淫羊藿水提取物聯(lián)合抗菌藥對(duì)耐藥大腸桿菌的體外抑制效果

胡梅 梁政 黎天良 秦風(fēng)偉 羅遠(yuǎn)燕 吳永繼 劉增援 趙雨川 司紅彬

摘要：【目的】探究淫羊藿水提取物聯(lián)合抗菌藥對(duì)耐藥大腸桿菌的體外抑菌效果，為獸醫(yī)臨床中西聯(lián)合用藥提供參考依據(jù)，也為中藥在抑制耐藥菌株上的開(kāi)發(fā)研究打下基礎(chǔ)。【方法】采用二倍微量肉湯稀釋法測(cè)定淫羊藿水提取物及各抗菌藥對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC），然后以微量肉湯棋盤(pán)稀釋法測(cè)定淫羊藿水提取物與抗菌藥聯(lián)用后的部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）。【結(jié)果】淫羊藿水提取物與粘桿菌素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素聯(lián)用后能有效降低藥物的MIC，對(duì)應(yīng)的MIC均降低4倍以上，聯(lián)合用藥的FICI分別為0.13、0.26、0.26、0.25、0.51、0.51、0.50、0.75、0.75和0.75，對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制效果表現(xiàn)出協(xié)同或相加作用；以其聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌傳代，從第1代即能明顯降低這些抗菌藥的MIC，且穩(wěn)定至第3代?！窘Y(jié)論】淫羊藿水提取物與粘桿菌素、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素聯(lián)用是通過(guò)協(xié)同或相加作用而提高抗菌藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制效果，但不宜與磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)聯(lián)合用藥。

關(guān)鍵詞： 淫羊藿；抗菌藥；產(chǎn)ESBLs大腸桿菌；聯(lián)合用藥；抑制效果

中圖分類(lèi)號(hào)： S853.75 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）10-1778-06

0 引言

【研究意義】近年來(lái)，因抗生素廣泛及不合理使用帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)致使多種細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致臨床治療失敗、感染復(fù)發(fā)、死亡率增加等（劉芬和姜成，2009）。同時(shí)，被耐藥菌污染的動(dòng)物源性食品也會(huì)對(duì)人類(lèi)健康造成極大威脅。在規(guī)?；a(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，動(dòng)物腸道疾病多發(fā)，治療藥物仍以抗生素為主，長(zhǎng)期低劑量用藥極易導(dǎo)致動(dòng)物腸道內(nèi)正常菌群在抗菌藥的壓力下產(chǎn)生耐藥性，尤以大腸桿菌最突出。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素在獸醫(yī)臨床抗感染治療中使用最廣泛，隨著第三代頭孢菌素的開(kāi)發(fā)普及，細(xì)菌耐藥種類(lèi)進(jìn)一步增多。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）是介導(dǎo)第三代頭孢菌素耐藥的主要機(jī)制之一，同時(shí)對(duì)青霉素類(lèi)、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素均表現(xiàn)出耐藥性（司紅彬等，2015）。因此，如何有效控制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌感染與蔓延已成為當(dāng)前獸醫(yī)工作的新重點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】我國(guó)中藥資源豐富，且中藥不易產(chǎn)生藥物殘留，不易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用小，價(jià)格低廉，具有極大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景（鄭紅青等，2011）。淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim.）為小檗科（Berberidaceae）淫羊藿屬（Epimedium）多年生草本植物（高澤梅等，2014），其作為滋補(bǔ)類(lèi)中藥，具有強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、抗衰老、提高免疫力、抑制腫瘤等功效，為最具開(kāi)發(fā)潛力的中藥之一，也是國(guó)際上多年來(lái)重點(diǎn)研究的藥用植物（李作洲等，2005）。早在1935年就有學(xué)者開(kāi)始對(duì)該屬植物進(jìn)行較詳細(xì)的化學(xué)成分研究，分離獲得各類(lèi)化學(xué)成分約130種，包括黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、生物堿、木脂素、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、酚苷類(lèi)、紫羅酮類(lèi)、乙醇苷類(lèi)等（李牡丹等，2009）。隨著中藥藥理學(xué)的不斷發(fā)展，人們對(duì)淫羊藿藥理作用的研究也逐漸深入到細(xì)胞、亞細(xì)胞和基因水平（孟寧等，2010）。濮祖茂等（2004）研究表明，淫羊藿具有能促進(jìn)骨髓細(xì)胞DNA合成、組織蛋白合成及骨細(xì)胞生長(zhǎng)等作用；蔣春茂等（2015）研究表明，淫羊藿多糖對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的安全濃度為312.5 μg/mL，無(wú)論是單獨(dú)使用還是協(xié)同植物血凝素（PHA）和脂多糖（LPS）均能有效刺激外周血T淋巴細(xì)胞或脾臟B淋巴細(xì)胞，不同程度地增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性。此外，李花（2008）對(duì)淫羊藿藥理作用、王文龍等（2011）對(duì)其提取工藝、孫娥等（2014）對(duì)其炮制工藝等分別進(jìn)行了相關(guān)研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前已有研究證實(shí)，中西藥聯(lián)合用藥既能減少藥品用量、提高治療效果，又可減少不良反應(yīng)現(xiàn)象，甚至能逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對(duì)一些抗生素的耐藥性（王靜和張淑文，2007；宋劍武等，2014；劉增援等，2015；吳永繼等，2015），已成為治療產(chǎn)ESBLs細(xì)菌感染的一個(gè)新方向，但至今有關(guān)淫羊藿提取物與抗菌藥聯(lián)用抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探究淫羊藿水提取物聯(lián)合抗菌藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的體外抑菌效果，以期為獸醫(yī)臨床中西聯(lián)合用藥提供參考依據(jù)，也為中藥在抑制耐藥菌株上的開(kāi)發(fā)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

