蜜蜂主要病害及其病原PCR檢測研究進展

劉學(xué)錄 童金鳳 馬振剛

摘要：蜜蜂疾病已成為制約蜂產(chǎn)品產(chǎn)量提高和蜂產(chǎn)品安全的重要因素，引起蜜蜂疾病的病原種類很多，包括細(xì)菌型、真菌型、病毒型及寄生蟲類病害等。文章通過綜述蜜蜂蜂群中四類主要病害（細(xì)菌型病害、真菌型病害、病毒型病害和寄生蟲類病害）的致病病原、病癥及其PCR檢測方法，發(fā)現(xiàn)由于某些相似病原體間的基因序列具有高度保守性，在實際診斷過程中仍然存在缺乏PCR鑒定靶標(biāo)、PCR檢測假陽性等問題。因此，今后應(yīng)著眼于以下幾點，有效解決蜜蜂疾病快速、特異診斷的障礙：（1）篩選單一病原體的特異候選靶標(biāo)基因，提高PCR檢測結(jié)果的特異性；（2）設(shè)計并優(yōu)化針對特異基因片段的引物序列，降低引物錯配率；（3）基于先進的病原檢測方法，建立靈敏度更高的疾病診斷方法；（4）完善LAMP、ELISA、免疫試紙條法等在蜜蜂疾病診斷中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 蜜蜂；主要病害；癥狀；PCR檢測

中圖分類號： S895 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）01-0147-06

0 引言

蜜蜂是一類重要的經(jīng)濟昆蟲，在構(gòu)建與維持自然生態(tài)系統(tǒng)和生態(tài)農(nóng)業(yè)、供給人類高級營養(yǎng)和保健功能產(chǎn)品的過程中扮演重要角色（Ren et al.，2014）。我國是養(yǎng)蜂大國，也是世界蜂產(chǎn)品生產(chǎn)和出口大國，每年出口的蜂蜜數(shù)量占世界出口總量的20%左右，年均出口創(chuàng)匯達(dá)1.4億美元。同時，蜜蜂已經(jīng)成為一種世界性的重要的經(jīng)濟模式生物。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）不完全統(tǒng)計，20世紀(jì)60～90年代世界蜜蜂種群數(shù)量一直呈上升趨勢（陳黎紅等， 2012）。但蜜蜂在生存過程中，易受各類外界條件威脅，其中蜜蜂傳染性病蟲害因危害程度嚴(yán)重、傳播迅速、持續(xù)時間長等特點，已成為制約蜂產(chǎn)品產(chǎn)量提高和蜂產(chǎn)品安全的重要因素。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）也將蜜蜂病定為B類法定報告疾?。ú苈?lián)飛等，2006）。在蜂業(yè)生產(chǎn)過程中，引起蜜蜂疾病的病原種類很多，包括細(xì)菌型、真菌型、病毒型病害等。蜜蜂受到疾病威脅，不僅導(dǎo)致其大量死亡而影響蜂群的生產(chǎn)能力，還伴有傳染性病原微生物污染，蜂產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量受到影響；此外，在疾病防治過程中常因用藥不當(dāng)致使藥物殘留，造成蜂產(chǎn)品的雙重污染。傳統(tǒng)的蜜蜂疾病診斷主要依靠肉眼觀察患病蜜蜂的病癥及電鏡觀察分離、純化獲得的病原，其方法耗時長、操作繁瑣且不易進行明確區(qū)分，如患?xì)W洲幼蟲腐臭病和中蜂囊狀幼蟲病毒的蜜蜂均可出現(xiàn)“插花子脾”現(xiàn)象。新興的PCR分子檢測技術(shù)是在分子水平上，針對不同種病原的分子特異性片段進行擴增鑒定，具有快速、方便、準(zhǔn)確等優(yōu)勢，一直受到蜜蜂疾病診斷研究者的廣泛關(guān)注。為此，本文通過綜述蜜蜂主要病害及其病原PCR檢測的研究進展，以期為蜜蜂疾病診斷及病原體快速鑒定方法的建立提供參考依據(jù)。

