催產(chǎn)激素對(duì)雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素水平變化的影響

魏繼海 趙金良 Thammaratsuntorn Jeerawat 羅明坤 趙永華

摘要：【目的】篩選對(duì)雌性尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）性腺發(fā)育影響最明顯的催產(chǎn)激素組合及最佳劑量，為開(kāi)展尼羅羅非魚(yú)人工催產(chǎn)與繁殖提供參考依據(jù)?！痉椒ā吭O(shè)計(jì)5組標(biāo)準(zhǔn)劑量的催產(chǎn)激素組合，分別為：①地歐酮（DOM） 6 mg/kg+促黃體素釋放激素A2（LRH-A2）10 μg/kg；②DOM 6 mg/kg+促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-A4）8 μg/kg；③DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+絨毛膜促性腺激素（HCG）2000 U/kg；④DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+ HCG 2000 U/kg+鯉魚(yú)腦垂體（PG）6 mg/kg；⑤DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg+PG 6 mg/kg+GnRH-A4 8 μg/kg，并選擇組合③進(jìn)行1.0、1.5和2.0倍的激素劑量篩選試驗(yàn)，然后檢測(cè)注射后0、24、36、48和72 h雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素[促性腺激素釋放激素（GnRH）、促性腺激素（GTH）、雌二醇（E2）和孕酮（P）]的含量變化?！窘Y(jié)果】雌性尼羅羅非魚(yú)血清GnRH、E2含量于注射后24 h達(dá)最大值，GTH、P含量則在注射后36 h達(dá)最大值；其中，組合③、④和⑤引起的類固醇激素含量升高變化最明顯，顯著高于組合①和②（P<0.05，下同），但組合③、④、⑤間差異不顯著（P>0.05，下同）。1.5倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組引起的血清類固醇激素含量變化最明顯，顯著高于1.0和2.0倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組，而1.0與2.0倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組間無(wú)顯著差異?！窘Y(jié)論】進(jìn)行尼羅羅非魚(yú)人工繁殖時(shí)，使用多種催產(chǎn)激素組合的效果優(yōu)于單一催產(chǎn)激素，且催產(chǎn)劑量一般應(yīng)高于常規(guī)魚(yú)類。

關(guān)鍵詞： 尼羅羅非魚(yú)；類固醇激素；催產(chǎn)激素；組合；劑量

中圖分類號(hào)： S965.125 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）01-0128-06

