三黃雞MAVS基因克隆及生物信息學分析

曹艷杰 何怡寧 王海勇 唐寧 張麗華 韋平 韋天超 磨美蘭

摘要：【目的】掌握三黃雞線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）基因的生物信息學，為MAVS基因誘導表達及禽類固有免疫相關機制研究打下基礎?！痉椒ā扛鶕礼enBank中已公布的原雞MAVS基因序列設計1對特異性引物，采用RT-PCR擴增三黃雞MAVS基因，并應用相關生物軟件進行序列分析及其蛋白結構預測?！窘Y果】三黃雞MAVS基因編碼區(qū)（CDS）全長1926 bp，編碼641個氨基酸，與GenBank中已發(fā)表的原雞MAVS氨基酸序列（NP_001012911.1）比對，三黃雞MAVS氨基酸序列在第440、488、506和606位存在4個氨基酸差異，分別為440A→T、488P→L、506I→L和606E→K。三黃雞MAVS基因與原雞的相似性最高，達99.0%；與日本鵪鶉的相似性次之，為91.0%；與斑馬魚的相似性最低，僅37.6%。三黃雞MAVS蛋白分子質量為67.79 ku，理論等電點（pI）為5.04，屬于跨膜蛋白，無信號肽序列；其二級結構中折疊占0.5%，無規(guī)則卷曲占88.7%，螺旋占10.8%。【結論】三黃雞MAVS基因序列表現出高度的保守性，可作為今后研究三黃雞抗病毒機制的重要指標之一。

關鍵詞： 三黃雞；MAVS基因；克?。簧镄畔W；相似性

中圖分類號： S831.89 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1216-06

0 引言

【研究意義】線粒體抗病毒信號蛋白（Mitochondrial anti-viral signaling protein，MAVS）是一種在宿主固有免疫信號通路中扮演重要角色的接頭蛋白（Seth et al.，2005）。當宿主受RNA病毒感染，RNA解螺旋酶（RIG-I和MDA5）識別病毒衍生RNA配體后發(fā)生構象改變（Kowalinski et al.，2011），N端Caspase招募結構域（Amino-terminalcaspase recruitment domain，CARD）暴露出來，RIG-I/MDA5轉移至線粒體外膜，并與MAVS的CARD相互作用，進而刺激下游的TBK1和IKK復合體分別活化NF-κB和IRF3固有免疫相關信號通路，誘導干擾素表達，最終參與抗病毒反應（楊星星等，2013）。因此，研究MAVS基因的生物信息學對其誘導表達及多克隆抗體的制備具有重要指導意義。【前人研究進展】MAVS也稱為IPS-1（IFN-β promoter stimulator）（Kawai et al.，2005）、Cardif（CARD adaptor inducing IFN-β）（Meylan et al.，2005）或VISA（Virus- induced signaling protein）（Xu et al.，2005），是2005年在RIG-I/MDA5下游發(fā)現的一個適配器分子。賈永俠等（2008）構建了人類MAVS的小干擾RNA真核表達質粒，并篩選出穩(wěn)定干擾MAVS的細胞株。朱方?。?010）通過探究線粒體MAVS基因在馬立克氏病毒感染應答過程中的差異表達情況，證實MAVS基因表達在抗馬立克氏病毒過程中發(fā)揮重要作用，印證了MAVS基因參與抗病毒通路并發(fā)揮重要作用的假說。管楷（2011）研究發(fā)現，MAVS通過與VDAC1直接相互作用而增強后者穩(wěn)定性，提高其表達水平，進而誘導細胞凋亡。宋婷（2012）研究發(fā)現，MAVS通過腫瘤壞死因子受體作用因子3（TRAF3）上調ASC的蛋白穩(wěn)定性，促進其介導的IL-1產生。周維（2015）研究表明，青魚MAVS是一種線粒體蛋白，在鰓、腎臟、心臟、腸、肝臟、肌肉、皮膚和脾臟等組織中均呈穩(wěn)定表達，在受病毒侵染后則作為病毒感應器RIG-1的適配器發(fā)揮作用。此外，MAVS敲除小鼠試驗（Kumar et al.，2006；Sun et al.，2006）與半胱天冬酶降解MAVS試驗（Yu et al.，2010）均表明缺失MAVS會影響I型干擾素和炎性細胞因子的產生?？梢姡琈AVS在抗病毒固有免疫中發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】廣西是三黃雞養(yǎng)殖規(guī)模較大的地區(qū)之一，近年來因禽流感、新城疫等重大疫病的威脅，其產業(yè)發(fā)展面臨巨大挑戰(zhàn)（韋平等，2013），因此，在做好疫病防控工作的同時要加強禽類固有免疫相關機制的研究，促進其產業(yè)健康發(fā)展。【擬解決的關鍵問題】對三黃雞MAVS基因編碼區(qū)（CDS）進行克隆，分析三黃雞MAVS基因的遺傳變異情況，并預測其編碼氨基酸序列的親/疏水性、二級結構、跨膜區(qū)與信號肽，以期為三黃雞MAVS基因的誘導表達及禽類固有免疫相關機制研究打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