1 細(xì)菌型疾病

細(xì)菌型疾病是一種嚴(yán)重危害蜜蜂蜂群正常生長、發(fā)育的傳染性疾病，具有感染時間長、傳播速度快、危害程度大等特點。目前比較具有代表性的蜜蜂細(xì)菌型疾病包括：美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病、成蜂螺原體病、敗血病和副傷寒桿病，對應(yīng)的主要致病病原分別是類幼蟲芽孢桿菌、蜂房蜜蜂球菌、螺原體、蜜蜂敗血假單胞菌和蜂房哈夫尼菌。美洲幼蟲腐臭病和歐洲幼蟲腐臭病屬于蜜蜂幼蟲病，患美洲幼蟲腐臭病的蜜蜂最初會在體色上發(fā)生明顯變化，顏色由正常的珍珠白變?yōu)樽攸S色、褐色甚至黑褐色，房蓋由凸起變?yōu)榘枷?，且潮濕、顏色變暗，整個房蓋顏色交錯，感染后期用鑷子挑起蟲尸可拉成2～3 cm的細(xì)絲，且伴有魚腥臭味（Shimanuki et al.，1980；張其安等，2011）；而患?xì)W洲幼蟲腐臭病的幼蟲體色先呈蒼白色，逐漸變化為黃色，最后呈深褐色，并且可見白色窄條狀背線，死尸無黏稠性但有酸臭味，易被工蜂清除掉而留下空房，其與子房相間形成“插花子脾”現(xiàn)象（孫希國，2014）。蜂螺原體病、敗血病和副傷寒桿病屬于成蜂病，患成蜂螺原體病的蜜蜂行動緩慢，失去飛翔能力，常見三五成群聚集在土洼或草叢中；患敗血病蜜蜂的典型癥狀是染病初期成蜂拒食、煩躁不安、無力飛翔、爬行于箱內(nèi)外、振翅，最后抽搐、痙攣而死，病死的蜜蜂變色、變軟、腐爛，直至肢節(jié)分離（彭文君等，2014）；患副傷寒桿病的病蜂多表現(xiàn)出“大肚型”：患病蜂腹部膨大、虛弱、行動遲緩、無飛翔能力、部分肢節(jié)麻痹、下痢，有時也會存在“油光黑蜂型”：病蜂絨毛脫落，頭腹部縮小且似油炸般（洪德興，2000）。

在養(yǎng)蜂生產(chǎn)過程中，蜂業(yè)工作者通常使用四環(huán)素類抗生素（TCs）對蜜蜂敗血病或美洲幼蟲腐臭病等細(xì)菌型疾病進行預(yù)防和治療，進而造成蜂產(chǎn)品中TCs藥物殘留。如利用羥四環(huán)素（Oxytetracycline，OTC）可實現(xiàn)對美洲幼蟲腐臭病的有效控制，但蜂群儲蜜須經(jīng)多次搖除后才能有效將OTC殘留量降低到一個相對較低的標(biāo)準(zhǔn)。2002年初，我國蜂產(chǎn)品因氯霉素等抗生素殘留超標(biāo)而被禁止出口歐盟。因此有必要加快并實現(xiàn)蜜蜂幼蟲病的快速診斷，減少抗生素等藥物的使用。至今，針對蜜蜂主要細(xì)菌性疾病的PCR檢測方法已初步建立（表1），如歐洲幼蟲腐臭病可根據(jù)針對Melissococcus pluton的16S rRNA基因設(shè)計特異性引物開展診斷，其引物特異性強，不與其他DNA產(chǎn)生雜交反應(yīng)（Govan et al.，1998）；針對蜜蜂螺原體（Spiroplasma melliferum）也建立了一種PCR快速檢測方法，其最低檢測濃度為5～6個/mL（李霞，2012）；針對美洲幼蟲腐臭病檢測則建立了更精確的二溫式PCR檢測方法，其檢測幼蟲芽孢桿菌的DNA靈敏度達(dá)33 fg，且重復(fù)性良好（何曉杰等，2015）；而針對副傷寒桿病，是根據(jù)甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原特異性基因DNA核苷酸序列設(shè)計特異性上、下游引物及熒光探針序列（冉燕，2009）。