淫羊藿購(gòu)自廣西佰政藥業(yè)有限公司；產(chǎn)ESBLs大腸桿菌由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存提供；頭孢曲松、阿莫西林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、磷霉素、粘桿菌素、乙酰甲喹、克林沙星、磺胺間甲氧嘧啶、加替沙星、頭孢他啶、林可霉素、頭孢噻呋、氟苯尼考均在有效期內(nèi)；腸桿菌科生化鑒定管、MH瓊脂、MH肉湯、麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯等培養(yǎng)基均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1. 2 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌檢測(cè)

1. 2. 1 ESBLs初篩 按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的ESBLs標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行篩選。將分離獲得的疑似產(chǎn)ESBLs菌株涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，檢測(cè)受試菌的抑菌環(huán)直徑是否滿(mǎn)足頭孢他啶（CAZ 30 μg/片）≤22 mm，氨曲南（AZM 30 μg/片）≤27 mm，頭孢噻肟（CTX 30 μg/片）≤

27 mm，頭孢曲松（CRO 30 μg/片）≤25 mm，若滿(mǎn)足上述抑菌直徑要求即可初步判定產(chǎn)ESBLs。

1. 2. 2 ESBLs表型確證 按CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法對(duì)初篩菌株進(jìn)行ESBLs表型確證，具體操作參照宋劍武等（2014）的方法。

1. 2. 3 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌基因型檢測(cè) 參照GenBank中登錄的TEM、CTX-M、OXA-10、SHV基因序列，利用Primer Premers 5.0分別設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。因后期進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該受試菌株對(duì)磷霉素具有較高的耐藥性，故同時(shí)進(jìn)行fosA3基因型檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系25.00 μL，即DNA模板2.00 μL，上、下游引物各1.00 μL，10×Easy Taq Buffer 2.50 μL，10 mmol/L High Pure dNTPs 0.50 μL，Easy Taq DNA聚合酶0.25 μL，去離子水補(bǔ)足至25.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，在各自退火溫度（TEM基因52.5 ℃，CTX-M基因55.0 ℃，OXA-10基因52.5 ℃，SHV基因56.5 ℃，fosA3基因55.0 ℃）下退火30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，同時(shí)將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

1. 3 淫羊藿水提取物制備

取淫羊藿干燥粗粉100 g，加入10倍量的蒸餾水浸泡過(guò)夜，大火煮至沸騰并保持1 h，過(guò)濾收集濾液；同樣方法再依次加入8倍量與6倍量的蒸餾水反復(fù)提取2次，合并3次濾液，濃縮至100 mL，此時(shí)藥物濃度為1 g/mL，高壓滅菌后冷藏備用。

1. 4 淫羊藿水提取物與抗菌藥聯(lián)合用藥試驗(yàn)

1. 4. 1 單藥最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 采用二倍微量肉湯稀釋法測(cè)定淫羊藿水提取物及各抗菌藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1. 4. 2 淫羊藿水提取物與各抗菌藥的體外聯(lián)合用藥試驗(yàn) 采用微量方陣棋盤(pán)法設(shè)計(jì)，調(diào)整菌液濃度為1×106 CFU/mL，接種于96孔無(wú)菌培養(yǎng)板，在縱橫兩個(gè)方向上對(duì)兩種藥物分別進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?7 ℃下振蕩培養(yǎng)16～18 h，觀察淫羊藿水提物與抗菌藥聯(lián)合用藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的MIC，計(jì)算其部分抑菌濃度指數(shù)（FICI），并根據(jù)宋劍武等（2014）的方法進(jìn)行判讀。FICI≤0.50為協(xié)同作用，0.502.00為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2. 1 ESBLs的初篩和表型確證結(jié)果

按CLSI推薦的ESBLs標(biāo)準(zhǔn)對(duì)疑似產(chǎn)ESBLs菌株進(jìn)行初篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其抑菌環(huán)直徑分別為：頭孢他啶15 mm、氨曲南13 mm、頭孢噻肟17 mm、頭孢曲松14 mm，符合篩選標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)而對(duì)該菌株進(jìn)行表型確證試驗(yàn)，結(jié)果顯示頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸的抑菌環(huán)直徑分別為15、23、17和23 mm；頭孢他啶和頭孢噻肟?jī)煞N藥物添加克拉維酸后，二者的差值均>5 mm，表明該菌株為產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。

2. 2 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌基因檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果

