CRs、MMPs、VEGF在胰腺癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其意義

馮蘭云 陳聯(lián)譽(yù) 曲超 王鵬 陳顥 林鈞華 陳震 孟志強(qiáng) 劉魯明

作者單位：200232 上海 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科；復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系

基礎(chǔ)研究

CRs、MMPs、VEGF在胰腺癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其意義

馮蘭云 陳聯(lián)譽(yù) 曲超 王鵬 陳顥 林鈞華 陳震 孟志強(qiáng) 劉魯明

作者單位：200232 上海 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科；復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系

目的 探討趨化因子受體（chemokine receptors，CRs）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)與胰腺癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）生物學(xué)行為的關(guān)系。方法 用原代培養(yǎng)的方法建立胰腺癌CAFs和正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs）。用Real-time PCR方法檢測CRs（CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7）、MMPs（MMP1、MMP2、MMP7、MMP9）和VEGFmRNA的表達(dá)。結(jié)果 成功建立胰腺癌CAFs和正常胰腺NFs。在CAFs和NFs中，趨化因子受體CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7 mRNA的表達(dá)均存在差異，CAFs表達(dá)量高于NFs。其中CXCR2、CXCR4 mRNA在兩株細(xì)胞中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010，P=0.049）。MMPs和VEGF mRNA的表達(dá)同樣存在差異，CAFs中MMP7和VEGF mRNA表達(dá)明顯高于NFs，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017，P=0.049）；CAFs中MMP9 mRNA的表達(dá)明顯低于NFs，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）。結(jié)論 在胰腺癌CAFs中CRs、MMPs和VEGFmRNA的表達(dá)有差異，可能與其促侵襲轉(zhuǎn)移能力存在一定的相關(guān)性。

胰腺腫瘤；腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞；正常成纖維細(xì)胞；趨化因子受體；基質(zhì)金屬蛋白酶；血管內(nèi)皮生長因子

胰腺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，早期無明顯癥狀，確診時僅20%的患者有手術(shù)治療機(jī)會，加之胰腺癌惡性程度高，對放化療不敏感，治療效果較差，嚴(yán)重威脅人類生命健康［1，2］。因此，探究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，特別是腫瘤微環(huán)境與胰腺癌的關(guān)系意義深遠(yuǎn)。目前在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌中已有研究顯示腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）具有促侵襲轉(zhuǎn)移作用，并與多種惡性腫瘤預(yù)后相關(guān)。但在胰腺癌中的研究尚在起步階段。我們前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCLs在胰腺癌相關(guān)的正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs）和胰腺癌CAFs中的表達(dá)存在明顯差異，且可提高胰腺癌Capan1細(xì)胞遷移及侵襲能力［3，4］。由此根據(jù)趨化因子-趨化因子受體生物學(xué)軸的相互作用設(shè)想匹配的CRs在胰腺癌CAFs和胰腺NFs中可能也存在差異性表達(dá)。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 胰腺癌CAFs和胰腺NFs由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院用膠原酶消化法和組織塊培養(yǎng)法從胰腺組織和癌旁正常組織中分離得到，具體方法如Walter等［5］所述。細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（FBS）DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1個月后首次傳代，之后常規(guī)換液、傳代，取10代以內(nèi)對數(shù)生長期的原代成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用免疫熒光法對原代細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑 RPMI 1640（500 mL）、DMEM培養(yǎng)基（500 mL）、FBS（100 mL）、磷酸鹽緩沖液（PBS，1000mL）、0.25%胰蛋白酶（100mL）、丙酮酸鈉（100mL）、HEPES（100mL）均購自美國Gibco公司；1%青鏈霉素雙抗（100mL）購自美國Hyclone公司。

1.1.3 免疫組化相關(guān)試劑 抗廣譜細(xì)胞角蛋白（pan cytokeratin，CK）抗體（1 mg）購自廣州Ascend Biotechnology公司；抗E-cadherin（500μL）、抗Vimentin（100 μg）、抗α-SMA（100μL）購自美國Epitomics公司；蘇木素（100mL）、伊紅（100mL）、PBS（500mL）購自福建邁新公司生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.4 RT-PCR相關(guān)試劑 Trizol（100mL）、遞轉(zhuǎn)錄試劑盒（50次量）購自Takara公司；SYBR Green PCR Master Mix（1 mL）購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 CAFs和NFs培養(yǎng) 按照美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）推薦的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，按1∶3比例傳代。

