正交設(shè)計(jì)法分析儲(chǔ)存條件對(duì)艾葉揮發(fā)油成分的影響

苗麗坤 熊國璽 喻世濤 程書鋒 肖龍恩

摘要：【目的】利用正交設(shè)計(jì)法探討不同儲(chǔ)存條件對(duì)艾葉揮發(fā)油成分的影響，為其儲(chǔ)存及開發(fā)利用提供技術(shù)參考?！痉椒ā恳园~為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別以儲(chǔ)存溫度、儲(chǔ)存濕度及儲(chǔ)存時(shí)間為影響因素，以艾葉揮發(fā)油提取率及香氣質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定艾葉的最佳儲(chǔ)存條件?！窘Y(jié)果】影響艾葉儲(chǔ)存效果的因素主次排序?yàn)椋簝?chǔ)存溫度>儲(chǔ)存濕度>儲(chǔ)存時(shí)間，艾葉最佳儲(chǔ)存條件為：儲(chǔ)存溫度40 ℃、儲(chǔ)存濕度40%、儲(chǔ)存時(shí)間8個(gè)月，揮發(fā)油平均提取率為0.645%；在此儲(chǔ)存條件下得到的艾葉揮發(fā)油香氣特征明顯、豐富，經(jīng)GC-MS分析，其主要成分有桉葉油醇（31.54%）、右旋龍腦（8.94%）、左旋樟腦（6.12%）和石竹烯（6.09%）等?！窘Y(jié)論】采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化得到的艾葉儲(chǔ)存條件能有效保持其揮發(fā)油成分含量和香氣質(zhì)量，可在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 艾葉；揮發(fā)油；儲(chǔ)存條件；提取率；香氣質(zhì)量；GC-MS分析

中圖分類號(hào)： R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）01-0112-05

0 引言

【研究意義】艾葉又稱艾蒿，為菊科植物艾（Artemisia argyi Levl. et Vant.）的干燥葉。艾葉是一種傳統(tǒng)中藥，能夠散寒除濕、溫經(jīng)止血（張學(xué)蘭和吳美娟，1992；楊長江等，2004），同時(shí)還有止咳平喘（黃學(xué)紅等，2006）、抗菌消炎（韓軼等，2005；張鵬等，2015）等功效。艾葉具有清香味，含有大量揮發(fā)油，由于受不同生長環(huán)境及儲(chǔ)藏條件等因素影響，其有效成分含量及功效均存在一定差異（梁歡等，2014）。因此，有必要對(duì)其儲(chǔ)存條件進(jìn)行研究。【前人研究進(jìn)展】目前已有不少學(xué)者對(duì)天然植物的儲(chǔ)存條件進(jìn)行相關(guān)研究。陳偉光和盛靜（2006）研究不同存儲(chǔ)時(shí)間和存儲(chǔ)方法對(duì)杭白菊總黃酮含量的影響，結(jié)果表明，杭白菊中總黃酮含量隨存儲(chǔ)時(shí)間的延長逐漸降低，密閉（真空）包裝或冷藏可有效延緩總黃酮含量下降。喻良文等（2008）分析貯藏時(shí)間對(duì)廣藿香揮發(fā)油含量的影響，結(jié)果表明，廣藿香藥材揮發(fā)油含量隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸減少，揮發(fā)油在0～10 ℃下放置時(shí)各組分百分含量變化小；藥材貯藏時(shí)間不宜超過2年，所提取的揮發(fā)油能保存2年以上。李哲和贠建民（2009）研究不同儲(chǔ)藏條件對(duì)顆粒酒花苦味物質(zhì)的影響，結(jié)果表明，在5 ℃、避光、抽真空條件下儲(chǔ)藏3個(gè)月后，酒花的α-酸、β-酸含量最多，比在25 ℃、避光、密封條件下儲(chǔ)藏3個(gè)月的酒花α-酸、β-酸含量分別高0.78%和0.43%。施婷婷等（2014）研究保存方法對(duì)桂花精油提取及香氣成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷凍保存的桂花能保留鮮花的原有香氣成分，精油提取率基本不變；而自然干燥處理的桂花精油香氣成分及提取率有很大程度下降?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，艾葉在醫(yī)學(xué)、香料和食品等領(lǐng)域已成為研究熱點(diǎn)，但關(guān)于儲(chǔ)存條件對(duì)其有效成分影響的系統(tǒng)研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)不同儲(chǔ)存條件下的艾葉進(jìn)行揮發(fā)油提取，結(jié)合香氣質(zhì)量及成分對(duì)比分析，確定最佳儲(chǔ)存條件，為艾葉的儲(chǔ)存及開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

