五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機(jī)理及效果

馮亞凈,張媛媛，王瑞鑫，李書國

(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊，050018)

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五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機(jī)理及效果

馮亞凈,張媛媛，王瑞鑫，李書國*

(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊，050018)

摘要研究了五味子中的抗菌成分木脂素對食品中常見致病菌大腸桿菌的抑制作用及抑菌機(jī)理。采用牛津杯法測定抑菌圈直徑、倍比稀釋法測定最低抑菌濃度，評價(jià)了木脂素對大腸桿菌的抑菌效果；并通過測定微生物的生長曲線、電導(dǎo)率、耗糖率及掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)圖來推測、觀察抑菌機(jī)理。結(jié)果表明：木脂素對大腸桿菌有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑達(dá)27 mm，最低抑菌質(zhì)量濃度為6.25 mg/mL；生長曲線的結(jié)果表明，木脂素可抑制大腸桿菌對數(shù)期的生長；電導(dǎo)率和耗糖率的測定及掃描電鏡表明，其抑菌機(jī)理之一是破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜的平滑形態(tài)，內(nèi)容物大量流出，造成代謝紊亂，影響對糖類等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而發(fā)揮抗菌抑菌作用。

關(guān)鍵詞五味子；木脂素；抑菌效果；抑菌機(jī)理；食品安全

食品營養(yǎng)豐富，不但能夠?yàn)槿梭w提供各種所需的營養(yǎng)物質(zhì)，也為微生物的滋生和繁殖提供了優(yōu)越的條件，食用腐敗變質(zhì)的食品會(huì)導(dǎo)致食品安全問題，棄之則造成食物的資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失，因此食品的防腐保鮮是現(xiàn)代食品工業(yè)面臨的主要問題之一。在食品中添加適量的安全高效的抗菌劑、抑菌劑，是預(yù)防食品腐爛變質(zhì)造成浪費(fèi)和保證食品安全問題的主要措施。一般認(rèn)為，食品防腐劑抑制微生物的機(jī)制主要是通過影響微生物的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，這些亞結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及與代謝有關(guān)的酶等，只要抑制其中一個(gè)亞結(jié)構(gòu)，微生物就會(huì)被抑制甚至殺滅[1]。植物源食品防腐劑具有安全性高、來源廣泛、天然等優(yōu)點(diǎn)，已成為食品防腐保鮮研究的熱點(diǎn)之一。

五味子FructusSchisandraeChinensis，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為木蘭科植物五味子(SchisandrachinensisTurczBaill)干燥成熟的果實(shí)[2]，廣泛分布在我國南部地區(qū)，是我國重要的藥用植物資源之一[3]，北五味子在一定的貯存條件下存放數(shù)年不發(fā)霉。前人的研究表明，五味子中有效的抗菌抑菌成分為木脂素類物質(zhì)，主要以五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等為代表[4-5]，是一類以 1，2，3，4-聯(lián)苯-1，3-環(huán)辛二烯為母核的木脂素，具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、保肝降酶、鎮(zhèn)痛以及免疫調(diào)節(jié)等作用[6-7]，還具有溫補(bǔ)、益氣、生津、護(hù)肝[8]、降糖[9]、減輕疲勞、改善心血管功能等保健作用?；谶@些已確定的藥理作用，五味子被廣泛應(yīng)用于中藥制劑和中醫(yī)臨床中，目前對其研究也主要集中在成分分析和種類差異上[10]，而對其在食品中防腐保鮮的應(yīng)用及抑菌機(jī)理的研究較少。若能將五味子提取物開發(fā)成為食品防腐劑，不僅能夠延緩食品的腐敗變質(zhì)，而且還可利用其保健功能作用，對人體產(chǎn)生有益的影響。本文旨在研究五味子中木脂素提取物的抗菌抑菌作用及抑菌機(jī)理，以期為開發(fā)成天然、高效的植物源食品防腐劑、發(fā)揮五味子的保健功能和在食品工業(yè)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

五味子(FructusSchisandraeChinensis)：石家莊市神威大藥房；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉(生物試劑)：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉(分析純)：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；蔗糖(分析純)：天津博迪化工股份有限公司；氯化鈉(分析純)：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；丙酸鈣、脫氫乙酸鈉(食用級)：石家莊市食品添加劑公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)：來源于河北科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2主要儀器設(shè)備