2 真菌型疾病

真菌型疾病是一種嚴(yán)重影響蜜蜂蜂群發(fā)展的頑固性傳染病，其發(fā)生與多雨、潮濕、溫度不穩(wěn)定有關(guān)，且多見于西方蜜蜂，如白惡病、黃曲霉病均可引起蜜蜂幼蟲死亡。蜜蜂白堊病又名石灰質(zhì)病，是由蜜蜂球囊菌（Ascosphaeraapis）引起蜜蜂幼蟲死亡的真菌型傳染?。ㄚw紅霞等，2014）；黃曲霉病又稱結(jié)石病或石蜂子病，是一種由黃曲霉菌引起的蜜蜂傳染病。一般4日齡蜜蜂幼蟲極易感染蜜蜂白堊病，且雄蜂幼蟲較工蜂更易感染，患病幼蟲常出現(xiàn)蟲體膨脹特征并長出白色絨毛充滿于整個巢房（Maxfield-Taylor et al.，2015），蟲體多呈六邊形狀，患病后期萎縮干枯、褶皺、變硬發(fā)白或呈黑褐色（趙柏林，2007）。蜜蜂幼蟲、蛹和成年蜂均易受黃曲霉病感染，但常見于幼蟲和蛹，該病多發(fā)生在夏秋多雨季節(jié)；幼蟲和蛹死亡后先呈蒼白色，之后逐漸變干、變硬，表面長滿白色菌絲和黃色帶點綠的孢子（陳曉云，2013a），且充滿巢房，輕微振動則孢子四處飛散；成年蜂染病后，一開始表現(xiàn)不安寧，之后變得虛弱無力，常爬出巢房外死亡。

蜜蜂真菌型疾病頻繁發(fā)生，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)蜂業(yè)的快速發(fā)展。目前，針對蜜蜂真菌型疾病的PCR檢測方法也有報道（表2）。蜜蜂白堊病診斷是選擇蜜蜂球囊菌的ITS1、ITS2和5.8S rDNA保守序列（U68313）為靶標(biāo)，建立TaqMan探針熒光PCR檢測法，其靈敏度為1 ng/μL（宋戰(zhàn)昀等，2010a）。針對黃曲霉菌檢測，可以參考基于alfP基因的巢氏PCR（Nested-PCR），其特異性較高（劉裴清等，2015）。

3 病毒型疾病

病毒型疾病是由蜜蜂病毒引起的傳染性疾病，其病原主要屬于腸道病毒屬和虹彩病毒屬。低濃度的蜜蜂病毒可長期以無明顯發(fā)病癥狀的感染方式停留在蜜蜂體內(nèi)，一旦在特定環(huán)境條件下被激發(fā)，將會表現(xiàn)出強烈的致病性而引起蜜蜂快速死亡。目前，蜜蜂病毒病主要包括中蜂囊狀幼蟲病、蜜蜂急性麻痹病、蜜蜂慢性麻痹病、蜜蜂克什米爾病毒病、蜜蜂黑蜂王臺病毒病、蜜蜂卷翅病毒病和蜜蜂以色列急性麻痹病毒病等。

