重金屬銅暴露對(duì)吉富羅非魚組織殘留及抗氧化酶活性的影響

單丹 鐘歡 郭忠寶 周毅 肖俊 黃一帆 黃和明 羅永巨

摘要：【目的】探討重金屬銅在魚體內(nèi)的蓄積情況，并從抗氧化酶活性強(qiáng)弱變化分析銅暴露對(duì)魚體組織造成的損害及其規(guī)律，為發(fā)展羅非魚健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。【方法】分別設(shè)0（CK）、1.0、2.0、4.0和6.0 mg/L不同銅暴露濃度的養(yǎng)殖水體，進(jìn)行為期40 d的暴露試驗(yàn)后，取羅非魚的鰓、肝臟、腎臟、肌肉和腸道組織測(cè)定其銅離子含量和抗氧化酶活性。【結(jié)果】各銅暴露處理組羅非魚的肝體比均顯著高于CK組（P<0.05，下同）。在相同銅暴露濃度下，羅非魚各組織富集銅離子的能力排序?yàn)楦闻K>腸道>腎臟>鰓>肌肉。隨著銅暴露濃度的升高，羅非魚肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性先降低后升高，而腎臟SOD活性先升高后降低；在不同組織中，以腎臟過(guò)氧化氫酶（CAT）活性最強(qiáng)，且隨銅暴露濃度升高呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在2.0 mg/L暴露濃度下其活性最強(qiáng)；丙二醛（MDA）含量在肝臟、腎臟中的變化規(guī)律與SOD活性一致，但轉(zhuǎn)折的銅暴露濃度為4.0 mg/L。【結(jié)論】銅暴露能夠使其富集在羅非魚的不同組織中，其中以肝臟組織中的富集量最高，肌肉組織中的富集量較低，即對(duì)商品羅非魚主要食用部分影響不明顯。銅暴露對(duì)羅非魚的毒害作用主要表現(xiàn)為肝臟和腎臟受損、體內(nèi)代謝紊亂。

關(guān)鍵詞： 吉富羅非魚；銅；組織殘留；抗氧化酶活性

中圖分類號(hào)： S965.125 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）10-1784-06

0 引言

【研究意義】隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，水體環(huán)境中重金屬的殘留水平也逐年增加。其中，銅及其化合物污染主要由銅鋅礦的開(kāi)采和冶煉、機(jī)械制造、塑料電鍍銅化合物、金屬加工等環(huán)節(jié)產(chǎn)生（Schnick，1988；潘科等，2014）。另外，硫酸銅是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常用的殺蟲、除藻和消毒劑（羅福廣等，2016），但盲目用藥也可能毒死養(yǎng)殖魚類或?qū)е卖~類產(chǎn)品中重金屬銅殘留量超標(biāo)。因此，探究重金屬銅對(duì)魚類組織產(chǎn)生的損傷程度及其累積規(guī)律，可為人工養(yǎng)殖魚類產(chǎn)品質(zhì)量安全控制提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，有關(guān)重金屬銅對(duì)魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)及養(yǎng)殖水體的影響已有較多研究報(bào)道。Pourang和Dennis（2005）研究發(fā)現(xiàn)，銅在蝦體各組織內(nèi)的積累差異明顯，表現(xiàn)為內(nèi)臟>鰓>肌肉。Hoyle等（2007）研究表明，基礎(chǔ)餌料中添加過(guò)量銅會(huì)抑制革胡子鯰的生長(zhǎng)發(fā)育。Wang等（2011）首次報(bào)道了由于銅污染出現(xiàn)的藍(lán)牡蠣現(xiàn)象。崔欣（2013）研究表明，日糧中添加高濃度的銅離子會(huì)降低吉富羅非魚的存活率、攝食量和增重，但對(duì)其消化功能無(wú)明顯影響；此外，高銅處理組吉富羅非魚的肝臟銅離子累積量最高，其形態(tài)結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)相應(yīng)的病變。種香玉（2014）通過(guò)對(duì)比研究高濃度銅餌料對(duì)不同食性魚的影響，結(jié)果顯示，草食性魚類對(duì)銅代謝較好、耐受性較強(qiáng)，雜食性次之，肉食性最差。綜上所述，銅暴露一段時(shí)間后，會(huì)對(duì)機(jī)體的組織造成一定損傷，可降低肝臟中的酶活性，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化作用從而形成脂肪肝（Liu et al.，2010）；并形成病理?yè)p傷，主要表現(xiàn)為組織細(xì)胞變性、裂解、壞死、溶解、腫大或增生，且毛細(xì)血管擴(kuò)張充血（王利和汪開(kāi)毓，2008，2009）。重金屬銅在機(jī)體肝臟、鰓、腎臟、肌肉和腸道組織中的積累，尤其在肌肉中的積累與食品安全及人體健康息息相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，我國(guó)已成為世界上最大的羅非魚生產(chǎn)國(guó)與出口國(guó)，而廣西作為我國(guó)羅非魚的主產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)業(yè)潛力巨大、增長(zhǎng)迅猛，具有其他省份無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，但有關(guān)重金屬銅暴露對(duì)羅非魚組織殘留及抗氧化酶活性的影響研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】將吉富羅非魚長(zhǎng)時(shí)間暴露在不同銅濃度水體中，探討銅在魚體內(nèi)的蓄積情況，并從抗氧化酶活性強(qiáng)弱變化分析銅暴露對(duì)魚體組織造成的損害及其規(guī)律，以期為發(fā)展羅非魚健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用魚為吉富羅非魚（GIFT tilapia），取自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院武鳴基地，平均體重180±20 g。試驗(yàn)前暫養(yǎng)1周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的養(yǎng)殖環(huán)境。銅暴露濃度設(shè)0（CK）、1.0、2.0、4.0和6.0 mg/L 4個(gè)處理組，每組60尾羅非魚（雌雄各半）。

