SIRT3在食管鱗癌中的表達(dá)及作用機(jī)制

劉 瓊， 何 斌， 任麗華， 邱洪清

張家港市第一人民醫(yī)院(蘇州大學(xué)附屬醫(yī)院張家港醫(yī)院)，江蘇 張家港 215600

SIRT3在食管鱗癌中的表達(dá)及作用機(jī)制

劉 瓊， 何 斌， 任麗華， 邱洪清

張家港市第一人民醫(yī)院(蘇州大學(xué)附屬醫(yī)院張家港醫(yī)院)，江蘇 張家港 215600

目的 探討SIRT3在食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中的表達(dá)及其相關(guān)作用機(jī)制，為ESCC的早期診斷提供依據(jù)。方法 收集ESCC患者癌組織、正常食管組織標(biāo)本各20例，免疫組化(IHC)、蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)各組標(biāo)本中SIRT3的表達(dá)；Western blotting檢測(cè)ESCC細(xì)胞株Eca109在常氧、缺氧(6 h、12 h、24 h)狀態(tài)下SIRT3、HIF-1α蛋白的表達(dá)。結(jié)果 SIRT3蛋白在ESCC組織中的表達(dá)水平高于正常食管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.51±0.06vs0.26±0.04，P<0.05)；缺氧狀態(tài)下Eca109細(xì)胞中SIRT3表達(dá)水平降低，HIF-1α表達(dá)水平升高。結(jié)論 SIRT3的高表達(dá)可能與ESCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；HIF-1α對(duì)ESCC的發(fā)生、發(fā)展有促進(jìn)作用，對(duì)其表達(dá)的檢測(cè)可能會(huì)成為ESCC的早期診斷手段之一。

SIRT3；食管鱗癌；能量代謝

SIRT3(sirtuin3)為沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Sir2)家族成員之一，大部分位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜，具有去乙酰基酶活性。SIRT3被認(rèn)為是調(diào)節(jié)能量平衡的關(guān)鍵，其表達(dá)量的高低影響線(xiàn)粒體功能，進(jìn)而造成細(xì)胞能量代謝、有絲分裂等方面出現(xiàn)異常[1]。目前SIRT3在腫瘤中的作用尚存在爭(zhēng)議[2]，其在食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中的表達(dá)及作用機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)免疫組化(IHC)和蛋白免疫印跡(Western blotting)技術(shù)檢測(cè)SIRT3在ESCC組織中的表達(dá)情況，并初步探討SIRT3在ESCC細(xì)胞中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋凼械谝蝗嗣襻t(yī)院2013年9月-2014年10月ESCC患者手術(shù)切除標(biāo)本，ESCC組織20例，配對(duì)正常食管組織20例。上述標(biāo)本中男14例，女6例，年齡40～75歲，平均年齡(55.3±11.8)歲。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)為ESCC，且術(shù)前均未經(jīng)放療、化療及其他治療。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)ESCC細(xì)胞株Eca109(購(gòu)自上海細(xì)胞研究所)用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧培養(yǎng)即將細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱(1% O2、5% CO2、94% N2)中培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求給予不同的缺氧時(shí)間。

1.3 主要試劑兔抗鼠SIRT3單克隆抗體(貨號(hào)2627)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自北京碧云天公司，GAPDH內(nèi)參購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 IHC方法：蠟塊包埋組織制作切片(4 μm厚度)。切片常規(guī)脫蠟、水化，3% H2O2浸泡。經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。以PBS緩沖液代替抗體為陰性對(duì)照，免疫組化染色有棕黃色或棕褐色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)。每張標(biāo)本切片隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行拍照，利用Image-Pro Plus 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值，并進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.2 Western blotting：常規(guī)提取細(xì)胞蛋白,取50 g蛋白行10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，加5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后，加入SIRT3、HIF-1α一抗(稀釋濃度均為1∶1 000)后4 ℃搖床過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗膜，曝光，顯影。以GAPDH(工作濃度1∶3 000)作為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 IHC檢測(cè)SIRT3在ESCC組織中的表達(dá)IHC染色結(jié)果顯示:SIRT3主要表達(dá)于ESCC組織的基底層，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多見(jiàn)。半定量分析結(jié)果顯示:ESCC組織中SIRT3蛋白表達(dá)量較正常食管組織升高(0.51±0.06vs0.26±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02，見(jiàn)圖1)。

