(cè)鏈形成共價(jià)產(chǎn)物。這些親和基團(tuán)包括賴氨酸側(cè)鏈的ε氨基基團(tuán)，巰基基團(tuán)，或色氨酸的吲哚基團(tuán)等。IEMMA的研究團(tuán)隊(duì)提出了多酚與蛋白質(zhì)接枝的羥基自由基誘導(dǎo)法[24]。通過雙氧水和抗壞血酸進(jìn)行氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，然后該自由基進(jìn)攻蛋白質(zhì)側(cè)鏈的敏感氨基酸殘基，產(chǎn)生活性中間產(chǎn)物，該物質(zhì)隨后同小分子的多酚形成共價(jià)鍵。由于自由基法在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)程序簡單，不會(huì)產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，近年來廣泛用于合成蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)復(fù)合物[25-29]。YOU等[25]分別采用堿法和自由基法制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白-兒茶素共價(jià)復(fù)合物，研究表明，與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白相比，通過堿法和自由基制備的共價(jià)復(fù)合物具有更高的分子質(zhì)量(圖4)。通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素主要與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的賴氨酸和谷氨酸殘基發(fā)生了共價(jià)復(fù)合反應(yīng)。

共價(jià)復(fù)合物1: 通過自由基法制備的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白-兒茶素共價(jià)復(fù)合物；共價(jià)復(fù)合物2: 通過堿法制備的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白-兒茶素共價(jià)復(fù)合物圖4　卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白-兒茶素共價(jià)復(fù)合物的基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜Fig.4　MALDI-TOF-MS of ovotransferrin and ovotransferrin-catechin conjugates.

4相互作用對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響

4.1對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響

目前，有關(guān)蛋白質(zhì)影響多酚的相關(guān)機(jī)理仍不明確，但有關(guān)多酚對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響研究較為深入。蛋白質(zhì)與多酚相互作用會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水-親水性的相應(yīng)變化以及溶解度的改變。這些變化將會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)(例如乳化性、起泡性等)。HASNI等[30]采用傅里葉變換紅外光譜、紫外可見光譜、圓二色光譜、熒光光譜法和分子模擬技術(shù)，在分子水平上研究了α-酪蛋白和β-酪蛋白與茶多酚的相互作用。研究表明，茶多酚主要通過疏水相互作用與α-酪蛋白和β-酪蛋白結(jié)合。由于β-酪蛋白具有更強(qiáng)的疏水性，因此，其與茶多酚結(jié)合得更緊密。多酚減少了酪蛋白的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，增加了無規(guī)則卷曲，酪蛋白的構(gòu)象改變。RAWEL等[31]研究了大豆蛋白和多酚(如綠原酸、咖啡酸和沒食子酸)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)合使復(fù)合物的分子質(zhì)量增加。綠原酸-BSA共價(jià)復(fù)合物的圓二色光譜表明，BSA經(jīng)共價(jià)修飾后，蛋白質(zhì)的α-螺旋下降，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加[32]。

蛋白質(zhì)在食品體系中有多種功能特性，例如溶解性、持水能力、凝膠作用、乳化性等。酚類化合物與蛋白質(zhì)的反應(yīng)可能會(huì)引起蛋白質(zhì)交聯(lián)。這種相互作用也改變了蛋白質(zhì)分子的凈電荷，從而影響了蛋白質(zhì)的溶解性。PRIGENT等[2]研究表明，當(dāng)pH≥8.0時(shí)，由于綠原酸氧化形成醌類化合物，綠原酸的存在會(huì)使溶菌酶的溶解性下降。當(dāng)肌紅蛋白與酚類化合物混合后，其溶解性也發(fā)生變化[33]。由于這些相互作用，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，影響了蛋白質(zhì)分子的表面性能，使它們具有親水性。親水/疏水性的改變不僅影響了蛋白質(zhì)的溶解性，也會(huì)影響乳化性、凝膠作用和起泡性等其他功能特性。