1.2.2 CAFs和NFs免疫熒光鑒定 細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定10min（如固定細(xì)胞器選擇預(yù)冷的70%甲醛+30%丙酮）。PBS漂洗5min，0.3%Triton穿孔15min，PBS漂洗3次，每次5 min，1%BSA封閉30 min，加入1%BSA稀釋的一抗，于4°C過夜。PBS漂洗3次，每次5 min，加入1%BSA稀釋的二抗，于37℃雜交1.5 h（Dylight1∶50）。PBS漂洗3次，每次5min，5μg/mL DAPI染色2min?？勾銣绶馄瑒┓馄?。

1.2.3 組織細(xì)胞總RNA提取、cDNA合成和Realtime PCR 兩種細(xì)胞株均用Trizol法提取總RNA，分光光度計(jì)檢測抽提質(zhì)量和濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用Real-time PCR方法檢測mRNA表達(dá)。從GenBank中檢索出CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7的基因序列號和相應(yīng)序列。采用Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并通過BLAST排除產(chǎn)物同源序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。實(shí)時RT-PCR結(jié)果以閾循環(huán)（cycle threshold，Ct）值表示。每個樣本重復(fù)3個復(fù)孔，取3個復(fù)孔的平均Ct值作為終值，用2－△△Ct計(jì)算mRNA相對表達(dá)量，△Ct＝Ct目標(biāo)基因-CtGAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析。方差齊時，采用LSD法；方差不齊時，采用Games-Howen法。等級資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立胰腺NFs和胰腺癌CAFs細(xì)胞

經(jīng)過原代培養(yǎng)建立兩株相應(yīng)的胰腺NFs和胰腺癌CAFs，并選取人CK、E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin及CAFs特異性標(biāo)記物α-SMA，通過熒光免疫（ICC）法對其進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)上兩種成纖維細(xì)胞都呈長梭形，細(xì)胞核不規(guī)則。與CAFs相比，NFs外觀較短小。見圖1。

表1 引物序列

圖1 胰腺NFs及胰腺癌CAFs（×40）

ICC標(biāo)記結(jié)果顯示，胰腺NFs和胰腺癌CAFs都不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK及E-cadherin，但都表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin，CAFs還高表達(dá)其特異指標(biāo)α-SMA（見圖2）。提示成功建立人胰腺NFs及胰腺癌CAFs。

2.2 在胰腺NFs和胰腺癌CAFs中CRsm RNA的表達(dá)在NFs和CAFs中，趨化因子受體CXCR1、CXCR2、 CXCR4、CXCR7 mRNA的表達(dá)均存在差異，表現(xiàn)為CAFs表達(dá)量高于NFs。其中CXCR2、CXCR4 mRNA在兩株細(xì)胞中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010，P=0.049）。而CXCR1、CXCR7 mRNA在兩株細(xì)胞中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖2 胰腺NFs及胰腺癌CAFs ICC鑒定結(jié)果（×100）

圖3 胰腺NFs及胰腺癌CAFs中CRs m RNA的表達(dá)

2.3 MMPs和VEGFmRNA在胰腺NFs和胰腺癌CAFs中的表達(dá)

在NFs和CAFs中，MMPs和VEGFmRNA的表達(dá)均存在差異。CAFs中MMP7和VEGFmRNA的表達(dá)明顯高于NFs，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017，P=0.049）；CAFs中MMP9 mRNA的表達(dá)明顯低于NFs，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）；而MMP1、MMP2 mRNA雖有表達(dá)差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 MMPs和VEGF mRNA在胰腺NFs及胰腺癌CAFs中的表達(dá)