2.2 Western blotting檢測(cè)SIRT3在ESCC組織中的表達(dá)Western blotting檢測(cè)SIRT3在3對(duì)ESCC組織及正常食管組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示:SIRT3蛋白在ESCC組織中的表達(dá)量(2.43±0.30)較正常食管組織(1.06±0.05)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01，見(jiàn)圖2)。

圖1 IHC檢測(cè)SIRT3在ESCC組織及正常食管組織中的表達(dá)(200×) A：ESCC組織；B：正常食管組織

注：1～3：正常食管組織; 4～6：ESCC組織。

2.3 Western blotting檢測(cè)常氧及缺氧條件下SIRT3、HIF-1α在Eca109中的表達(dá)常氧環(huán)境下Eca109細(xì)胞中SIRT3的相對(duì)表達(dá)量為1.08±0.06，而缺氧6 h、12 h、24 h后Eca109細(xì)胞中SIRT3的相對(duì)表達(dá)量分別為0.86±0.02、0.71±0.03、0.51±0.03，四組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。常氧環(huán)境下Eca109細(xì)胞中HIF-1α的相對(duì)表達(dá)量為1.07±0.03，而缺氧6 h、12 h、24 h的Eca109細(xì)胞中HIF-1α的相對(duì)表達(dá)量分別為1.14±0.05、1.27±0.06、1.51±0.03，四組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001，見(jiàn)圖3)。

注：1：常氧；2：缺氧6 h；3：缺氧12 h；4：缺氧24 h。

3 討論

腫瘤細(xì)胞能量代謝一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，其中“Warburg效應(yīng)”的提出是一個(gè)里程碑，它的主要觀(guān)點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的條件下依然優(yōu)先選擇糖酵解進(jìn)行能量代謝，而不是采用產(chǎn)生ATP效率高的線(xiàn)粒體有氧氧化[3]。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α是該效應(yīng)中較重要的因子之一，在缺氧條件下其與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白結(jié)合，進(jìn)一步轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，與缺氧反應(yīng)元件相結(jié)合，傳遞腫瘤相關(guān)代謝信號(hào)，被認(rèn)為是一個(gè)促癌基因[3-4]。SIRT家族是NAD依賴(lài)性蛋白，SIRT1、6、7分布于細(xì)胞核，SIRT2分布于細(xì)胞質(zhì)，而SIRT3～5分布于線(xiàn)粒體。其中SIRT3作為線(xiàn)粒體的脫乙酰酶可作用于脂肪氧化、氨基酸代謝、電子傳遞鏈等[5]。鑒于腫瘤目前越來(lái)越多地被定義為代謝疾病，而線(xiàn)粒體又處于代謝的中心地位，SIRT3作為線(xiàn)粒體內(nèi)主要的去乙?；福瑒t必然與腫瘤代謝有一定的聯(lián)系[6]。

有研究認(rèn)為SIRT3在乳腺癌細(xì)胞[7]、口腔鱗癌細(xì)胞[8]中高表達(dá)，且SIRT3高表達(dá)致腫瘤細(xì)胞增殖速度加快，凋亡受限，細(xì)胞中活性氧(ROS)生成增多，細(xì)胞呈高糖酵解低有氧氧化狀態(tài)。也有研究認(rèn)為SIRT3是一抑癌基因，因發(fā)現(xiàn)SIRT3-/-MEF細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多，而SIRT3過(guò)表達(dá)可以抑制ROS生成，這一過(guò)程可能是通過(guò)調(diào)節(jié)氧化磷酸化蛋白而發(fā)揮作用的[5]。Finley等[9]認(rèn)為SIRT3缺失可以通過(guò)抑制脯氨酰羥基化酶來(lái)抑制HIF-1α降解，而這種作用是依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)增多的ROS來(lái)產(chǎn)生的，HIF-1α可以增強(qiáng)糖酵解，因此SIRT3缺失的腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)HIF-1α表達(dá)的增加來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解水平。

