禾花鯉魚種暴發(fā)性死亡征病原菌的分離鑒定及藥敏試驗

龍?zhí)K 鄧小紅 梁靜真 牛志偉 韓書煜 范華龍 黃鈞

摘要：【目的】明確引起禾花鯉發(fā)生暴發(fā)性死亡征的病原菌及其耐藥性，為有效防控禾花鯉暴發(fā)性死亡征提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎贸Ｒ?guī)方法分離病原菌，以API 20NE生化鑒定與16S rRNA基因序列分析相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定，人工回歸感染試驗確定分離菌株的致病性，K-B紙片擴(kuò)散法測定病原菌對藥物的敏感性。【結(jié)果】從廣西全州縣患暴發(fā)性死亡征禾花鯉的肝臟中分離獲得1株優(yōu)勢菌株（TH5），API 20NE生化鑒定和16S rRNA基因序列分析結(jié)果顯示，分離菌株TH5為簡達(dá)氣單胞菌（Aeromonas jandaei），與簡達(dá)氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 49568（NR 119040）和CDC 0787-80（NR 037013）的相似度分別為99.9%和99.6%。人工回歸感染試驗結(jié)果表明，菌株TH5是導(dǎo)致禾花鯉暴發(fā)性死亡征的病原菌。該菌株對復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、多粘菌素B等11種藥物高度敏感，對青霉素G、復(fù)達(dá)欣、先鋒霉素VI等8種藥物已產(chǎn)生耐藥性?！窘Y(jié)論】引起廣西全州縣養(yǎng)殖禾花鯉暴發(fā)性死亡征的病原菌是簡達(dá)氣單胞菌，生產(chǎn)中可選用復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、多粘菌素B等藥物進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞： 禾花鯉；簡達(dá)氣單胞菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號： S965.116.42 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1241-06

0 引言

【研究意義】禾花鯉（Procypris merus）是鯉魚（Cyprinus carpio）的變種，原產(chǎn)于廣西北部，體短而肥，全身紫褐色，細(xì)葉鱗，皮薄，內(nèi)臟隱約可見，因其在稻田中被長期馴化養(yǎng)殖和攝食水稻禾花而得名。禾花鯉可食率高，高蛋白低脂肪，且富含多種人體必需氨基酸（楊四秀和蔣艾青，2009），是廣西全州縣重要的特色水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，也是桂林市十大名牌農(nóng)產(chǎn)品之一，廣受消費者青睞。近年來，禾花鯉稻田養(yǎng)殖規(guī)模越來越大，呈逐年增長趨勢，其養(yǎng)殖區(qū)域主要集中在桂北地區(qū)的灌陽縣、全州縣、興安縣和桂中地區(qū)的融安縣、三江縣等地，因此，確保禾花鯉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展對促進(jìn)地方農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及加速新農(nóng)村建設(shè)均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】細(xì)菌性疾病是鯉魚養(yǎng)殖過程中的常見病害，主要有嗜水氣單胞菌?。ㄍ鯘芍薜?，1997）、出血?。n英等，2005）、細(xì)菌性敗血癥（張玉芬等，2011）、豎鱗?。ㄓ谙瑁?011）、肺炎克雷伯氏菌?。ūR玉婷等，2014）和殺鮭氣單胞菌病（王海娟和王利，2015）等。此外，龔倩等（2010）從患病框鏡鯉中分離出致病性維氏氣單胞菌，溫貴蘭等（2012）從患病甌江彩鯉中分離出簡達(dá)氣單胞菌，韓娜娜等（2013）和沈曉靜等（2014）分別從患病錦鯉中分離出摩氏摩根氏菌病和熒光假單胞菌病。近年來，有關(guān)禾花鯉的研究主要集中在養(yǎng)殖模式探討，如莫玉軍（2003）、唐春（2004）和黃德文（2009）分別進(jìn)行了禾花鯉的稻田養(yǎng)殖、池塘養(yǎng)殖和池塘精養(yǎng)技術(shù)探索，但鮮見針對禾花鯉病害及其防治的研究報道?！颈狙芯壳腥朦c】2014年6月廣西全州縣某禾花鯉養(yǎng)殖示范基地的禾花鯉發(fā)生暴發(fā)性死亡，但因缺乏可供參考的防治措施及用藥依據(jù)，導(dǎo)致大量死亡，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。【擬解決的關(guān)鍵問題】對引起該養(yǎng)殖示范基地禾花鯉暴發(fā)性死亡征的病原菌進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行藥物敏感性試驗，旨在明確引起禾花鯉發(fā)生暴發(fā)性死亡征的病原菌及其耐藥性，為有效防控禾花鯉暴發(fā)性死亡征提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 病原菌分離與純化