手提式壓力蒸汽滅菌鍋(YMSII-280B型)，寧波市鎮(zhèn)海金鑫醫(yī)療器械有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LHS-15 型)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070型)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜(YPW-I型)，上海通特電訊設(shè)備廠；快速提取儀(SZF-06A型)，上海新嘉電子有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS-1型)，上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2000型)，上海尤尼柯儀器有限公司；場發(fā)射掃描電鏡(HITACHI S-4800-Ⅰ型)，日本Hitachi公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1五味子木脂素的提取

五味子經(jīng)60 ℃干燥2 h后粉碎，采用超聲波輔助乙醇提取的方法，在乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80 %、溫度85 ℃，超聲時(shí)間30 min，料液比1∶8的條件下回流提取2 h，得五味子木脂素提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，冷凍干燥成粉，4 ℃冰箱密閉保存，備用。

1.3.2抑菌效果的測定

將大腸桿菌菌種活化后，用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整菌懸液濃度在107～108CFU/mL，備用。將木脂素粉末1.0 g溶于20 mL 體積分?jǐn)?shù)80 %的乙醇中，制成濃度為50 mg/mL的抑菌液，以體積分?jǐn)?shù)80 %的乙醇做對照，采用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次。以體積分?jǐn)?shù)80 %的乙醇配制相同濃度的化學(xué)防腐劑丙酸鈣、脫氫乙酸鈉為對照。將各平板置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度37 ℃，濕度80%，24 h，用十字交叉法計(jì)算平均抑菌圈直徑大小。

1.3.3最低抑菌濃度MIC的測定

采用倍比稀釋法，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇將木脂素稀釋成一系列濃度梯度的溶液，分別2 mL溶液加入到18 mL的培養(yǎng)基中，使得其終質(zhì)量濃度為25，12.5，6.25，3.125，1.25，0.625，0.3125 mg/mL，倒入培養(yǎng)皿，待凝固后均勻涂布菌懸液各100 μL，37 ℃溫度培養(yǎng)48 h，每個(gè)濃度重復(fù)3次，觀察菌落生長狀況，無菌生長的最低濃度即為最低抑菌濃度。

1.3.4抑菌機(jī)理的研究

1.3.4.1五味子木脂素對大腸桿菌生長情況影響的測定

取14個(gè)試管分為兩組，分別依次編號為試驗(yàn)組和對照組1～11號，分別在試管中加入8 mL液體培養(yǎng)基，高溫滅菌備用。試驗(yàn)組11支試管中分別加入適量木脂素提取液使其終濃度為1.3.3中得到的最低抑菌濃度，菌懸液0.2 mL，對照組加入與試驗(yàn)組等量的體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液和菌懸液0.2 mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)。將試驗(yàn)組和對照組的試管按編號順序分別于0、2、5、9、12、15、20、25、30、33、36 h取出，振蕩均勻，于波長600 nm處測定吸光度值，根據(jù)OD值繪制出生長曲線。

1.3.4.2大腸桿菌菌懸液電導(dǎo)率的測定

用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度為107CFU/mL，移取1.5 mL菌液于50 mL燒杯中，加入30 mL去離子水和1.5 mL的1 MIC的木脂素溶液，然后分別在0、5、20、30、60、90、120、150和180 min時(shí)測定電導(dǎo)率，每次試驗(yàn)重復(fù)3次；以添加1.5 mL體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇的組為對照。

1.3.4.3菌體消耗糖量的測定

根據(jù)蒽酮比色法[11]測定培養(yǎng)液中糖含量。添加適量提取液到活化的菌液中，適宜條件培養(yǎng)，每隔2 h取上清液100 μL，稀釋至1 mL，冷水浴5 min后，加入4 mL蒽酮試劑并搖勻，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫并靜置1 min，在620 nm處測吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算含糖量；以不添加五味子木脂素提取液為對照。

1.3.4.4菌體形態(tài)觀察

為進(jìn)一步確定抑菌機(jī)理是否為破壞細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察菌體形態(tài)。大腸桿菌接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h(濃度調(diào)整為1 ×107CFU/mL)。取10 mL 菌懸液分別加入0 MIC、1 MIC濃度的木脂素溶液，所有樣品均培養(yǎng)4 h。取出菌液用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)清洗3次，2.5%戊二醛溶液在4 ℃條件下固定過夜。梯度濃度的酒精溶液(30%、50%、70%、80%、90%、100%)逐級脫水，每次20 min，離心(8 000 r/min，5 min)，棄上清液，100%乙醇脫水2次。叔丁醇置換酒精2次，每次20 min，干燥，離子濺噴金，上SEM 觀察。

1.3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以上測定均為3組平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示。利用spass17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05)，文中的數(shù)據(jù)圖均利用OriginLab Origin V8.0處理完成。