三黃雞由廣西富鳳農牧有限公司提供。PrimeSTAR Max Premix（2×）、限制性內切酶EcoR I與Xho I、逆轉錄試劑盒和pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1. 2 引物設計與合成

參照NCBI上的原雞MAVS基因序列（NM_0010 12893.1），利用Primer 6.0和Oligo 7設計1對特異性引物。上游引物（F）：5'-TTGGAATTCATGGGTTTCGCC GAGGACAAAGTGTAT-3'（下劃線部分為EcoR I酶切位點）；下游引物（R）：5'-CCGCTCGAGTCTATTTCTG

CAATCGTGTGTACACCAG-3'（下劃線部分為Xho I酶切位點）。引物由廣州華大基因有限公司合成。

1. 3 總RNA提取與反轉錄

采集新鮮抗凝血樣5 mL，以外周血淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞后，參照總RNA抽提試劑盒說明提取外周血淋巴細胞總RNA，并按反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄。

1. 4 PCR擴增

PCR反應體系：PrimeSTAR Max Premix（2×）25.0 μL，上、下游引物（25 pmol/L）各1.0 μL，模板cDNA 2.0 μL，純化水21.0 μL。擴增程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并回收純化目的條帶。

1. 5 重組質粒構建與鑒定

將純化目的片段連接至pMD18-T載體，再轉化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選挑取明顯白色單菌落，接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中（1 mL），增菌培養(yǎng)后，提取重組質粒進行雙酶切鑒定和PCR鑒定。選取3個陽性樣品送至廣州華大基因有限公司測序。

1. 6 三黃雞MAVS基因序列分析及其蛋白結構預測

以在線Expasy軟件（http：//web.expasy.org/protpa）對三黃雞MAVS基因進行基本理化性質預測；以MegAlign軟件分析三黃雞MAVS基因序列的遺傳演化關系；以ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件進行三黃雞MAVS蛋白親/疏水性預測，同時分別應用蛋白質結構預測服務器PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）、TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs. dtu.dk/services/TM-HMM/）和SignalP 4.1 Server軟件（http：//www.cbs.dtu. Dk/servces/SignalP/）對其二級結構、跨膜區(qū)和信號肽進行分析。

2 結果與分析

2. 1 RT-PCR擴增結果

以三黃雞外周血淋巴細胞總RNA為模板進行RT-PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果表明，三黃雞MAVS基因CDS全長約2000 bp，與預期結果一致（圖1）。

2. 2 重組質粒的鑒定結果

抽提重組質粒進行EcoR I與Xho I雙酶切鑒定，結果獲得兩條片段，一條為2692 bp的克隆載體片段，另一條為1926 bp的目的片段，與預期結果相符；重組質粒的PCR鑒定結果亦顯示，可獲得一條1926 bp的目的片段，與預期結果一致（圖2）。表明三黃雞MAVS基因重組質粒構建成功。

2. 3 三黃雞MAVS基因序列的測定分析結果

三黃雞MAVS基因CDS全長1926 bp，編碼641個氨基酸。與原雞MAVS基因序列（NM_001012893.1）的核苷酸相似性高達99.0%。用DNAMAN軟件將三黃雞MAVS氨基酸序列與GenBank中已發(fā)表的原雞MAVS氨基酸序列（NP_001012911.1）進行比對，結果發(fā)現在第440、488、506和606位存在4個氨基酸差異，分別為

440A→T、488P→L、506I→L和606E→K（圖3）。

2. 4 三黃雞MAVS基因序列的同源性及遺傳演化關系分析結果

將克隆獲得的三黃雞MAVS基因與GenBank中已公布的9個其他物種MAVS基因序列進行核苷酸相似性比對分析，結果顯示，三黃雞MAVS基因與原雞的相似性最高，達99.0%；與日本鵪鶉的相似性次之，為91.0%；與斑馬魚的相似性最低，僅37.6%?；贛AVS基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果發(fā)現，三黃雞與日本鵪鶉、火雞、綠頭鴨等禽類匯聚成一個分支，其中與日本鵪鶉的親緣關系最近；哺乳動物形成一個與三黃雞遺傳距離較近的分支；而斑馬魚與三黃雞的遺傳距離最遠（圖4）。

2. 5 三黃雞MAVS基因理化性質的分析結果

通過Expasy在線軟件對三黃雞MAVS基因進行理化性質分析，結果顯示，該基因編碼641個氨基酸，相對分子質量為67.79 ku，推導的理論等電點（pI）為5.04；對應蛋白的分子式為C2930H4586N838O977S19，原子個數為9350；氨基酸組成中，正電荷氨基酸殘基總數78個，負電荷氨基酸殘基總數48個；蛋白不穩(wěn)定系數為57.96，提示該蛋白可能為不穩(wěn)定蛋白；脂溶性指數為65.34，總平均親水性值（GRAVY）為-0.548，即具有較好的親水性。