病樣于2014年6月13日采自廣西全州縣某禾花鯉養(yǎng)殖示范基地，為發(fā)病瀕死的禾花鯉。病魚個體重10～15 g，主要癥狀為體表發(fā)紅，眼球突出，肛門發(fā)紅，腹部膨大。剖檢發(fā)現(xiàn)，病魚體腔內(nèi)有大量淡紅色腹水，腸道發(fā)紅，肝胰臟腫大。無菌條件下從病魚的肝臟、腎臟等器官取樣，分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和兔血瓊脂培養(yǎng)基（均購自鄭州安圖生物工程股份有限公司）上，36 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取菌落形態(tài)一致的優(yōu)勢菌株經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 細(xì)菌鑒定

1. 2. 1 生化鑒定 分離菌株的氧化酶試驗結(jié)果呈陽性，故選用法國梅里埃公司生產(chǎn)的API 20NE生化鑒定試劑條按說明進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。

1. 2. 2 分子鑒定 按劉杰等（2015）的方法收集菌體，提取細(xì)菌基因組DNA后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?6S rRNA基因擴(kuò)增采用由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的細(xì)菌通用引物，正、反向引物分別為fD1：（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和rp2（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應(yīng)體系25.0 μL：10×PCR緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，25 mmol/L MgC12 2.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U）0.3 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行29個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后以1.5%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，35 min）進(jìn)行鑒定，用凝膠成像系統(tǒng)觀察，并根據(jù)出現(xiàn)的電泳條帶記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物送至華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1. 3 分離菌株致病性測定

用于人工回歸感染試驗的禾花鯉購于普通市場，平均體重35.1 g。經(jīng)過20 d的暫養(yǎng)后隨機(jī)抽取5尾進(jìn)行剖檢觀察，并取其肝臟、脾臟、腎臟、腦組織進(jìn)行細(xì)菌接種，確認(rèn)魚體健康無病、無細(xì)菌感染后用于人工回歸感染。按常規(guī)方法將分離菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后以無菌生理鹽水洗下菌落并制成菌懸液，以WGZ-2-XJ細(xì)菌濁度儀調(diào)整菌懸液的細(xì)菌濃度。第1次感染試驗時將健康禾花鯉隨機(jī)分成試驗組和對照組，每組30尾，采取胸鰭基部注射感染，其中試驗組每尾注射0.2 mL菌懸液，對照組注射相同劑量的無菌生理鹽水。注射后，于同樣環(huán)境下按組分開飼養(yǎng)，連續(xù)觀察15 d，記錄受試魚的發(fā)病癥狀及死亡情況。取第1次感染試驗中發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似的瀕死個體，再進(jìn)行細(xì)菌分離與純化，按第1次人工感染試驗的方法進(jìn)行第2次人工感染試驗。

1. 4 藥敏試驗

試驗用藥敏片共28種，除氟苯尼考、磺胺二甲嘧啶、鹽酸沙拉沙星、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶和復(fù)方磺胺嘧啶6種由廣西水生動物病害診斷實驗室按于進(jìn)勛等（2000）的方法自行制備外，其余22種購自杭州天和微生物試劑有限公司。藥敏試驗采用K-B紙片擴(kuò)散法，其結(jié)果按美國NCCLS 2000的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2. 1 分離菌株的形態(tài)及培養(yǎng)特性

從發(fā)病瀕死禾花鯉的肝臟中分離獲得1株優(yōu)勢菌株，編號為TH5。該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，微溶血。菌落圓形，邊緣光滑，中央凸起，呈肉色、灰白色或略帶淡桃紅色光澤。菌體兩端鈍圓，多數(shù)單個排列，無芽孢，無莢膜。

2. 2 細(xì)菌鑒定結(jié)果

2. 2. 1 生化鑒定結(jié)果 根據(jù)API 20NE生化鑒定結(jié)果（表1），可確定菌株TH5的API陽性代碼值為7176755，

初步鑒定為簡達(dá)氣單胞菌（Aeromonas jandaei）。

2. 2. 2 分子鑒定結(jié)果 PCR擴(kuò)增得到分離菌株TH5的16S rRNA基因片段，大小為1410 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠回收提純后進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank中的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對，以Clustal X進(jìn)行多重序列比對分析，并用MEGA 6.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹和比對分析結(jié)果可知，分離菌株TH5（GenBank登錄號KU143916）與簡達(dá)氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 49568（NR 119040）和CDC 0787-80（NR 037013）同聚一簇，其相似度分別為99.9%和99.6%。