0 引言

【研究意義】羅非魚(yú)是世界性的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象之一，具有生長(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)、性成熟早（4～5個(gè)月即開(kāi)始性成熟）、產(chǎn)卵周期短（隔25～35 d繁殖一次）等優(yōu)點(diǎn)（藍(lán)厚珍和趙福江，1988）。在自然環(huán)境下羅非魚(yú)易繁殖，但人工繁殖卻非常困難，主要是因?yàn)榱_非魚(yú)個(gè)體間性腺發(fā)育非同步性，卵子成熟過(guò)程短（劉筠等，1983），難以獲得大量成熟卵子進(jìn)行受精。而在羅非魚(yú)的遺傳育種研究中，如雌核發(fā)育、多倍體、遠(yuǎn)緣雜交，通常需要大量的成熟卵子（Chourrout and Itskovich，1983；Mair et al.，1987；Don and Avtalion，1988），因此，成熟卵子的獲得已成為羅非魚(yú)遺傳育種工作的瓶頸問(wèn)題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于使用催產(chǎn)激素誘導(dǎo)羅非魚(yú)性腺發(fā)育的研究報(bào)道相對(duì)較少。李建林和劉麗平（2006）通過(guò)對(duì)奧利亞羅非魚(yú)（Oreochromis aureus）進(jìn)行人工繁育，發(fā)現(xiàn)以地歐酮（DOM）4 mg/kg+促黃體素釋放激素A2（LRH-A2）6 μg/kg對(duì)雌魚(yú)的催產(chǎn)效果最佳，催產(chǎn)率為62.5%。李瑞偉等（2011）對(duì)吉富羅非魚(yú)進(jìn)行人工催產(chǎn)試驗(yàn)，認(rèn)為絨毛膜促性腺激素（HCG）3000 U/kg+LRH-A2 15 μg/kg+DOM 9 mg/kg的催產(chǎn)效果最佳，催產(chǎn)率在66.0%左右。Fernandes等（2013）比較了幾種單一催產(chǎn)激素（PE、HCG和GnRH）促進(jìn)尼羅羅非魚(yú)（O. niloticus）卵母細(xì)胞成熟與排卵的效果，發(fā)現(xiàn)以HCG誘導(dǎo)效果最佳，建議使用劑量為1000～5000 U/kg。魏繼海等（2015）探討了不同劑量催產(chǎn)激素對(duì)尼羅羅非魚(yú)卵巢成熟過(guò)程中卵子形態(tài)、卵黃蛋白原含量及Vtg mRNA表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，以1.5倍劑量組對(duì)尼羅羅非魚(yú)卵巢成熟發(fā)育影響變化最明顯，激素注射后96 h，尼羅羅非魚(yú)卵子成熟度最佳，可用于進(jìn)一步的人工繁殖試驗(yàn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)注射或埋植外源激素，可在“腦—垂體—性腺”軸的某種或多種水平上外源性調(diào)節(jié)魚(yú)體的內(nèi)分泌活動(dòng)，刺激內(nèi)源激素的產(chǎn)生與分泌，誘導(dǎo)性腺成熟并排出精卵，但目前針對(duì)尼羅羅非魚(yú)人工催產(chǎn)排卵的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究人工合成激素對(duì)雌性尼羅羅非魚(yú)血清中各類固醇激素的影響變化，篩選出對(duì)雌性尼羅羅非魚(yú)性腺發(fā)育影響最明顯的催產(chǎn)激素組合及最佳劑量，為開(kāi)展尼羅羅非魚(yú)人工催產(chǎn)與繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用雌性尼羅羅非魚(yú)來(lái)自上海海洋大學(xué)羅非魚(yú)種質(zhì)資源試驗(yàn)站，體重450～650 g，均為1齡親魚(yú)。2014年7月28日通過(guò)擠卵觀察法挑選性腺發(fā)育較好的雌魚(yú)180余尾，然后轉(zhuǎn)入室內(nèi)水族箱（120 cm×60 cm×70 cm）中暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間水溫25～27 ℃，pH 6.94～ 7.32，24 h不間斷充氧。8月12～18日開(kāi)展不同催產(chǎn)激素組合注射試驗(yàn)；8月24～30日開(kāi)展不同劑量注射試驗(yàn)。促黃體素釋放激素A2（LRH-A2）、絨毛膜促性腺激素（HCG）、地歐酮（DOM）和鯉魚(yú)腦垂體（PG）購(gòu)自寧波第二激素廠，促性腺激素釋放激素類似物（GnRH-A4）購(gòu)自四川省精科生化制品有限責(zé)任公司。

1. 2 激素注射

催產(chǎn)激素組合共設(shè)5組：①DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg；②DOM 6 mg/kg+GnRH-A4 8 μg/kg；③DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg；④DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg+ PG 6 mg/kg；⑤DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg+PG 6 mg/kg+GnRH-A4 8 μg/kg。注射相同劑量生理鹽水作為空白對(duì)照組，每組注射5尾，3次重復(fù)。根據(jù)不同激素組合的試驗(yàn)結(jié)果，選用最佳的激素組合，其注射劑量分別為標(biāo)配劑量1.0、1.5和2.0倍，每組注射5尾，空白對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水。

1. 3 樣品采集

注射催產(chǎn)激素后，分別于0、24、36、48和72 h從羅非魚(yú)尾柄處抽取血液1～2 mL，4 ℃下靜置6～8 h。血液完全凝集后3500 r/min離心20 min，吸出上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 血清中類固醇激素含量測(cè)定

血清促性腺激素釋放激素（GnRH）、促性腺激素（GTH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）含量測(cè)定均使用上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供的ELISA試劑盒，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定（陳松林等，1995）。在BioTek Synergy酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值（OD），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中的類固醇激素含量。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以Excel 2013軟件進(jìn)行整理，使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，利用單因素方差分析法（ANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并采用Duncans法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同催產(chǎn)激素組合對(duì)雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素含量的影響

經(jīng)不同催產(chǎn)激素組合催產(chǎn)后，雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素水平變化情況詳見(jiàn)表1～4。注射后24 h，各激素注射組的雌性尼羅羅非魚(yú)血清GnRH、GTH、E2、P含量均呈顯著上升趨勢(shì)（P<0.05，下同），其中，GnRH、E2含量于注射后24 h達(dá)最大值（表1和表3），GTH、P含量則在注射后36 h達(dá)最大值（表2和表4）；注射后48 h，各激素注射組的雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素含量均顯著下降；至注射后72 h，各激素注射組與對(duì)照組的雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素水平基本一致?？梢?jiàn)，注射不同催產(chǎn)激素后，均能引起雌性尼羅羅非魚(yú)產(chǎn)生不同程度的催產(chǎn)效應(yīng)。