2. 6 三黃雞MAVS蛋白親/疏水性預測結果

利用ProtScale預測三黃雞MAVS蛋白的親/疏水性，結果顯示，三黃雞MAVS蛋白在630處附近氨基酸殘基疏水性較強，峰值約為3.2，在280處附近氨基酸殘基的親水性最強，峰值約為3.1（圖5）。

2. 7 三黃雞MAVS蛋白跨膜區(qū)、二級結構及信號肽預測結果

應用TMHMM Server 2.0對三黃雞MAVS氨基酸序列進行跨膜區(qū)分析，結果顯示，該蛋白由胞外區(qū)（1～616位氨基酸）、跨膜區(qū)（617～636位氨基酸）和胞內區(qū)（637～641位氨基酸）3部分組成，表明三黃雞MAVS蛋白絕大部分位于胞內區(qū)，且僅有一個跨膜結構域（圖6）。將推測的三黃雞MAVS氨基酸序列輸入到蛋白質結構預測服務器PSIPRED中，對其二級結構進行預測，結果顯示，MAVS肽鏈中折疊占0.5%，無規(guī)則卷曲占88.7%，螺旋占10.8%，其中無規(guī)則卷曲在肽鏈中間部位占據絕大部分位置，螺旋主要出現在肽鏈兩端且N端相對較多，折疊僅在N端出現一處（圖7）。用SignalP 4.1 Server軟件預測其信號肽，結果發(fā)現三黃雞MAVS蛋白無信號肽（圖8）。

3 討論

廣西三黃雞飼養(yǎng)歷史悠久，在自然選擇和長期馴化中，已成為極具特色的優(yōu)質三黃雞品種。廣西玉林三黃雞飼養(yǎng)量最多，是我國最大的三黃雞養(yǎng)殖基地，但各種疾病的威脅給其養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失（戴騰飛和周貞兵，2010）。MAVS蛋白與固有免疫機制密切相關，已受到許多學者的關注，但目前關于三黃雞MAVS基因的研究鮮見報道。為此，本研究首次對三黃雞MAVS基因遺傳變異情況及其蛋白理化性質、二級結構、親/疏水性和信號肽進行預測分析，以期為下一步研究MAVS基因誘導表達與三黃雞的免疫相關機制打下基礎。

宿主細胞依賴固有免疫系統(tǒng)識別入侵的病原微生物，經相關細胞信號轉導通路，激活干擾素和炎性細胞因子的表達，進而清除入侵的病原微生物（孟春花等，2016）。在固有免疫應答途徑中，MAVS是調節(jié)I型干擾素產生的關鍵因子。在先天免疫相關的蛋白質中，MAVS是第一個被發(fā)現定位在線粒體上，意味著線粒體參與了抗病毒的固有免疫應答（Scott，2010）。MAVS在固有免疫反應中發(fā)揮樞紐作用，是RIG-I信號通路中的唯一接頭分子，通過與RIG-I的CARD結構域結合后，可激活NF-κB和IRF-3通路，進一步激活干擾素的表達（Sun et al.，2006）。本研究結果表明，三黃雞MAVS蛋白無信號肽，不是分泌蛋白，即信號肽與蛋白的細胞內定位有關。MAVS定位在線粒體外膜和過氧化物酶體上，在細胞內的不同定位決定其在抗病毒固有免疫中的不同調節(jié)機制。只有在過氧化物酶體和線粒體上同時定位，MAVS才可誘導干擾素刺激基因快速且穩(wěn)定表達（Seth et al.，2005；楊星星等，2013）。本研究應用TMHMM Server 2.0對三黃雞MAVS氨基酸序列進行跨膜區(qū)分析，結果發(fā)現三黃雞MAVS為一次跨膜蛋白，跨膜區(qū)位于肽鏈C端，與哺乳動物的MAVS相似（Seth et al.，2005），也暗示禽類和哺乳動物的MAVS具有較高的保守性。MAVS可通過模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）調節(jié)TLR信號通路，主要是TLR3通路（Xu et al.，2005）。干擾素基因刺激蛋白（Stimulator of interferon genes，STING）能與MAVS相互作用，從而激活NF-κB和IRF-3通路（Ishikawa and Barber，2008）。TLR3與STING是TLR信號通路和RIG-1信號通路的重要分子，MAVS能與二者相互作用，說明其在機體固有免疫信號通路中扮演著關鍵角色。

4 結論

三黃雞MAVS基因CDS全長1926 bp，編碼641個氨基酸，與原雞的親緣關系最近，相似性達99.0%，與日本鵪鶉的相似性次之，達91.0%。可見，三黃雞MAVS基因序列表現出高度的保守性，可作為今后研究三黃雞抗病毒機制的重要指標之一。

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（責任編輯 蘭宗寶）