1. 2 飼養(yǎng)管理

各處理組羅非魚每天投喂2次，投喂量為魚體重的3.0%～3.5%，投喂后及時(shí)清理糞便和殘餌。在整個(gè)試驗(yàn)期間，每隔3 d換水1次，換水量為2/3，養(yǎng)殖用水為曝氣后調(diào)過(guò)銅離子濃度的自來(lái)水，pH 7.0～7.8、溶解氧為5.5 mg/L、水溫（29±1）℃。試驗(yàn)開(kāi)始40 d后，分別隨機(jī)選取雌、雄魚各6尾進(jìn)行取樣（鰓、腸道、肝臟、腎臟和肌肉），用于測(cè)定銅離子含量和抗氧化酶活性。所有羅非魚在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)均測(cè)量全長(zhǎng)、體長(zhǎng)和肝重，并計(jì)算其肝體比（肝臟重量/體重）。

1. 3 銅離子殘留測(cè)定

稱取各組織樣品1.0 mg，加入1.0 mL硝酸（65%～ 68%）在EP管中硝化24 h；然后將硝化液轉(zhuǎn)移至石英試管中，加超純水定容至3.0 mL，放入石墨消解儀（超純水120 ℃硝化）；中途加0.5 mL H2O2以加快消解進(jìn)程，并根據(jù)反應(yīng)程度決定其添加次數(shù)（H2O2≥30%），直至液體清亮透明，無(wú)其他雜物，取出冷卻后加超純水定容至10.0 mL。靜置過(guò)夜，再用ICP-MS質(zhì)譜儀測(cè)定組織樣品的銅離子含量。

1. 4 抗氧化酶活性測(cè)定

按9∶1比例向各組織樣品（肝臟、腎臟、鰓和腸道）中加入PBS，組織勻漿后3000 r/min離心30 min，取上清液，然后測(cè)定各組織中的抗氧化酶活性。抗氧化酶活性測(cè)定步驟：①制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；②加樣：設(shè)置空白孔（不加樣品和酶標(biāo)試劑）、待測(cè)樣品孔（每孔先加40.0 μL樣品稀釋樣和10.0 μL待測(cè)樣品，混勻）；③溫育：蓋上封板膜，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)溫育30 min；④洗滌：揭掉封板膜，甩掉液體，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄除，反復(fù)5次，拍干；⑤加酶：每孔加50.0 μL酶標(biāo)試劑，空白孔除外；⑥再溫育：同③；⑦再洗滌（分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物）；⑧顯色：每孔先加顯色劑A 50.0 μL，再加顯色劑B 50.0 μL，混勻后溫育15 min；⑨終止：每孔加終止液50.0 μL（顏色由藍(lán)變黃）；⑩測(cè)定：用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值，要求在加入終止液后15 min內(nèi)完成測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同銅暴露濃度下羅非魚的生長(zhǎng)狀況