通過(guò)對(duì)比不同催產(chǎn)激素注射組，發(fā)現(xiàn)注射后24 h，組合③、④和⑤的雌性尼羅羅非魚(yú)血清GnRH、E2含量變化最明顯，顯著高于組合①和②（表1和表3）。除去5個(gè)激素組合中均含有DOM外，組合①中只含有LRH-A2、組合②只含有GnRH-A4，而組合③、④和⑤中含有兩種及兩種以上催產(chǎn)激素，因此推測(cè)，多種催產(chǎn)激素組合的催產(chǎn)效果比單一催產(chǎn)激素作用的效果更明顯。組合③、④、⑤間差異不顯著（P>0.05，下同），但以組合⑤的雌性尼羅羅非魚(yú)血清GnRH、E2含量最高，進(jìn)一步驗(yàn)證多種激素組合的催產(chǎn)效果更優(yōu)。注射后36 h，組合③、④和⑤的雌性尼羅羅非魚(yú)血清GTH、P含量顯著高于組合①和②，組合①與組合②間差異顯著，組合③、④、⑤間差異不顯著，但以組合⑤的血清GTH、P含量最高（表2和表4）。在血清GTH、P含量方面，多種催產(chǎn)激素組合（組合③、④和⑤）的催產(chǎn)效果也優(yōu)于單一激素的催產(chǎn)效果（組合①和②），其變化規(guī)律與血清GnRH、E2含量變化一致。

2. 2 不同催產(chǎn)激素劑量對(duì)雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素含量的影響

從經(jīng)濟(jì)實(shí)用角度考慮，本研究選擇組合③（DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+HCG 2000 U/kg）進(jìn)行催產(chǎn)激素劑量篩選試驗(yàn)。由圖1可以看出，注射不同劑量催產(chǎn)激素后，雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素含量的變化趨勢(shì)與不同催產(chǎn)激素組合注射后的變化趨勢(shì)一致，即血清GnRH、E2含量在注射后24 h達(dá)最大值，而血清GTH、P含量在注射后36 h達(dá)最大值。不同劑量催產(chǎn)激素注射組的雌性尼羅羅非魚(yú)血清GnRH、E2、GTH、P含量均顯著高于對(duì)照組；不同劑量催產(chǎn)激素注射組間比較，其結(jié)果顯示，1.5倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組的血清類固醇激素含量顯著高于1.0和2.0倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組，但1.0與2.0倍標(biāo)準(zhǔn)劑量組間無(wú)顯著差異。說(shuō)明適量增大催產(chǎn)劑量可提高催產(chǎn)效果。

3 討論

GnRH是由下丘腦分泌細(xì)胞合成與分泌，通過(guò)刺激垂體前葉釋放GTH，以調(diào)節(jié)腦垂體分泌活動(dòng)及性腺發(fā)育的主要激素之一（Amono et al.，1997）。GTH在許多硬骨魚(yú)類中存在兩種類型：GTH-I和GTH-Ⅱ。其中，GTH-I具有促進(jìn)卵黃蛋白原進(jìn)入卵母細(xì)胞的作用，GTH-Ⅱ則能刺激性激素生成、配子發(fā)生與成熟、排卵（Idler et al.，1975；Swanson et al.，1991）。E2是由卵巢卵泡細(xì)胞所分泌，能夠促進(jìn)卵巢發(fā)育、副性征出現(xiàn)、排卵后卵巢的再發(fā)育及促使肝臟合成卵黃蛋白原（Holland et al.，2000）；而P分泌水平與卵母細(xì)胞成熟有關(guān)，首先被轉(zhuǎn)化為17α-羥孕酮（17α-OHP），再被轉(zhuǎn)化為17α，20β-雙羥孕酮（17α，20β-DHP），而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞最后成熟及排卵（Comeau et al.，2001）。本研究中，以不同催產(chǎn)激素組合注射雌性尼羅羅非魚(yú)后，均可引起其血清類固醇激素（GnRH、GTH、E2和P）含量明顯升高，其中，GnRH、E2含量在注射后24 h達(dá)最大值，隨著時(shí)間推移，GnRH、E2含量逐漸下降，至注射后72 h接近正常水平；GTH、P含量在注射后24 h顯著上升，36 h達(dá)最大值，之后也呈逐漸下降趨勢(shì)。雌性尼羅羅非魚(yú)血清中不同類固醇激素的應(yīng)答時(shí)間存在先后順序差異（GTH晚于GnRH，P晚于E2），可能是垂體中GTH的合成與分泌活動(dòng)直接受下丘腦GnRH分泌水平調(diào)節(jié)，由于P的主要生理作用是誘導(dǎo)卵巢最后成熟及排卵，其分泌一般晚于雌激素分泌是受內(nèi)分泌系統(tǒng)自身調(diào)控，與團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）（姜仁良等，1986）、大鱗副泥鰍（Paramisgumus dabryanus）（宋艷等，2007）、條斑星鰈（Verasper moseri）（倪娜等，2011）等產(chǎn)卵前E2、P表達(dá)最高峰時(shí)期順序基本一致。