近年來，中蜂囊狀幼蟲病在養(yǎng)蜂區(qū)經(jīng)常暴發(fā)，嚴(yán)重影響了我國中蜂產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。引起囊狀幼蟲病的病原是腸道病毒屬的囊狀幼蟲病毒（Chinese sac brood virus，CSBV），屬于正鏈單股小核糖核酸病毒，對蜂群危害極其嚴(yán)重，且中華蜜蜂較西方蜜蜂更易感??；發(fā)病初期無明顯癥狀，中期幼蟲背部呈棕色斑點，并逐漸變成暗灰色，皮下滲出液增多且略帶黃色，形似水袋；發(fā)病后期，子脾上既有死蛹也有健康蛹，出現(xiàn)“插花子脾”現(xiàn)象（李薇等，2014）。蜜蜂急性麻痹病是由腸道病毒屬的急性蜜蜂麻痹病毒（Acute bee paralysis virus，ABPV）所引起；該病毒主要侵害蜜蜂的神經(jīng)系統(tǒng)，且在35 ℃下致病性最強；染病的成年工蜂表現(xiàn)出麻痹癥狀，失去飛行能力，離巢后快速死亡。與蜜蜂急性麻痹病不同，蜜蜂慢性麻痹病的病原是慢性蜜蜂麻痹病病毒（Chronic bee paralysis virus，CBPV）。CBPV是一種正鏈單鏈RNA病毒，由兩段長度分別為3647個堿基（RNA1）和2305個堿基（RNA2）的RNA單鏈構(gòu)成，主要侵襲成年工蜂，感染的蜂群可能同時出現(xiàn)Ⅰ型和Ⅱ型兩種典型的麻痹病癥。Ⅰ型麻痹綜合癥表現(xiàn)為患病蜜蜂身體和雙翅不正常振顫、雙翅常無法閉合，失去飛行能力；Ⅱ型麻痹綜合癥又稱“黑盜蜂”、“脫毛黑蜂癥”或“黑小蜂”等，患病蜜蜂個體初期具備飛行能力，身體絨毛逐漸脫落，體色加深變黑。蜜蜂克什米爾病是由蜜蜂克什米爾病毒（Kashmir bee virus，KBV）引起，目前該病毒已先后在東方蜜蜂和西方蜜蜂體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)；感染初期無明顯發(fā)病癥狀，一旦有少數(shù)病毒顆粒進入蜜蜂淋巴液后，便可在短時間內(nèi)大量繁殖復(fù)制，病毒濃度急劇增加，最終導(dǎo)致染病蜜蜂在3 d內(nèi)死亡。蜜蜂黑蜂王臺病毒（Black queen cell virus，BQCV）是引起蜜蜂黑蜂王臺病毒病的病原，該病毒已經(jīng)在歐洲、北美和澳大利亞鑒定出；主要危害蜂王的幼蟲和蛹，春季和初夏為發(fā)病高峰期，其典型癥狀為患病幼蟲體色變黃，表皮逐漸硬化成一皮囊；發(fā)病蜂蛹體色變暗，快速死亡，甚至王臺內(nèi)壁被染呈棕色或黑色（張炫等，2012）。蜜蜂卷翅病毒病是由蜜蜂卷翅病毒（Deformed wing virus，DWV）所引起，發(fā)病成蜂的雙翅卷曲變皺，身體萎縮，體色變暗，只能爬行，失去飛行能力，羽化后1～2日內(nèi)死亡（Ribière et al.，2002）。以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus，IAPV）是一種廣泛傳播于蜜蜂群體間的RNA病毒，此病毒可侵染任意發(fā)育時期的蜜蜂，蜜蜂感染初期，其腹部、胸部逐漸變黑，既不采食也不飛行，不停地在蜂箱外空地上轉(zhuǎn)圈，后期胸部絨毛脫落，麻痹、抽搐而死（Maori et al.，2007）；也有研究初步證實，該病毒可能是導(dǎo)致蜂群崩潰失調(diào)癥（Colony collapse disorder，CCD）的最大影響因素，因此備受關(guān)注。

蜜蜂病毒病屬于暴發(fā)性傳染病，因此前期的蜂病監(jiān)測具有重要意義。至今，針對蜜蜂中蜂囊狀幼蟲病的診斷研究較多，常規(guī)RT-PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）兩種檢測方法均已被推廣應(yīng)用于CSBV檢測，且對比發(fā)現(xiàn)LAMP診斷結(jié)果更快速、特異，其檢測最低限度為1 pg（Ma et al.，2011）；基于TaqMan探針的熒光PCR檢測方法也被應(yīng)用于CSBV檢測，其檢測靈敏度為1.0×102拷貝/μL（宋戰(zhàn)昀等，2010a）。在針對ABPV、CBPV、KBV、BQCV、DWV和IAPV的檢測中，RT-PCR檢測方法已比較成熟，均能特異地擴增獲得靶基因（表3），為蜜蜂病毒病的快速檢測提供了技術(shù)支持。

4 寄生蟲類疾病

寄生蟲類疾病是因寄生蟲寄生于蜜蜂宿主而引起的傳染性疾病，主要通過侵染蜜蜂不同部位及攝取蜜蜂體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)而最終導(dǎo)致蜜蜂組織崩潰。目前較常見的寄生蟲病包括蜜蜂微孢子蟲病、阿米巴病和蜂螨病。感染寄生蟲后的蜜蜂均表現(xiàn)出體質(zhì)衰弱，蜂群發(fā)展緩慢，已逐漸成為制約蜂產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害。