4.2對(duì)蛋白質(zhì)消化特性的影響

在胃腸道中，多酚與蛋白質(zhì)的相互作用將影響蛋白質(zhì)的消化率，導(dǎo)致其營養(yǎng)質(zhì)量下降，這主要?dú)w因于必需氨基酸的破壞及對(duì)蛋白酶的抑制作用。同時(shí)，飲食中蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)合將形成可溶或不可溶的復(fù)合物，影響它們的生物利用度。體外實(shí)驗(yàn)表明，多酚修飾會(huì)使胃腸道酶對(duì)溶菌酶衍生物的消化產(chǎn)生不利影響[20]。然而，由于蛋白質(zhì)構(gòu)象的差異，每種蛋白質(zhì)具有不同的消化特性。

多酚共價(jià)修飾會(huì)影響蛋白質(zhì)及酶的生物活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值降低。大鼠生長和氮平衡實(shí)驗(yàn)表明蛋白質(zhì)與綠原酸共價(jià)結(jié)合會(huì)影響β-乳球蛋白的營養(yǎng)特性[34]。此外，酚類化合物性質(zhì)可能也會(huì)受到影響，例如，因以化學(xué)鍵的形式連接到蛋白質(zhì)上，酚類化合物的抗氧化活性下降[35]。

有研究指出，由于濃縮單寧的存在，蛋白質(zhì)在體內(nèi)和體外的消化率有所下降。蛋白質(zhì)與單寧類物質(zhì)相互作用會(huì)形成不易消化的蛋白質(zhì)-單寧復(fù)合物[14]。研究表明，高粱濃縮單寧能與高粱醇溶蛋白形成復(fù)合物，降低蛋白質(zhì)的消化率[36]。綜上所述，分析蛋白質(zhì)在一定條件下(如食品加工、消費(fèi)、消化)被多酚修飾的程度至關(guān)重要，因?yàn)檫@將影響到蛋白質(zhì)的消化吸收特性。

5研究展望

目前除了對(duì)多酚的植物學(xué)和營養(yǎng)學(xué)方面有較為全面的研究，多酚與植物、食品甚至人體中成分的相互作用的研究仍很稀缺。蛋白質(zhì)和酚類化合物的相互作用是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象，從蛋白質(zhì)與多酚相互作用的幾種可能性來說，共價(jià)反應(yīng)產(chǎn)物似乎是最重要的部分，因?yàn)樗鼈儾豢赡娴赜绊懙鞍踪|(zhì)和多酚的性質(zhì)。多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)反應(yīng)后，反應(yīng)產(chǎn)物在很大程度上保持了植物多酚的化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)賦予蛋白質(zhì)分子許多新的性能，明顯拓寬了植物多酚和蛋白質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域。因此應(yīng)加強(qiáng)蛋白質(zhì)與多酚復(fù)合物的性質(zhì)研究，開發(fā)新型功能材料。同時(shí)，應(yīng)詳細(xì)研究蛋白質(zhì)與多酚相互作用的最適條件以改善食品加工過程，最大限度地提高食品的營養(yǎng)和功能特性。

近年來分析技術(shù)得到了快速發(fā)展，但仍然難以運(yùn)用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)來確定蛋白質(zhì)與多酚相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。因此新技術(shù)的開發(fā)應(yīng)不僅關(guān)注蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)也應(yīng)考慮到參與反應(yīng)的多酚的性質(zhì)。采用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)和光譜聯(lián)用技術(shù)，例如實(shí)現(xiàn)高性能薄層色譜與質(zhì)譜的組合，可能會(huì)激發(fā)新的研究蛋白質(zhì)與多酚共價(jià)復(fù)合物的方法。

參考文獻(xiàn)

[1]魯玉妙, 馬惠玲. 我國植物多酚研究文獻(xiàn)計(jì)量及研究熱點(diǎn)分析 [J]. 食品科學(xué), 2012, 33(17): 290-296.

[2]PRIGENT S V E, GRUPPEN H, VISSER A J W G, et al. Effects of non-covalent interactions with 5-O-caffeoylquinic acid (chlorogenic acid) on the heat denaturation and solubility of globular proteins [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(17): 5 088-5 095.