不同催產(chǎn)激素組合對(duì)血清類固醇激素含量變化的影響不盡相同。本研究中，組合③、④和⑤的影響作用顯著高于組合①和②。組合③、④和⑤中均含有HCG、LRH-A2和DOM，推測(cè)HCG（或HCG+LRH-A2）對(duì)雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素含量影響作用更顯著，與Fernandes等（2013）的研究結(jié)果一致，即單一激素條件下，HCG的誘導(dǎo)效應(yīng)高于LRH-A2和GnRH-A4。LRH-A2主要作用于腦垂體，引起促卵泡素和促黃體素生成，促使卵巢成熟及排卵（龍進(jìn)等，2004）；而HCG具有促使性腺成熟發(fā)育、性激素產(chǎn)生、促進(jìn)排卵、促黃體產(chǎn)生等生理作用（左永松等，2013）。DOM為多巴胺（DA）拮抗物，DA在垂體水平可阻抑GnRH和GTH的合成與釋放，注射DOM可在垂體水平上消除DA的抑制作用，間接促進(jìn)類固醇類激素的合成與分泌。比較組合③、④和⑤的注射效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)繼續(xù)增加激素種類如PG和GnRH-A4，雖然對(duì)雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素含量上升仍有一定的促進(jìn)作用，但不同催產(chǎn)激素組合間的效應(yīng)差異不顯著，其原因或許與多種激素組合的效應(yīng)間存在一定拮抗或抑制作用有關(guān)。從經(jīng)濟(jì)實(shí)用角度考慮，組合③（DOM 6 mg/kg+LRH-A2 10 μg/kg+ HCG 2000 U/kg）是引起雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素含量變化作用最佳的激素組合，與吉富品系尼羅羅非魚(yú)人工催產(chǎn)中的激素組合（李瑞偉等，2011）基本一致。

不同劑量催產(chǎn)激素的催產(chǎn)效果也不同，劑量過(guò)低其催產(chǎn)效果不明顯，劑量過(guò)高則可能抑制催產(chǎn)效果甚至引起親魚(yú)死亡（宋艷等，2007）。激素劑量效應(yīng)可能是通過(guò)受體效應(yīng)、信號(hào)通路及負(fù)反饋調(diào)節(jié)等共同作用實(shí)現(xiàn)。本研究中，1.5倍劑量組的雌性尼羅羅非魚(yú)血清類固醇激素含量變化顯著高于1.0和2.0倍劑量組，2.0倍劑量組與1.0倍劑量組間無(wú)顯著差異。這可能是2.0倍劑量組濃度過(guò)高，通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)途徑，在一定程度上抑制了“腦—垂體—性腺”軸的分泌活動(dòng)，而未能引起血清類固醇激素含量明顯上升。因此，確定1.5倍劑量組（DOM 9 mg/kg+LRH-A2 15 μg/kg+HCG 3000 U/kg）為雌性尼羅羅非魚(yú)的最佳催產(chǎn)激素誘導(dǎo)水平，生產(chǎn)上可推廣應(yīng)用。此外，雌性尼羅羅非魚(yú)性腺發(fā)育屬于非同步型，催產(chǎn)前需通過(guò)人工擠卵方法判斷親魚(yú)的成熟度。經(jīng)實(shí)踐證實(shí)，尼羅羅非魚(yú)人工繁殖的最佳時(shí)機(jī)宜選擇在越冬后第一次產(chǎn)卵前，此時(shí)性腺發(fā)育相對(duì)整齊，挑選獲得成熟度好的親魚(yú)機(jī)率較大。

4 結(jié)論

進(jìn)行尼羅羅非魚(yú)人工繁殖時(shí)，使用多種催產(chǎn)激素組合的效果優(yōu)于單一催產(chǎn)激素，且催產(chǎn)劑量一般應(yīng)高于常規(guī)魚(yú)類。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）