蜜蜂微孢子蟲病（Microsporidiosis）又稱蜜蜂微粒子病，其病原為蜜蜂微孢子蟲（Nosemaapis），主要寄生于中腸組織，受感染的蜜蜂因維持穩(wěn)態(tài)和組織更新等相關(guān)基因受到嚴(yán)重抑制而引發(fā)組織崩潰；患病初期無明顯外部癥狀，且飛行正常；患病后期，蜜蜂個體瘦小，反應(yīng)遲鈍，萎靡不振，兩翅散開不相連，且蟄刺反應(yīng)喪失，腹部1～3節(jié)背板呈深棕色，前胸背板和腹尖變黑，多爬伏在框梁或蜂箱前草地上。阿米巴病是由蜜蜂馬氏管變形蟲（Malipighamoeba mellificae）侵襲成蜂馬氏管所引起的一種傳染病，患病蜂群發(fā)展緩慢，群勢逐漸減弱，但在群內(nèi)及蜂箱周圍很少見到死蜂；病蜂腹部膨大，有時出現(xiàn)下痢癥狀，體質(zhì)衰弱，無力飛行，不久死亡；取病死蜜蜂鏡檢，發(fā)現(xiàn)馬氏管膨大，近似透明狀，且管內(nèi)充滿珍珠樣的包囊（彭文君等，2014）。螨蟲寄生是蜜蜂最主要的病害之一，目前已發(fā)現(xiàn)有7種蜂螨，其中以大蜂螨、小蜂螨及武氏蜂盾螨對養(yǎng)蜂業(yè)的危害較大。大蜂螨常寄生于蜂體胸、翅、足基部，感染后蜜蜂蜂體衰弱，采集力下降，壽命減短，成年工蜂煩躁不安，四處亂爬，無法正常飛行；小蜂螨常寄生于幼蟲體內(nèi)，多在子脾上活動（陳曉云，2013b），感染后蜜蜂幼蟲表皮破裂，呈乳白色或淺黃色，可造成比大蜂螨更嚴(yán)重的“爛子”現(xiàn)象（彭文君等，2014）。

為了更好地診斷蜜蜂寄生蟲病，有關(guān)學(xué)者也在積極尋找更簡便、快速的檢測方法（表4）。對于蜜蜂微孢子蟲病，已針對西方蜜蜂微孢子蟲16S rRNA基因（U26534，GI857487）、小亞基單位核糖體DNA（16S rDNA）及核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因序列的高度特異區(qū)域設(shè)計了特異性引物，經(jīng)PCR擴增可成功獲得特異的DNA片段（何超，2014）。在蜜蜂阿米巴病檢測研究中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）已被報道，是根據(jù)阿米巴變形蟲（Entamoeba histolytica）的HYL6基因設(shè)計LAMP引物，其檢測靈敏度可達(dá)15.8 ng/μL（Rivera and Ong，2013）。

5 展望

在蜂業(yè)生產(chǎn)過程中及時檢測并正確區(qū)分疾病病原，對有效阻斷病原傳播、保障蜂產(chǎn)品安全具有重要意義。PCR作為新一代的病原檢測技術(shù)，是以病原微生物特異、保守的DNA/RNA分子序列為檢測靶標(biāo)，通過設(shè)計特異性引物進行擴增，具有誤差小、方法簡單、操作便捷、特異性強等特點，可針對病原進行一對一地檢測，極大提高了對蜜蜂疾病的診斷效率。由于某些相似病原體間的基因序列具有高度保守性，因此在實際診斷過程中仍然存在缺乏PCR鑒定靶標(biāo)、PCR檢測假陽性等問題。隨著現(xiàn)代基因與轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)的高速發(fā)展，今后應(yīng)著眼于以下幾點，有效解決蜜蜂疾病快速、特異診斷的障礙：（1）基于已測序的蜜蜂病原體基因與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過比較基因組學(xué)分析方法，篩選單一病原體的特異候選靶標(biāo)基因，提高PCR檢測結(jié)果的特異性，避免交叉擴增，進而確保診斷結(jié)果更準(zhǔn)確；（2）設(shè)計并優(yōu)化針對特異基因片段的引物序列，降低引物錯配率，提高PCR擴增結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信性；（3）基于先進的病原檢測方法，如實時定量RT-PCR（qRT-PCR）、TaqMan探針、電化學(xué)檢測、LAMP等，建立靈敏度更高的疾病診斷方法；（4）完善LAMP、ELISA、免疫試紙條法等在蜜蜂疾病診斷中的應(yīng)用，促使蜜蜂疾病診斷更加快速便捷。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）