胃癌組織中APPL1和COX-2的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

翟俊山，李 楠，宋久剛，王艷梅，朱超慧，吳 凱

解放軍第309醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100091

胃癌組織中APPL1和COX-2的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

翟俊山，李 楠，宋久剛，王艷梅，朱超慧，吳 凱

解放軍第309醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100091

目的 探討胃癌組織中APPL1和COX-2蛋白表達(dá)情況、二者相關(guān)情況及其與患者生存期的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)83例經(jīng)手術(shù)切除石蠟包埋存檔胃癌組織中APPL1和COX-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 胃癌組織中APPL1和COX-2表達(dá)陽性率分別為60.2%(50/83)、62.7%(52/83)。APPL1的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織學(xué)類型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；COX-2的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與組織學(xué)類型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。它們與腫瘤患者年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相關(guān)分析結(jié)果顯示APPL1與COX-2表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。生存曲線研究結(jié)果顯示APPL1和COX-2表達(dá)與患者術(shù)后生存時(shí)間顯著相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 APPL1和COX-2表達(dá)程度與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，影響患者的生存時(shí)間。

APPL1；COX-2；胃癌；預(yù)后；免疫組化

胃癌的發(fā)病率及病死率在我國(guó)一直處于高位水平，因目前尚無有效的早期診斷方法，確診時(shí)往往已是中晚期，雖經(jīng)治療，生存質(zhì)量及時(shí)間仍受到明顯影響[1]，提高胃癌的早期診斷及早期治療對(duì)患者預(yù)后意義重大。研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制，明確其分子機(jī)制，盡可能發(fā)掘腫瘤的“關(guān)鍵”分子標(biāo)志物是目前腫瘤診斷和分子靶向治療的關(guān)鍵。磷酸酪氨酸銜接蛋白(adaptor protein containing PH domain，PTB domain and leucine zipper motif 1，APPL1)表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞內(nèi)一種功能蛋白，與脂聯(lián)素結(jié)合，傳遞細(xì)胞信號(hào)，在多種腫瘤，如結(jié)腸癌[2]、肺癌[3]中表達(dá)均上調(diào)，但尚無在胃癌中表達(dá)情況的報(bào)道。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法聯(lián)合檢測(cè)基因APPL1和環(huán)氧化物酶2(COX-2)在經(jīng)手術(shù)切除石蠟包埋的胃癌組織中的表達(dá)水平，研究APPL1和COX-2表達(dá)產(chǎn)物與胃癌生物學(xué)特性的關(guān)系，為胃癌的早期診斷及分子靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取解放軍第309醫(yī)院2007年1月-2009年12月確診為胃癌后經(jīng)手術(shù)切除治療的患者為研究對(duì)象，共83例。從病理科調(diào)閱其存檔石蠟塊進(jìn)行免疫組織化學(xué)SP法染色。83例患者中男56例，女27例，年齡26.1～83.2歲，平均年齡(57.7±10.3)歲。所有病例術(shù)前均未予新輔助化療，術(shù)后常規(guī)給予化療。從術(shù)后開始隨訪，隨訪內(nèi)容包括患者的一般情況，腫瘤有無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，術(shù)后治療情況；共隨訪5年，生存時(shí)間超過5年的統(tǒng)一算為5+年，隨訪過程中失訪的算作截尾數(shù)據(jù)，生存時(shí)間以上一次能隨訪到的時(shí)間計(jì)算。

1.2 試劑兔抗人APPL1多克隆抗體及APPL1陽性對(duì)照片購(gòu)于上海滬峰生物技術(shù)公司；兔抗人COX-2單克隆抗體及COX-2陽性對(duì)照片購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SP免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)于Invitrogen公司。