[3]PRIGENT S V E, VORAGEN A G J, VISSER A J W G, et al. Covalent interactions between proteins and oxidation products of caffeoylquinic acid (chlorogenic acid) [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2007, 87(13): 2 502-2 510.

[4]LE BOURVELLEC C, RENARD C. Interactions between polyphenols and macromolecules: quantification methods and mechanisms [J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2012, 52(3): 213-248.

[5]李銳, 任海平, 孫艷亭, 等. 小分子與生物大分子間非共價(jià)相互作用分析方法研究進(jìn)展 [J]. 分析化學(xué), 2006, 34(12): 1 801-1 806.

[6]SIEBERT K J. Protein-polyphenol haze in beverages [J]. Food Technology, 1999, 53(1): 54-57.

[7]BANDYOPADHYAY P, GHOSH A K, GHOSH C. Recent developments on polyphenol-protein interactions: effects on tea and coffee taste, antioxidant properties and the digestive system [J]. Food & Function, 2012, 3(6): 592-605.

[8]HAGERMAN A E, KLUCHER K M. Tannin-protein interactions[C]/Plantflavonoids in biology and medicine: biochemical, pharmacological, and structure relationships. Liss, Inc., New York (USA), 1986： 67-76.

[9]SASTRY M C S, RAO M S N. Binding of chlorogenic acid by the isolated polyphenol-free 11 S protein of sunflower (Helianthusannuus) seed [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1990, 38(12): 2 103-2 110.

[10]PRIGENT S V E, GRUPPEN H, VISSER A J W G, et al. Effects of non-covalent interactions with 5-O-caffeoylquinic acid (chlorogenic acid) on the heat denaturation and solubility of globular proteins [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(17): 5 088-5 095.

[11]NACZK M, GRANT S, ZADERNOWSKI R, et al. Protein precipitating capacity of phenolics of wild blueberry leaves and fruits [J]. Food Chemistry, 2006, 96(4): 640-647.

[12]SIEBERT K J, TROUKHANOVA N V, LYNN P Y. Nature of polyphenol-protein interactions [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44(1): 80-85.

[13]DE FREITAS V, CARVALHO E, MATEUS N. Study of carbohydrate influence on protein-tannin aggregation by nephelometry [J]. Food Chemistry, 2003, 81(4): 503-509.

[14]OZDAL T, CAPANOGLU E, ALTAY F.A review on protein-phenolic interactions and associated changes [J]. Food Research International, 2013, 51(2): 954-970.

[15]ROHN S. Possibilities and limitations in the analysis of covalent interactions between phenolic compounds and proteins [J]. Food Research International, 2014, 65: 13-19.

[16]SELINHEIMO E, AUTIO K, KRUUS K, et al. Elucidating the mechanism of laccase and tyrosinase in wheat bread making [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(15): 6 357-6 365.

[17]RAWEL H M, KROLL J, HOHL U C. Model studies on reactions of plant phenols with whey proteins [J]. Food/Nahrung, 2001, 45(2): 72-81.

[18]KROLL J, RAWEL H M, ROHN S. Reactions of plant phenolics with food proteins and enzymes under special consideration of covalent bonds [J]. Food Science and Technology Research, 2003, 9(3): 205-218.

[19]ROHN S, RAWEL H M, KROLL J. Inhibitory effects of plant phenols on the activity of selected enzymes [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(12): 3 566-3 571.

[20]RAWEL H M, KROLL J, ROHN S. Reactions of phenolic substances with lysozyme—physicochemical characterisation and proteolytic digestion of the derivatives [J]. Food Chemistry, 2001, 72(1): 59-71.

[21]RAWEL H M, RONH S, KROLL J, et al. Surface enhanced laser desorptions ionization-time of flight-mass spectrometry analysis in complex food and biological systems [J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2005, 49(12): 1 104-1 111.

[22]XIAOJ, KAI G. A review of dietary polyphenol-plasma protein interactions: Characterization, influence on the bioactivity, and structure-affinity relationship [J]. Critical reviews in Food Science and Nutrition, 2012, 52(1): 85-101.