由表1可以看出，在不同銅暴露濃度養(yǎng)殖水體中，羅非魚的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)無(wú)顯著變化（P>0.05，下同），但各銅暴露處理組羅非魚的肝體比顯著高于CK組（P<0.05，下同），說(shuō)明水體中銅離子對(duì)羅非魚肝臟有顯著影響。

2. 2 銅離子在羅非魚各組織中的殘留量

在相同銅暴露濃度下，羅非魚各組織的銅富集能力排序?yàn)楦闻K>腸道>腎臟>鰓>肌肉。其中，銅離子在肝臟組織中的積累量最高，肌肉組織中的積累量最低。不同銅暴露濃度下，銅離子在羅非魚各組織中的殘留趨勢(shì)相似，但以銅暴露濃度為4.0 mg/L時(shí)最明顯（圖1），該濃度下除鰓和肌肉組織間的銅離子殘留量無(wú)顯著差異外，其他組織間的銅離子殘留量均存在顯著差異。

在相同的暴露時(shí)間下，各銅暴露處理組與CK組羅非魚肌肉組織中的銅離子積累量差異不顯著；而在其他組織中，各銅暴露處理組的銅離子積累量均顯著高于CK組（圖2）。

2. 3 銅離子對(duì)羅非魚各組織酶活性的影響

羅非魚暴露在銅離子水體中，其肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性均比CK組低（除6.0 mg/L），且以2.0 mg/L暴露濃度下的SOD活性最低，與CK組及6.0 mg/L組間存在顯著差異；腎臟SOD活性則以2.0 mg/L暴露濃度組最高，與CK組及1.0 mg/L暴露濃度組間存在顯著差異；而腸道和鰓組織的SOD活性變化規(guī)律不明顯（圖3）。

羅非魚暴露在銅離子水體中，其腎臟過(guò)氧化氫酶（CAT）活性最強(qiáng)，且以2.0 mg/L暴露濃度下的腎臟CAT活性最高，與CK組的差異顯著；肝臟CAT活性以6.0 mg/L暴露濃度組最高，顯著高于其他暴露濃度組及CK組；鰓組織CAT活性以6.0 mg/L暴露濃度組最低，顯著低于其他銅暴露濃度組；各處理組的腸道CAT活性差異不顯著（圖4）。

在羅非魚肝臟內(nèi)，隨著銅暴露濃度的升高，丙二醛（MDA）含量呈先降低后上升的變化趨勢(shì)，以4.0 mg/L暴露濃度下的肝臟MDA含量最低，與CK組及1.0、6.0 mg/L暴露濃度組差異顯著；而鰓組織中以4.0 mg/L暴露濃度組的MDA含量最高，顯著高于6.0 mg/L暴露濃度組；各處理組的腎臟和腸道MDA含量無(wú)顯著差異（圖5）。

3 討論

《中國(guó)漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)ρ（Cu2+）不能超過(guò)0.01 mg/L，但隨著工業(yè)的發(fā)展，水體環(huán)境中的銅離子濃度已超過(guò)該標(biāo)準(zhǔn)（劉勝玉等，2014；潘科等，2014）。水生動(dòng)物長(zhǎng)期生活在銅離子超標(biāo)的水體中，其正?；顒?dòng)會(huì)受到明顯影響。肝臟是機(jī)體攝食毒物后的主要解毒和排毒器官（高春生等，2008），當(dāng)其生活在銅暴露水體中，肝臟中就會(huì)積累高濃度的銅離子。肝體比在不同魚類及其不同健康狀況下會(huì)增大或減小，且已有研究表明肝體比和肝臟代謝呈正相關(guān)（Stephensen et al.，2000）。本研究結(jié)果表明，羅非魚在銅暴露水體環(huán)境下，其肝臟明顯變大，說(shuō)明肝臟代謝已受到嚴(yán)重影響。