艾葉購自武漢龍?zhí)┧帢I(yè)有限公司。無水乙醇、無水硫酸鈉均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器設(shè)備有：LX-80恒溫恒濕箱（深圳市聯(lián)欣檢測(cè)設(shè)備有限公司）、FA3204B型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、揮發(fā)油提取器（天津市天玻玻璃儀器有限公司）、Thermo TRACE GC Ultra-DSQⅡ氣相色譜—質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀（美國Thermo-Fisher公司）。

1. 2 揮發(fā)油提取

準(zhǔn)確稱取0.2 kg艾葉置于圓底燒瓶中，加入2.0 kg水浸泡10 h，回流提取5 h可得到艾葉揮發(fā)油；向揮發(fā)油中加入無水硫酸鈉，靜置過夜備用。根據(jù)每克原料所提取得到的揮發(fā)油質(zhì)量（g）計(jì)算提取率（%）。

1. 3 單因素試驗(yàn)

1. 3. 1 儲(chǔ)存溫度對(duì)艾葉揮發(fā)油的影響 將艾葉儲(chǔ)存溫度分別設(shè)為10、20、30、40、50和60 ℃，保持儲(chǔ)存濕度50%，72 h后提取揮發(fā)油，計(jì)算提取率。

1. 3. 2 儲(chǔ)存濕度對(duì)艾葉揮發(fā)油的影響 將艾葉儲(chǔ)存濕度分別設(shè)為30%、40%、50%、60%、70%和80%，保持儲(chǔ)存溫度30 ℃，72 h后提取揮發(fā)油，計(jì)算提取率。

1. 3. 3 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)艾葉揮發(fā)油的影響 設(shè)定艾葉儲(chǔ)存溫度30 ℃、濕度50%，分別儲(chǔ)存2、4、6、8、10和12個(gè)月后提取揮發(fā)油，計(jì)算提取率。

1. 4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇儲(chǔ)存溫度（A）、儲(chǔ)存濕度（B）和儲(chǔ)存時(shí)間（C）為考察因素，以揮發(fā)油提取率和香氣質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用正交設(shè)計(jì)法對(duì)艾葉儲(chǔ)存條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

1. 5 揮發(fā)油成分分析

1. 5. 1 樣品處理 用無水乙醇對(duì)所得揮發(fā)油進(jìn)行稀釋，并加入無水硫酸鈉，靜置過夜待分析。

1. 5. 2 GC-MS分析條件 色譜柱HP-5MS（30 cm×0.25 mm×0.25 μm）；初始柱溫50 ℃，保持4 min，以10 ℃/min速率升至250 ℃，保持10 min；傳輸線溫度250 ℃；恒流模式，載氣為氦氣；流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，分流進(jìn)樣，分流比10∶1；EI離子源，電離電壓70 ev，掃描范圍50～450 amu。

1. 5. 3 定性方法 通過WILEY和MAINLIB譜庫自動(dòng)檢索，結(jié)合保留指數(shù)（可接受誤差≤1%）共同確定，相對(duì)百分含量采用峰面積歸一化法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 儲(chǔ)存溫度對(duì)艾葉揮發(fā)油的影響 由圖1可知，隨著原料儲(chǔ)存溫度的升高，艾葉揮發(fā)油提取率呈逐漸增加趨勢(shì)；當(dāng)儲(chǔ)存溫度為60 ℃時(shí)，提取率可達(dá)0.790%，但此時(shí)揮發(fā)油香氣略顯不足。這是由于儲(chǔ)存溫度過高時(shí)，艾葉在儲(chǔ)存過程中其揮發(fā)性成分逐漸散失?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中的成本問題，儲(chǔ)存溫度應(yīng)盡量接近室溫，故選擇20、30和40 ℃ 3個(gè)溫度水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2. 1. 2 儲(chǔ)存濕度對(duì)艾葉揮發(fā)油的影響 由圖2可知，隨著原料儲(chǔ)存濕度的增加，艾葉揮發(fā)油提取率逐漸降低；當(dāng)濕度超過70%后，揮發(fā)油香氣質(zhì)量變差。這是由于儲(chǔ)存濕度過高時(shí)，艾葉原料易發(fā)霉變質(zhì)，影響香氣質(zhì)量。因此，選擇40%、50%和60% 3個(gè)濕度水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2. 1. 3 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)艾葉揮發(fā)油的影響 由圖3可知，隨著原料儲(chǔ)存時(shí)間的延長，艾葉揮發(fā)油提取率也呈逐漸降低的變化趨勢(shì)；儲(chǔ)存初期時(shí)（2～6個(gè)月），揮發(fā)油提取率下降較快，到儲(chǔ)存后期（8～12個(gè)月）提取率趨于平緩；且整個(gè)儲(chǔ)存過程揮發(fā)油的香氣質(zhì)量無明顯變化。因此，選擇艾葉儲(chǔ)存時(shí)間8、10和12個(gè)月3個(gè)水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2. 2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各因素對(duì)艾葉揮發(fā)油提取率的影響排序?yàn)椋篈>B>C，即儲(chǔ)存溫度對(duì)艾葉揮發(fā)油提取率的影響最大，其次是儲(chǔ)存濕度，儲(chǔ)存時(shí)間的影響相對(duì)較小。艾葉儲(chǔ)存條件最佳組合為A3B1C1，即儲(chǔ)存溫度40 ℃、儲(chǔ)存濕度40%、儲(chǔ)存時(shí)間8個(gè)月。