3 討論

腫瘤微環(huán)境概念（血管生成理論）于1971年由Folkman提出。研究者在進(jìn)一步深入探索中發(fā)現(xiàn)腫瘤間質(zhì)（血管、免疫細(xì)胞、趨化因子、細(xì)胞外基質(zhì)等）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色［5～8］。而針對胰腺癌腫瘤微環(huán)境制定新治療方案，取得了一定成效，提示腫瘤微環(huán)境在胰腺癌形成過程中發(fā)揮了重要作用［9，10］。

CAFs是一類特殊的與腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞，是腫瘤微環(huán)境重要成員之一。它的來源具有爭議性，主要包括三大類：局部的成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)來源的前體細(xì)胞和轉(zhuǎn)分化的表皮（內(nèi)皮）細(xì)胞，此外還有一種來源為腫瘤細(xì)胞［11～13］。CAFs的作用主要是分泌生長因子、細(xì)胞因子和蛋白酶、調(diào)節(jié)腫瘤代謝，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)重建、為轉(zhuǎn)移微環(huán)境做準(zhǔn)備、與腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)等有關(guān)。它是多種惡性腫瘤（如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌）間質(zhì)中最引人關(guān)注的細(xì)胞類型［14，15］。而CAFs的表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的預(yù)后相關(guān)［16～19］。

大量證據(jù)表明胰腺癌細(xì)胞與其周圍的CAFs存在密切的相互作用［20，21］。而趨化因子及受體、MMPs作為腫瘤微環(huán)境的重要一員，與兩者亦密切聯(lián)系［22，23］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL1、CXCL2、CXCL8在胰腺癌相關(guān)的NFs和CAFs中的表達(dá)存在明顯差異，CAFs明顯高于NFs，且這些趨化因子可以提高胰腺癌Capan1細(xì)胞遷移及侵襲能力［3，4］。由此，根據(jù)趨化因子-趨化因子受體生物學(xué)軸相互作用原理，設(shè)想和這些趨化因子相對應(yīng)的受體在NFs和CAFs中可能也存在差異性表達(dá)，從而造成NFs和CAFs在生物學(xué)上促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲能力的差別。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移相關(guān)的趨化因子受體CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7mRNA在胰腺癌CAFs中的表達(dá)量均高于胰腺NFs，其中CXCR2、CXCR4在兩株細(xì)胞中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大量研究提示CXCR2、CXCR4在促進(jìn)惡性腫瘤增殖、侵襲及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移中發(fā)揮舉足輕重的作用。我們前期及本研究中，CAFs培養(yǎng)液CXCL1、CXCL2、CXCL8的表達(dá)量明顯高于NFs，由此推斷，CAFs在生物學(xué)行為上表現(xiàn)出的促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力可能與CRs表達(dá)增加、促進(jìn)后續(xù)的受體-配體生物學(xué)軸作用相關(guān)。

同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，MMPs和VEGF mRNA在胰腺NFs和胰腺癌CAFs中的表達(dá)同樣存在差異。MMPs在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視，被認(rèn)為是浸潤轉(zhuǎn)移過程中最主要的蛋白水解酶。而MMP1、MMP2、MMP7、MMP9則是腫瘤血管生成的主要角色，MMPs通過降解或清除細(xì)胞外Ⅳ、Ⅷ、X型膠原、串珠素等上調(diào)VEGF、bFGF等重要因子的生物活性或增加腫瘤抑素、內(nèi)皮抑素、血管抑素等表達(dá)，以保持血管生成的平衡。本研究胰腺癌CAFs中MMP7 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)明顯高于胰腺NFs（P＜0.05），MMP9 mRNA的表達(dá)明顯低于胰腺NFs（P＜0.05），MMP1、MMP2 mRNA雖有表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示胰腺NFs、胰腺癌CAFs中MMPs和VEGFmRNA的表達(dá)無明顯規(guī)律性，與胰腺癌CAF s促遷移侵襲能力的相關(guān)性尚不明確，還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，CAFs是抗胰腺癌治療中的一個重要靶點(diǎn)，可能通過調(diào)節(jié)趨化因子及其受體、MMPs和VEGF等重要的內(nèi)環(huán)境因子而對胰腺癌的整個微環(huán)境產(chǎn)生影響。針對該靶點(diǎn)的藥物可能會為胰腺癌的治療開辟新的途徑。

［1］ Xu Q，Z hang T P，Z hao Y P.A d v an c e s in ea rl y d iagno s i s an d t he r apy o f pan cr ea t i c c an c e r［J］.H epa t o b i l ia r y P an cr ea t Di s I n t，2011，10（2）：128-135.