2結(jié)果與討論

2.1五味子木脂素的抑菌效果

由圖1可知，體積分?jǐn)?shù)80%乙醇對照對其抑菌圈直徑為8 mm，添加50 mg/mL的五味子木脂素提取物對大腸桿菌的平均抑菌圈大小為27 mm，而相同濃度的化學(xué)防腐劑脫氫乙酸鈉和丙酸鈣的平均抑菌圈直徑分別為24 mm、14 mm，二者對大腸桿菌的抑菌效果均低于五味子木脂素提取液，說明五味子木脂素對大腸桿菌具有顯著的抑制作。

a-木脂素提取液;b-體積分?jǐn)?shù)80 %乙醇對照；1-五味子木脂素提取液;2-脫氫乙酸鈉溶液;3-丙酸鈣溶液圖1　五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌效果Fig.1　Antibacterial effect of lignanoid against E. coli

2.2五味子木脂素對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)

由表1可知，五味子木脂素提取液對大腸桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為6.25 mg/mL，表明低濃度的木脂素溶液仍然可以表現(xiàn)出抑菌活性。

表1　大腸桿菌最低抑菌濃度(MIC)

2.3抑菌機(jī)理的探討

2.3.1五味子木脂素對大腸桿菌生長的影響

通過測定添加五味子木脂素的菌懸液(濃度為107～108CFU/mL)在波長為600 nm 處的吸光值來判斷抑菌效果，吸光值越小，活菌的數(shù)量越少，抑菌效果越好。

由圖2可知，未添加五味子木脂素的大腸桿菌生長良好，具有典型的生長曲線特征，而加入提取物試驗(yàn)組的OD值位于未添加組下方，且五味子木脂素在對數(shù)期即發(fā)揮抑菌作用，大腸桿菌的生長受到抑制，對數(shù)期延后，不再符合正常大腸桿菌的生長趨勢，在12 h后微生物呈緩慢增長的趨勢。結(jié)果說明五味子中的木脂素類物質(zhì)能夠明顯抑制大腸桿菌的生長繁殖，但不能殺死大腸桿菌，作用一定的時(shí)間后抑制作用會(huì)減弱或消除，分析可能是由于抑菌物質(zhì)濃度的下降或者微生物適應(yīng)了新的生長環(huán)境，故大腸桿菌出現(xiàn)了短暫的二次生長。

圖2　木脂素對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.2　Influence of lignanoid on growth curve for E. coli

2.3.2五味子木脂素對大腸桿菌菌液電導(dǎo)率的影響

五味子木脂素的乙醇提取液對大腸桿菌菌液電導(dǎo)率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3　木脂素對大腸桿菌菌液電導(dǎo)率的影響Fig.3　Influence of lignanoid on the electrical conductivity of E. coli

由圖3可知，添加五味子木脂素提取物菌液的電導(dǎo)率明顯高于空白組，在5 min時(shí)的電導(dǎo)率明顯升高，5 min以后增加緩慢，整體上呈上升的趨勢，而空白組幾乎保持不變。電導(dǎo)率是衡量溶液中離子強(qiáng)度高低的一個(gè)特征參數(shù)，其值與離子組分濃度密切相關(guān)。菌體的保護(hù)屏障是細(xì)胞膜，當(dāng)遇到強(qiáng)抑菌劑時(shí)會(huì)使細(xì)胞膜遭到破壞，菌體的保護(hù)屏障被打破，其內(nèi)部的電解質(zhì)外泄至溶液中，從而使電導(dǎo)率上升，因此菌液電導(dǎo)率的變化可以反映細(xì)胞膜通透性的變化[12]。圖3結(jié)果說明了五味子乙醇提取液中的抗菌抑菌成分木脂素對大腸桿菌的抑制作用機(jī)理之一可能是通過破壞其細(xì)胞膜，使細(xì)胞的通透性增加，內(nèi)容物大量滲出而達(dá)到抗菌的目的。也有可能是菌體在代謝過程中產(chǎn)生小分子物質(zhì)而導(dǎo)致電導(dǎo)率變化。

2.3.3五味子木脂素對大腸桿菌糖消耗量的影響

為了驗(yàn)證是否為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致菌液電導(dǎo)率上升，對菌體消耗糖的代謝進(jìn)行了觀察，結(jié)果如圖4所示。

圖4　木脂素大腸桿菌培養(yǎng)液中糖消耗的影響Fig.4　Influence of lignanoid on the consumption of sugar of E. coli