2. 3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證組合A3B1C1是否為艾葉原料最佳儲(chǔ)存條件，特進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。同時(shí)，考慮到儲(chǔ)存環(huán)境對(duì)艾葉揮發(fā)油香氣質(zhì)量的影響，選擇表2中香氣質(zhì)量較優(yōu)的試驗(yàn)組1（A1B1C1）、2（A1B2C2）、4（A2B1C2）與組合A3B1C1進(jìn)行GC-MS成分對(duì)比分析。結(jié)果表明，在組合A3B1C1儲(chǔ)存條件下，艾葉揮發(fā)油的平均提取率為0.645%，高于正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的任一組合。由圖4可知，4組艾葉揮發(fā)油成分的出峰時(shí)間主要集中在第11～13 min和第16～18 min。4組艾葉揮發(fā)油通過GS-MS分析，共檢出33種主要成分，包括萜烯類、醇類、脂肪烴類等；經(jīng)檢索分析，組合A3B1C1中含有的桉葉油醇、右旋龍腦、左旋樟腦、石竹烯等主要成分含量均與試驗(yàn)組1、2、4接近，其中以桉葉油醇的相對(duì)百分含量最高，為31.54%（表3）。

綜合考慮，組合A3B1C1的儲(chǔ)存條件可同時(shí)滿足艾葉揮發(fā)油提取率高及香氣質(zhì)量良好的要求。

3 討論

本研究以艾葉揮發(fā)油提取率及香氣質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)不同儲(chǔ)存條件下的艾葉原料進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明，儲(chǔ)存溫度升高能提高艾葉揮發(fā)油提取率，但當(dāng)儲(chǔ)存溫度高于50 ℃時(shí)揮發(fā)油香氣變?nèi)酰虼?，在?shí)際儲(chǔ)存過程中應(yīng)選擇較低溫度以保持艾葉揮發(fā)油的原香氣；儲(chǔ)存濕度過高時(shí)會(huì)降低揮發(fā)油提取率，并影響香氣質(zhì)量，在實(shí)際儲(chǔ)存過程中應(yīng)控制環(huán)境濕度小于60%；儲(chǔ)存時(shí)間延長使艾葉揮發(fā)油有效成分有所損失，同時(shí)提取率逐漸降低，在實(shí)際儲(chǔ)存過程中應(yīng)盡量縮短儲(chǔ)存時(shí)間。本研究采用正交設(shè)計(jì)法結(jié)合GC-MS成分分析，得到艾葉的最佳儲(chǔ)存條件為：儲(chǔ)存溫度40 ℃、儲(chǔ)存濕度40%、儲(chǔ)存時(shí)間8個(gè)月，較紅景天的儲(chǔ)存溫度高、儲(chǔ)存濕度小（苗麗坤等，2015），較廣藿香藥材的儲(chǔ)存時(shí)間短（喻良文等，2008），可見不同植物的儲(chǔ)存條件存在一定差異。

利用GC-MS對(duì)艾葉揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)艾葉的主要成分有桉葉油醇、樟腦、右旋龍腦和石竹烯等，與文福姬等（2007）的研究結(jié)果一致。艾葉具有較高的藥用價(jià)值，但目前僅有關(guān)于不同年份艾葉的化學(xué)成分（靳然等，2010）和艾葉燃燒生成自由基的ESR波譜（竇傳字等，2013）等方面的研究，尚無對(duì)艾葉儲(chǔ)存條件進(jìn)行系統(tǒng)研究的相關(guān)報(bào)道，故本研究對(duì)艾葉的儲(chǔ)存利用具有重要意義。然而，本研究僅對(duì)儲(chǔ)存溫度、濕度和時(shí)間因素進(jìn)行了初步探索，并通過對(duì)比分析各因素條件下艾葉揮發(fā)油成分含量的差異，下一步可針對(duì)艾葉的具體用途，對(duì)影響艾葉功效的其他因素（干燥方法、光照條件）進(jìn)行更深入的綜合研究，從而獲得艾葉原料的最佳儲(chǔ)存方法。

4 結(jié)論

采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化得到的艾葉儲(chǔ)存條件能有效保持其揮發(fā)油成分含量和香氣質(zhì)量，可在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）