［2］ S ai f M W.C on tr o v e r s ie s in t he a d ju v an t tr ea t men t o f pan cr ea t i c a d eno c a rc inoma［J］.J O P，2007，8（5）：545-552.

［3］ C hen L，Q u C，C hen H，e t a l.C hine s e he rb a l me d i c ine s upp r e ss e s in v a s ion-p r omo t ing c apa c i t y o f c an c e r-a ss o c ia t e d f i br o bl a s t s in pancr ea t i c c an c e r［J］.PL o SO ne，2014，9（4）：e96177.

［4］ C hen L，F(xiàn) an J，C hen H，e t a l.T he I L-8/CXC R1 a x i s i s a ss o c ia t e d w i t h c an c e r s t em c e ll-l i k e p r ope rt ie s an d c o rr e l a t e s w i t h cl ini c a l p r ogno s i s inhuman pan cr ea t i c c an c e rc a s e s［J］.S c i R ep，2014，4：5911.

［5］ W a lt e r K，O mu r a N，H ong S M，e t a l.P an cr ea t i c c an c e r a ss o c ia t e d f ibr o bl a s t s d i s p l ay no r ma l a ll e l o t ype s［J］.C an c e r B io l T he r，2008，7（6）：882-888.

［6］ 莫娟梅，周韶璋，林小梅，等.非小細(xì)胞肺癌患者血清中T GF-β1與VEGF的表達(dá)及臨床意義［J］.中國癌癥防止雜志，2012，4（1）：49-52.

［7］ 羅慶偉，田小林.血管內(nèi)皮生長因子與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展［J］.中國癌癥防治雜志，2010，2（2）：158-161.

［8］ K op f s t ein L，C h r i s t o f o r i G.M e t a s t a s i s：c e ll-au t onomou s me c ha-ni s m s v e r s u s c on tr i b u t ion s b y t he t umo r mi cr oen v i r onmen t［J］.C e ll M o l L i f e S c i，2006，63（4）：449-468.

［9］ N ee ss e A，M i c h l P，F(xiàn) r e s e KK，e t a l.S tr oma l b io l ogy an d t he r apy in pan cr ea t i c c an c e r［J］.G u t，2011，60（6）：861-868.

［10］C hu GC，K imme l man AC，H e z e l AF，e t a l.S tr oma l b io l ogy o f pan cr ea t i c c an c e r［J］.J C e ll B io c hem，2007，101（4）：887-907.

［11］ A n d e rb e r g C，P ie tr a s K.O n t he o r igin o f c an c e r-a ss o c ia t e d f i-br o bl a s t s［J］.C e ll C y cl e，2009，8（10）：1461-1462.

［12］H in z B，P han S H，T hanni ck a l V J，e t a l.T hemyo f i br o bl a s t：one f un ct ion，mu lt ip l e o r igin s［J］.A m J P a t ho l，2007，170（6）：1807-1816.

［13］O s t man A，A ug s t en M.C an c e r-a ss o c ia t e d f i br o bl a s t s an d t umo r g r o wt hb y s t an d e r s t u r ning in t o k ey p l aye r s［J］.C u rr O pin G ene t De v，2009，19（1）：67-73.

［14］P ie tr a s K，O s t man A.H a ll ma rk s o f c an c e r：in t e r a ct ion s w i t h t he t umo r s tr oma［J］.E x p C e ll R e s，2010，316（8）：1324-1331.

［15］K a ll u r i R，Z ei s b e r g M.F i br o bl a s t s in c an c e r［J］.N a t R e v C an c e r，2006，6（6）：392-401.