1.3 方法(1)免疫組化SP操作方法：對(duì)病理科存檔石蠟塊進(jìn)行切片，每塊切片5張，切片厚度3 μm。分別進(jìn)行空白、APPL1、COX-2及兩種蛋白陽性對(duì)照片染色。染色方法按試劑盒說明書進(jìn)行；(2)結(jié)果判斷：染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分，淺色為1分，中等染色為2分，深染色為3分；染色細(xì)胞陽性率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：沒有細(xì)胞染色為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分與染色細(xì)胞陽性率評(píng)分乘積<3記為(-)，≥3記為(+)。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，平均分作為每張切片的最終結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，生存率比較采用Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)，預(yù)后分析采用Cox多因素回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌中APPL1和COX-2的表達(dá)APPL1蛋白陽性主要為細(xì)胞漿著色，COX-2蛋白陽性主要為細(xì)胞膜著色，顏色從淡黃色至棕褐色。經(jīng)過綜合判斷，APPL1陽性率為60.2%(50/83)，COX-2陽性率為62.7%(52/83)(見圖1)。

圖1 胃癌中APPL1和COX-2的表達(dá)(SP 100×) A：APPL1在胃癌中的表達(dá)；B：COX-2在胃癌中的表達(dá)

2.2 胃癌中APPL1和COX-2表達(dá)與臨床病理的關(guān)系及其相關(guān)性APPL1在胃癌中的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織學(xué)類型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；COX-2在胃癌中的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與不同的組織學(xué)類型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。它們與腫瘤患者年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示APPL1與COX-2表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.618(P<0.05)。

2.3 Kaplan-Meier生存分析分別將APPL1和COX-2表達(dá)分陽性組和陰性組，繪制生存曲線，進(jìn)行Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)。分析結(jié)果顯示APPL1陽性組生存時(shí)間為(23.15±11.17)月，顯著低于陰性組(32.13±18.19)月(P<0.05)； COX-2陽性組生存時(shí)間為(23.15±19.34)月，顯著低于陰性組(33.13±18.23)月(P<0.05)。

2.4 Cox多因素回歸分析對(duì)APPL1和COX-2的表達(dá)情況、浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和年齡、性別分別賦值進(jìn)行Cox多因素分析表明，除年齡、性別及組織學(xué)類型外其他因素均對(duì)生存時(shí)間有影響(P<0.05)。其中APPL1陽性表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)比為1.95(95%CI：1.120～2.724，P<0.05)；COX-2陽性表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)比為2.12(95%CI：1.376～3.032，P<0.05)。

3 討論

APPL1共由709個(gè)氨基酸組成，定位于3號(hào)染色體上，是細(xì)胞內(nèi)的一種功能性蛋白，由Mitsuuchi等[4]于1999年首先發(fā)現(xiàn)。APPL1參與細(xì)胞信號(hào)傳遞，涉及多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路，介導(dǎo)多種細(xì)胞反應(yīng)。APPL1與脂聯(lián)素結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)有抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及平衡血糖等多種功能，越來越受到人們的重視[5]。APPL1在胰腺組織中廣泛分布，病理狀態(tài)下不能正確介導(dǎo)胰島素調(diào)節(jié)血糖功能，與胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病有關(guān)[6]。新近實(shí)驗(yàn)證實(shí)，APPL1還與肝纖維化有關(guān)，在肝纖維化患者血清中APPL1明顯上升，且隨著Child-Pugh分級(jí)增加而增高[7]。APPL1介導(dǎo)了結(jié)直腸癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma， DCC)的抗細(xì)胞凋亡作用，在多種腫瘤組織中，DCC表達(dá)缺失，抗凋亡作用受到影響[8]。APPL1還與人表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor receptor， EGFR)信號(hào)通路密切相關(guān)，在腫瘤組織中，APPL1參與了EGFR信號(hào)通路傳遞，引起了EGFR信號(hào)通路中重要蛋白R(shí)ab5a的過度表達(dá)[9]。且多個(gè)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，APPL1在多種腫瘤如乳腺癌[10]、卵巢癌[11]中高表達(dá)，參與癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究中胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、不同組織學(xué)類型均有APPL1的表達(dá)水平改變，表明APPL1與胃癌關(guān)系密切。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)基因與腫瘤增殖及凋亡密切相關(guān)，其表達(dá)產(chǎn)物COX-2是花生四烯酸代謝過程中的關(guān)鍵酶。COX-2蛋白有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、逃避生物體內(nèi)細(xì)胞免疫監(jiān)視作用，促進(jìn)癌前疾病向腫瘤轉(zhuǎn)化作用[12]；且可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌，促進(jìn)腫瘤新生血管形成，支持腫瘤生長(zhǎng)[13]。在本研究中，COX-2表達(dá)與胃癌的組織學(xué)類型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮COX-2蛋白與腫瘤的組織學(xué)起源關(guān)系不大。