2. 3 分離菌株的人工回歸感染試驗結(jié)果

經(jīng)人工注射感染后，試驗組禾花鯉出現(xiàn)鰓絲末端溶解，體表發(fā)白且有大量黏液，腹部腫脹，肛門發(fā)紅，剖檢發(fā)現(xiàn)其肝臟腫大（部分病魚肝臟糜爛），體腔有腹水，膽囊腫大，脾臟腫大等癥狀。經(jīng)取樣接種，可分離獲得與菌株TH5一致的菌株。對照組禾花鯉攝食、活動基本正常，未出現(xiàn)死魚現(xiàn)象。由表2可以看出，菌株TH5對禾花鯉有較強(qiáng)的致病性，可引起禾花鯉大量死亡，兩次人工回歸感染試驗的平均死亡率達(dá)48.33%，表明分離菌株TH5是引起禾花鯉暴發(fā)性死亡征的病原菌。

2. 4 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果（表3）表明，菌株TH5對復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、多粘菌素B、左氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺二甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶和復(fù)方磺胺嘧啶高度敏感，對青霉素G、復(fù)達(dá)欣、先鋒霉素VI、菌必治、新霉素、新生霉素、先鋒必和鹽酸沙拉沙星已產(chǎn)生耐藥性。

3 討論

目前，關(guān)于鯉魚細(xì)菌性疾病已有大量報道，其病原菌主要有嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）（王澤洲等，1997；張玉芬等，2011）、溫和氣單胞菌（A. sobria）（韓英等，2005）、豚鼠氣單胞菌（A. caviae）（韓英等，2005）、維氏氣單胞菌（A. veronii）（龔倩等，2010）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）（于翔，2011；沈曉靜等，2014；周陽等，2015）、鯰愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）（于翔，2011）、摩氏摩根氏菌（Morganella morganii）（韓娜娜等，2013）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）（盧玉婷等，2014）和殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）（王海娟和王利，2015）等。本研究從患暴發(fā)性死亡征禾花鯉魚病樣中分離獲得的病原菌為簡達(dá)氣單胞菌，與溫貴蘭等（2012）從彩鯉中分離獲得的病原菌種類相同?？梢?，引起鯉魚病害的病原菌種類呈多樣性，除了淡水養(yǎng)殖中常見的嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌外，近年來又分離出多種新的病原菌，給禾花鯉細(xì)菌性疾病的診治帶來極大困難。

簡達(dá)氣單胞菌隸屬于氣單胞菌屬（Aeromonas），在《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（1984年版）中被稱為溫和氣單胞菌。Carnahan等于1991年確定了簡達(dá)氣單胞菌的分類地位。簡達(dá)氣單胞菌可引起人類腹瀉（王曉萍等，1997）和水牛猝死癥（方福明等，2008），近年來發(fā)現(xiàn)該菌在淡水魚養(yǎng)殖池塘中也有分布（王一娟，2010），可感染引起養(yǎng)殖魚類發(fā)病死亡（溫貴蘭等，2012；楊寧等，2015），表明簡達(dá)氣單胞菌是一種人—畜—魚共患的病原菌。本研究以×108 CFU/mL的簡達(dá)氣單胞菌懸液對健康禾花鯉進(jìn)行人工感染試驗，其平均致死率為48.33%，明顯低于該菌對羅非魚的致病力（楊寧等，2015）。另外，本研究中簡達(dá)氣單胞菌的溶血性與從甌江彩鯉中分離到的菌株（溫貴蘭等，2012）也不同。從禾花鯉和甌江彩鯉中分離獲得的簡達(dá)氣單胞菌在溶血性和致病力方面存在明顯差異，其是否與菌株所攜帶的毒力基因有關(guān)尚待進(jìn)一步探究。

本研究的藥敏試驗結(jié)果表明，菌株TH5對復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、多粘菌素B等11種藥物高度敏感，對青霉素G、復(fù)達(dá)欣、先鋒霉素VI等8種藥物已產(chǎn)生耐藥性。這與從甌江彩鯉中分離獲得的菌株HX201006-2（溫貴蘭等，2012）、羅非魚上分離獲得的菌株NL05（楊寧等，2015）均不相同，究其原因可能與不同養(yǎng)殖戶的用藥習(xí)慣有關(guān)。致病性嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌連續(xù)低濃度接觸某種藥物時可對該藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性（黃鈞等，2013；黃新財?shù)龋?013）。因此，在生產(chǎn)用藥過程中應(yīng)避免經(jīng)常使用同一類藥物，且要做到科學(xué)精準(zhǔn)用藥，避免因亂用和濫用藥物而導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性。

4 結(jié)論

引起廣西全州縣養(yǎng)殖禾花鯉暴發(fā)性死亡征的病原菌是簡達(dá)氣單胞菌，生產(chǎn)中可選用復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、多粘菌素B等藥物進(jìn)行防治。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）