對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌進(jìn)行基因檢測(cè)，其PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果（圖1）顯示，僅擴(kuò)增獲得fosA3和TEM基因的對(duì)應(yīng)條帶，而未發(fā)現(xiàn)有CTX-M、SHV和OXA基因條帶。對(duì)該菌株進(jìn)行測(cè)序，再用BLAST進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株所含的TEM基因與KM598665.1的同源性為100%，fosA3基因與NG_041568.1的同源性為99%。

2. 3 淫羊藿水提取物聯(lián)合抗菌藥的微量方陣棋盤(pán)法結(jié)果

由表2可知，淫羊藿水提取物與大部分抗菌藥（粘桿菌素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素）聯(lián)用后能有效降低藥物的MIC，對(duì)應(yīng)的MIC均降低4倍以上，尤其是頭孢類(lèi)抗菌藥，在聯(lián)合用藥后能很大程度地抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌，聯(lián)合用藥的FICI分別為0.13、0.26、0.26、0.25、0.51、0.51、0.50、0.75、0.75和0.75，表現(xiàn)出協(xié)同或相加作用；但淫羊藿水提取物與喹諾酮類(lèi)抗菌藥表現(xiàn)出拮抗作用，致使喹諾酮類(lèi)抗菌藥的MIC增大。

2. 4 淫羊藿水提取物與抗菌藥聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌傳代結(jié)果

由表3可知，淫羊藿水提取物與粘桿菌素、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌傳代，第1代即能明顯降低這些抗菌藥的MIC，且穩(wěn)定至第3代；與磺胺間甲氧嘧啶聯(lián)合連續(xù)誘導(dǎo)3代，仍未能降低磺胺間甲氧嘧啶的MIC；與環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左旋氧氟沙星聯(lián)合誘導(dǎo)傳代，發(fā)現(xiàn)第1、2代產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對(duì)這些抗菌藥的MIC升高至原來(lái)的2倍，但第3代又恢復(fù)到原來(lái)的MIC水平；與加替沙星聯(lián)合誘導(dǎo)傳代，第1代產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對(duì)加替沙星的MIC保持不變，但從第2代開(kāi)始逐漸降低。

3 討論

β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物是目前使用最廣泛的一類(lèi)抗菌藥，但ESBLs的產(chǎn)生使得大腸桿菌產(chǎn)生了多重耐藥性，對(duì)頭孢菌素類(lèi)、林可胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、酰胺醇類(lèi)等抗菌藥均有較強(qiáng)的抵抗能力（劉立新等，2008）。生產(chǎn)中為了抑制產(chǎn)ESBLs病菌，通常采取加大抗菌藥劑量的措施，其結(jié)果卻進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)菌的耐藥性。中藥發(fā)展歷史悠久，且具有不易產(chǎn)生耐藥性、無(wú)殘留、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)（鄭紅青等，2011）。淫羊藿含有多種有效成分，其中淫羊藿苷被認(rèn)為是特征成分，同時(shí)含有酚苷類(lèi)、紫羅酮類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)、木脂素、多糖、有機(jī)酸、生物堿和微量元素等（李牡丹等，2009）。近年來(lái)，針對(duì)淫羊藿藥理作用的研究已逐漸深入到細(xì)胞、亞細(xì)胞和基因水平（孟寧等，2010），并證實(shí)淫羊藿除了能促進(jìn)骨髓細(xì)胞DNA合成、骨細(xì)胞生長(zhǎng)外，還具有促進(jìn)血液循環(huán)、提高免疫力、抗癌、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞及抑菌作用（付亮等，2012）。盡管目前有關(guān)淫羊藿藥理作用的研究較多，但針對(duì)淫羊藿抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的研究尚無(wú)報(bào)道。

本研究使用淫羊藿水提取物聯(lián)合抗菌藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，淫羊藿水提取物與抗菌藥聯(lián)用可選擇性地增強(qiáng)藥效，如與粘桿菌素、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素聯(lián)用能有效降低藥物的MIC，很大程度地抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌，表現(xiàn)出協(xié)同或相加作用，且經(jīng)聯(lián)合誘導(dǎo)傳代后均能明顯降低抗菌藥的MIC；但與磺胺間甲氧嘧啶、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、加替沙星、環(huán)丙沙星聯(lián)用表現(xiàn)出無(wú)關(guān)或拮抗作用，經(jīng)聯(lián)合誘導(dǎo)傳代后并不能降低抗菌藥的MIC，甚至增加抗菌藥的MIC?？梢?jiàn)，并不是所有的抗菌藥都適宜與淫羊藿水提取物聯(lián)合用藥。本研究?jī)H通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)探討淫羊藿水提取物聯(lián)合抗菌藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制效果，有關(guān)其抑菌機(jī)理及如何調(diào)動(dòng)機(jī)體的積極因素發(fā)揮藥效尚不明確，均有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

淫羊藿水提取物與粘桿菌素、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻呋、阿莫西林、磷霉素、阿米卡星、氟苯尼考、乙酰甲喹、林可霉素聯(lián)用是通過(guò)協(xié)同或相加作用而提高抗菌藥對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑制效果，但不宜與磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)聯(lián)合用藥。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）