[23]TSCHERCH K, BILLER J, LEHMANN M, et al. One- and two-dimensional high-performance thin-layer chromatography as an alternative analytical tool for investigating polyphenol-protein interactions [J]. Phytochemical Analysis, 2013, 24(5): 436-445.

[24]SPIZZIRRI U G, IEMMA F, PUOCI F, et al. Synthesis of antioxidant polymers by grafting of gallic acid and catechin on gelatin [J]. Biomacromolecules, 2009, 10(7): 1 923-1 930.

[25]YOU J, LUO Y, WU J. Conjugation of ovotransferrin with catechin shows improved antioxidant activity [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(12): 2 581-2 587.

[26]YI J, ZHANG Y, LIANG R, et al. Beta-carotene chemical stability in nanoemulsions was improved by stabilized with β-lactoglobulin-catechin conjugates through free radical method [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 63(1): 297-303.

[27]CIRILLO G, MAURO M V, SPIZZIRRI U G, et al. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of conjugates based on fluoroquinolon-type antibiotics and gelatin [J]. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2014, 25(1): 67-77.

[28]LIU F, SUN C, YANG W, et al. Structural characterization and functional evaluation of lactoferrin-polyphenol conjugates formed by free-radical graft copolymerization [J]. RSC Advances, 2015, 5(20): 15 641-15 651.

[29]劉夫國, 王迪, 楊偉, 等. 乳鐵蛋白-多酚對(duì)β-胡蘿卜素乳液穩(wěn)定性的影響 [J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2015, 46(6): 212-217, 225.

[30]HASNI I, BOURASSA P, HAMDANI S, et al. Interaction of milk α-and β-caseins with tea polyphenols [J]. Food Chemistry, 2011, 126(2): 630-639.

[31]RAWEL H M, CZAJKA D, ROHN S, et al. Interactions of different phenolic acids and flavonoids with soy proteins [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2002, 30(3): 137-150.

[32]RAWEL H M, ROHN S, KRUSE H P, et al. Structural changes induced in bovine serum albumin by covalent attachment of chlorogenic acid [J]. Food Chemistry, 2002, 78(4): 443-455.

[33]KROLL J, RAWEL H M. Reactions of plant phenols with myoglobin: influence of chemical structure of the phenolic compounds[J]. Journal of Food Science, 2001, 66(1): 48-58.

[34]PETZKE K J, SCHUPPE S, ROHN S, et al. Chlorogenic acid moderately decreases the quality of whey proteins in rats [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(9): 3 714-3 720.

[35]ROHN S, RAWEL H M, KROLL J. Antioxidant activity of protein-bound quercetin [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(15): 4 725-4 729.

[36]EMMAMBUX N M, TAYLOR J. Sorghum kafirin interaction with various phenolic compounds [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2003, 83(5): 402-407.

Recent research progress on interactions between polyphenols and proteins

LIU Fu-guo, MA Cui-cui, WANG Di, GAO Yan-xiang*

(College of FoodScience and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

ABSTRACTBecause of its unique chemical structure, plant polyphenol has a variety of physiological functions, such as anti-tumor, anti-oxidation, anti-bacterial, anti-viral, et al. Polyphenols have been widely used in the fields of agriculture, food and medicine. Polyphenols can make complexes with proteins which leading the changes in the structure, functional and nutritional properties of the two compounds. Polyphenol-protein interactions depend on several factors, such as temperature, pH, structure and concentration of proteins, as well as the type and structure of the phenolic compounds. Compared with the non-covalent interactions, covalent interactions between protein and polyphenols will irreversibly alter the physicochemical properties and functional characteristics of the two molecules. This article described the biochemical mechanisms of interaction between proteins and polyphenols, discussed methods for the study of the interactions and the main challenges faced. Meanwhile, it also pointed out the main issues to be considered when analyzing the complexes. This article gives a better understanding of the functional consequences of these interactions on food/biological systems.

Key wordsproteins; polyphenols; interactions; mechanism; functional properties

收稿日期：2015-07-31，改回日期：2015-08-28

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31371835)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602048

第一作者：博士研究生(高彥祥教授為通訊作者，E-mail：gyxcau@126.com)。