［16］ Q ian B Z，P o ll a rd J W.M a cr ophage d i v e r s i t y enhan c e s t umo r p r og r e ss ion an d me t a s t a s i s［J］.C e ll，2010，141（1）：39-51.

［17］ Joy c e J A，P o ll a rd J W.M i cr oen v i r onmen t a l r egu l a t ion o f me t a s t a-s i s［J］.N a t R e v C an c e r，2009，9（4）：239-252.

［18］G ou t S，H uo t J.R o l e o f c an c e r mi cr oen v i r onmen t in me t a s t a s i s：f o c u s on c o l on c an c e r［J］.C an c e r M i cr oen v i r on，2008，1（1）：69-83.

［19］ S ugimo t o H，M un d e l T M，K ie r an M W，e t a l.Id en t i f i c a t ion o f f i br o bl a s t he t e r ogenei t y in t he t umo r mi cr oen v i r onmen t［J］.C an c e r B io l T he r，2006，5（12）：1640-1646.

［20］H w ang RF，M oo r e TT，H a tt e r s l ey MM，e t a l.I nhi b i t ion o f t he he d gehog pa t h w ay t a r ge t s t he t umo r-a ss o c ia t e d s tr oma in pan cr ea t i c c an c e r［J］. M o l C an c e r R e s，2012，10（9）：1147-1157.

［21］B r en t na ll T A.A r ou s a l o fc an c e r-a ss o c ia t e d s tr oma l f i br o bl a s t s：pa ll a d ina ct i v a t e d f i br o bl a s t s p r omo t e t umo r in v a s ion［J］.C e ll A d h M ig r，2012，6（6）：488-494.

［22］T ou ll e c A，G e r a ld D，De s pouy G，e t a l.O x i d a t i v e s tr e ss p r omo t e s myo f i br o bl a s t d i ff e r en t ia t ion an d t umou r s p r ea d ing［J］.E m b o M o l M e d，2010，2（6）：211-230.

［23］L i X，W u J F.R e c en t d e v e l opmen t s in pa t en t an t i-c an c e r agen t s t a rge t ing t he ma tr i x me t a ll op r o t eina s e s（MMPs）［J］.R e c en t P a t A n t ic an c e r D r ug Di s c o v，2010，5（2）：109-141.

［2015-08-15 收稿］［2016-01-10修回］［編輯 江德吉］

Expression of chemokine receptors，MMPs，and VEGF in pancreatic cancer fibroblast cell lines

Feng Lanyun，Chen Lianyu，Qu Chao，Wang Peng，Chen Hao，Lin Junhua，Chen Zhen，Meng Zhiqiang，Liu Luming（Department of Integrative Oncology，F(xiàn)udan University Shanghai Cancer Center；Department of Oncology，ShanghaiMedical College，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，P.R.China）

Liu Luming.E-mail:llm1010@163.com

Objective To establish cancer associated fibroblast（CAF）lines and normal fibroblast（NF）lines and use them to investigate expression of chemokine receptors，MMPs and VEGF and thereby understand the biological behavior of CAFs in pancreatic cancer.M ethods Primary cultures of CAFs and NFs were established，and mRNA levels of chemokine receptors，MMPs and VEGF were measured using RT-PCR.Results Expression ofmRNAs encoding the chemokine receptors CXCR1，CXCR2，CXCR4，and CXCR7 was higher in CAFs than in NFs.This differencewas statistically significant in the case of CXCR2（P=0.010）and CXCR4（P=0.049）.Similarly，MMP7 mRNA was expressed at significantly higher levels in CAFs（P=0.017），as was VEGF（P=0.049）. Conversely，MMP9 mRNA levels were significantly higher in NFs（P=0.012）.Conclusion Differential expression of chemokine receptors，MMPs and VEGF in CAFs may help explain their aggressive behavior in pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms；Cancer associated fibroblast；Normal fibroblast；Chemokine receptors；Matrix metalloproteinases；Vascular endothelial growth factor

R735.9

A

1674-5671（2016）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.04.03

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（81102004）；上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥基金資助項(xiàng)目（2010QJ032A）

劉魯明。E-mail：llm1010@163.com