表1 APPL1和COX-2在胃癌表達(dá)及與胃癌臨床病理之間的關(guān)系[例數(shù)(%)]

在本研究中，APPL1與COX-2在胃癌表達(dá)有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.618。APPL1與COX-2分別涉及多條細(xì)胞信號(hào)通路，考慮二者在胃癌的發(fā)病機(jī)制中具有交叉的細(xì)胞信號(hào)通路。查閱文獻(xiàn)得知，MAPK/ERK信號(hào)通路可能在其中起了橋梁作用，該信號(hào)通路被激活后，上調(diào)COX-2分子水平[14]。COX-2可抑制p53在細(xì)胞內(nèi)的聚集，從而抑制細(xì)胞凋亡[15]，這在惡性腫瘤發(fā)生中有重要作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)APPL1通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制TRB3增強(qiáng)胰島素刺激的Akt磷酸化，同時(shí)通過改變Raf-1的磷酸化位點(diǎn)激活MAPK/ERK信號(hào)通路[16]。二者可能就是通過這種內(nèi)在機(jī)制，協(xié)同促進(jìn)胃惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

我們重點(diǎn)研究了APPL1與COX-2在胃癌組織上蛋白表達(dá)的變化及相互關(guān)系，結(jié)果顯示APPL1和COX-2在胃癌組織上均高表達(dá)，表明二者均與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。且在胃癌組織中二者呈正相關(guān)，表明二者通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路具有協(xié)同作用。進(jìn)一步研究二者的內(nèi)在作用機(jī)制，把二者作為同一個(gè)靶點(diǎn)，可為胃癌的診斷治療帶來新亮點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Expressions of APPL1 and COX-2 in gastric carcinoma and relationship with the prognosis of patients

ZHAI Junshan, LI Nan, SONG Jiugang, WANG Yanmei, ZHU Chaohui, WU Kai

Department of Gastroenterology, the 309 Hospital of PLA, Beijing 100091, China

Objective To investigate the expressions of APPL1 and COX-2 in gastric carcinoma and relationship with the prognosis of patients.Methods The expressions of APPL1 and COX-2 were detected by immunohistochemical methods in 83 paraffin-embedding surgical resection specimens.Results The positive expression rates of APPL1 and COX-2 were 60.2% (50/83), 62.7% (52/83). The expression of APPL1 was notably correlated with the depth of invasion, lymph nodes metastasis, TNM stage, pathologic type in gastric carcinoma (P<0.05); The expression of COX-2 was notably correlated with the depth of invasion, lymph nodes metastasis, TNM stage in gastric carcinoma (P<0.05), but not related to the pathologic type (P>0.05). Both of them were not correlated with the age and sex (P>0.05). The expression of APPL1 was positively correlated with COX-2. The expressions of APPL1 and COX-2 were correlated with the survival time of postoperative patients (P<0.05).Conclusion The expressions of APPL1 and COX-2 are obviously correlated with the depth of invasion, lymph nodes metastasis, TNM stage in gastric carcinoma and affect the survival time of postoperative patients.

APPL1; COX-2; Gastric carcinoma; Prognosis; Immunohistochemistry

國(guó)家自然科學(xué)基金(81101852)

翟俊山，主治醫(yī)師，研究方向：胃癌分子生物學(xué)。E-mail：fmmuzjs@163.com

李楠，博士，主任醫(yī)師，研究方向：胃癌分子生物學(xué)。E-mail：xhk309@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.004

R735.2

A

1006-5709(2016)01-0016-04

2015-04-02