國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)HIF-1α和ESCC糖酵解的關(guān)系進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)缺氧條件下ESCC細(xì)胞糖酵解能力增強(qiáng)，這與HIF-1α及糖酵解酶類(lèi)表達(dá)增加與活化有關(guān)[10]，而ESCC細(xì)胞線(xiàn)粒體有氧氧化方面的作用尚未見(jiàn)有相關(guān)研究，故本課題組對(duì)SIRT3在ESCC中的作用及HIF-1α、SIRT3在ESCC細(xì)胞之間的關(guān)系進(jìn)行初步研究，力圖進(jìn)一步探討“Warburg效應(yīng)”在ESCC細(xì)胞中的作用。

本研究利用IHC及Western blotting驗(yàn)證了SIRT3在ESCC組織中的表達(dá)高于正常食管組織，初步認(rèn)為SIRT3在ESCC的發(fā)生、發(fā)展中起促癌基因的作用。有研究認(rèn)為SIRT3增高的ESCC患者的預(yù)后不良，這與我們的研究結(jié)果相符[11]。此外，我們進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了常氧條件下SIRT3在ESCC細(xì)胞Eca109中的表達(dá)量較缺氧條件下的表達(dá)量高，表明缺氧環(huán)境可能會(huì)引起ESCC細(xì)胞SIRT3蛋白的表達(dá)缺失，而此時(shí)Eca109細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)水平反而升高，與SIRT3的表達(dá)趨勢(shì)相反，由此我們初步認(rèn)為SIRT3降低的Eca109細(xì)胞可能通過(guò)HIF-1α表達(dá)的增加來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞糖酵解水平，這也與Finley等[9]的研究結(jié)果相符，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

總之，該研究初步提示SIRT3在ESCC組織中的表達(dá)量較高，其與HIF-1α在ESCC細(xì)胞糖酵解的過(guò)程中有重要作用，對(duì)其表達(dá)的檢測(cè)可能會(huì)成為ESCC的早期診斷手段之一。

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(責(zé)任編輯：陳香宇)

Expression and mechanism of SIRT3 in esophageal squamous cell carcinoma

LIU Qiong, HE Bin, REN Lihua, QIU Hongqing

Department of Gastroenterology, Zhangjiagang First People’s Hospital, Affiliated Hospital of Soochow University, Zhangjiagang 215600, China

Objective To investigate the expression and the mechanism of SIRT3 in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC), and provide the early diagnosis and therapy of ESCC. Methods Twenty ESCC tissues and normal esophageal tissues were collected, the expression of SIRT3 was detected by immunohistochemistry (IHC)and Western blotting assay. The expressions of SIRT3 and HIF-1α in ESCC cell line Eca109 were detected by Western blotting under normoxia condition and hypoxia condition (6 hours, 12 hours, 24 hours). Results The expression of SIRT3 protein in ESCC was higher than that of normal esophageal tissues (0.51±0.06vs0.26±0.04,P<0.05). The expression of SIRT3 in Eca109 cells was reduced in hypoxia condition while the expression of HIF-1α was increased. Conclusion High expression of SIRT3 may affect the occurrence and development of ESCC, HIF-1α has a promoting effect on the occurrence and development of ESCC, and detection of expression may be useful for early diagnosis of ESCC.

SIRT3; Esophageal squamous cell carcinoma; Energy metabolism

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.018

劉瓊，主治醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病。E-mail：37891106@qq.com

邱洪清，副主任醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病。E-mail：13338031123@189.cn

R735.1

A

1006-5709(2016)01-0067-03

2015-02-04