由圖4可知，加入五味子木脂素提取液處理的菌液，其糖濃度較空白組明顯下降，反應(yīng)10 h時(shí)，兩者濃度相差4倍，從而可判斷五味子木脂素對菌體的抑

制作用，一方面可能是先破壞細(xì)胞的微結(jié)構(gòu)從而影響菌體的代謝和繁殖，另一方面也有可能是限制和阻礙了菌體對糖利用吸收的新陳代謝，通過破壞大腸桿菌的代謝達(dá)到抑菌作用。因?yàn)樘亲鳛槲⑸锷L所需的碳源和首要的能量儲(chǔ)備物質(zhì)，對微生物的生長和繁殖有很大的相關(guān)性。當(dāng)微生物處于正常生長狀態(tài)時(shí)，會(huì)吸收和利用外源糖，微生物對培養(yǎng)液中糖的消耗越多，說明生長越旺盛，當(dāng)微生物的吸收代謝受阻或死亡時(shí)，其對糖的利用率會(huì)下降。

2.3.4不同處理情況下大腸桿菌的形態(tài)變化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證五味子木脂素對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞作用，通過掃描電鏡觀察大腸桿菌的形態(tài)變化，結(jié)果如圖5所示。

圖5　不同處理下大腸桿菌SEM圖Fig.5　SEMs of different treatments on E. coli 注：A為正常大腸桿菌的形態(tài)(× 8 k)，B、C、D為五味子木脂素處理過的大腸桿菌的形態(tài)(依次為：×8 k、×20 k、×35 k)

由圖5可知，正常的大腸桿菌菌體細(xì)胞完整、飽滿，表面光滑，分布均勻；而經(jīng)過五味子木脂素提取液處理4 h后的大腸桿菌形態(tài)遭到破壞，聚集粘連。圖5(C)可以看出，菌體細(xì)胞表面褶皺不光滑，菌體形態(tài)發(fā)生變形，部分菌體發(fā)生裂解死亡；圖5(D)中可以明顯的看出菌體形態(tài)的扭曲變形，個(gè)別有孔洞出現(xiàn)。木脂素具有疏水性，可以透過細(xì)胞壁，大腸桿菌菌體細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)變化說明五味子中的抗菌抑菌成分破壞了細(xì)胞膜的平滑形態(tài)，在細(xì)胞膜上形成孔洞，使菌體細(xì)胞破裂，內(nèi)容物滲漏，細(xì)胞代謝發(fā)生紊亂，從而發(fā)揮抗菌抑菌的作用。掃描電鏡圖從形態(tài)學(xué)方面證實(shí)了五味子的抑菌機(jī)理，與以上從電導(dǎo)率變化這一生理角度的抑菌 機(jī)理推測一致。

3結(jié)論

(1)五味子木脂素對大腸桿菌有顯著的抑制作用，其在50 mg/mL濃度下的平均抑菌圈大小為27 mm，優(yōu)于化學(xué)防腐劑。

(2)五味子木脂素的最低抑菌質(zhì)量濃度MIC為6.25 mg/mL。

(3)五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機(jī)理主要是對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成破壞作用，使細(xì)胞膜的平滑形態(tài)變得褶皺，細(xì)胞凹陷變形，甚至破損，影響菌體對糖等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝，使菌體的生長繁殖受到阻礙和抑制。

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Antibacterial effect of Lignanoid fromFructusSchisandraechinensison theEscherichiacoliand its mechanism

FENG Ya-jing, ZHANG Yuan-yuan, WANG Rui-xin, LI Shu-guo*

(Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China)

ABSTRACTThe inhibitory effect of the lignanoid from Fructus Schisandrae chinensis on the common pathogenic bacteria in food and its mechanism were studied. Diameter of inhibition zone (DIZ) and minimum inhibition concentration (MIC) were measured to describe antibacterial activity of lignanoid. More attention was emphasized on the mechanism of antibacterial action against Escherichia coli by scanning electron microscope (SEM) observation and measurement of growth curve, electrical conductivity, and sugar consume. Results showed that DIZ for Escherichia coli reached 27 mm and MIC was 6.25 mg/mL. Bacterial growth curve showed that lignanoid inhibited bacterial growth. In addition, the results showed that one of its antibacterial mechanisms was that it influenced the metabolism and played an antibacterial role due to destruction of the cell membrane of bacteria and leakage of a large number of contents.

Key wordsFructus Schisandrae chinensis; lignanoid; antimicrobial activity; antimicrobial mechanism;food safety

收稿日期：2015-09-17，改回日期：2015-10-16

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(14227121D)；河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201310082045)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602013

第一作者：碩士研究生(李書國教授為通訊作者，E-mail:lishuguo602@126.com)。