不同魚類及同種魚類不同部位對(duì)重金屬的富集能力也不同，會(huì)隨暴露接觸時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，一般在40～50 d達(dá)到平衡（孟曉紅等，2000）。馬桂云等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，銅在鯽魚各組織內(nèi)的富集能力差異明顯，其中以內(nèi)臟的富集能力最強(qiáng)，而肌肉的富集能力最弱；李湘萍等（2011）研究表明，銅在對(duì)蝦肝胰腺中的積累最多，在肌肉中的積累最少；崔欣（2013）研究表明，魚體內(nèi)肝臟組織對(duì)銅離子的富集能力最強(qiáng)，而肌肉組織的富集能力最弱。本研究發(fā)現(xiàn)，銅離子在吉富羅非魚體內(nèi)的富集量依次為肝臟>腸道>腎臟>鰓>肌肉，與崔欣（2013）的研究結(jié)果一致。此外，隨著銅暴露濃度的升高，羅非魚各組織中累積的銅離子含量也隨著升高。

SOD是唯一直接以自由基為底物的抗氧化酶，能催化超氧化物陰離子自由基（ ）發(fā)生歧化反應(yīng)，從而消除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的 ，以減輕對(duì)細(xì)胞的損傷程度（Silvestre et al.，2006）。本研究結(jié)果顯示，羅非魚腎臟SOD活性先升高后降低，在2.0 mg/L暴露濃度下其活性最高；肝臟SOD活性隨銅暴露濃度升高呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，在2.0 mg/L暴露濃度下其活性最低。楊麗華等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，SOD清除 的能力與其含量及活性有關(guān)，當(dāng)受到輕度脅迫時(shí)SOD活性升高，但受到重度脅迫時(shí)SOD活性降低。本研究中，羅非魚腎臟的SOD活性變化規(guī)律與楊麗華等（2003）的研究結(jié)果一致，說(shuō)明銅暴露對(duì)腎臟組織已造成損害，導(dǎo)致SOD活性降低。

CAT的主要作用是將H2O2氧化成H2O和O2（劉冰，2007）。腎臟中因SOD結(jié)合自由基產(chǎn)生的H2O2最多，故CAT活性強(qiáng)度最強(qiáng)。錢曉薇（2005）研究發(fā)現(xiàn)，銅對(duì)黃鱔CAT活性有明顯的影響，且呈雙向性；王凡等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，水體銅暴露對(duì)牙鲆鰓的CAT和SOD活性均有低濃度誘導(dǎo)和高濃度抑制的作用；劉香江（2010）研究表明，矛尾復(fù)蝦虎魚肝臟的SOD和CAT活性隨著銅暴露濃度的升高而顯著降低。在本研究中，羅非魚腎臟CAT活性呈先升高再降低的變化趨勢(shì)，在2.0 mg/L暴露濃度下其活性最高。腎臟中CAT活性與SOD活性的變化趨勢(shì)基本一致，均隨水體中銅暴露濃度的增加呈先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)，表明進(jìn)入羅非魚體內(nèi)的銅離子產(chǎn)生大量自由基而未能及時(shí)被清除，最終發(fā)生氧化損傷。

自由基對(duì)魚體產(chǎn)生毒性是通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生MDA，生成的MDA與蛋白質(zhì)游離氨基產(chǎn)生作用，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害。已有研究表明，銅中毒會(huì)引起體內(nèi)MDA含量升高（Chandran et al.，2005）。本研究結(jié)果表明，腎臟中的MDA含量在一定銅暴露濃度下隨著濃度的升高而升高，但超過(guò)4.0 mg/L后反而降低；肝臟內(nèi)的MDA含量則相反，呈先降低后上升的變化趨勢(shì)，以4.0 mg/L暴露濃度下的肝臟MDA含量最低。MDA含量在腎臟中隨銅暴露濃度的升高而升高，而在肝臟中隨銅暴露濃度的升高而降低，可能與銅離子在這兩個(gè)組織內(nèi)累積程度不同有關(guān)，但具體原理有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

銅暴露能夠使其富集在羅非魚的不同組織中，其中以肝臟組織中的富集量最高，肌肉組織中的富集量較低，即對(duì)商品羅非魚主要食用部分影響不明顯。銅暴露對(duì)羅非魚的毒害作用主要表現(xiàn)為肝臟和腎臟受損、體內(nèi)代謝紊亂。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）