響應(yīng)面法優(yōu)化近江牡蠣多糖提取工藝

牛改改 游剛 張晨曉 余振寧

摘要：【目的】優(yōu)化近江牡蠣多糖提取工藝，為不同海域牡蠣多糖含量對比及其結(jié)構(gòu)分析打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳越迪牉樵?，通過單因素試驗考察液料比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)4個因素對其多糖提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上選取液料比、提取時間及提取溫度3個因素為變量，近江牡蠣多糖提取率為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法建立回歸模型，以優(yōu)化近江牡蠣多糖提取工藝條件?！窘Y(jié)果】通過響應(yīng)面法建立近江牡蠣多糖提取率（Y）與液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）的二次多項式數(shù)學(xué)模型為：Y=9.65-0.18A-0.071B+0.080C-0.27AB-0.24AC-0.52BC-2.6A2-1.34B2-1.35C2，該模型擬合度好；最佳提取工藝條件為：液料比90∶1、提取溫度90 ℃、提取時間3 h、提取次數(shù)1次，在此條件下的近江牡蠣多糖提取率為9.72%，與預(yù)測值（9.66%）相對偏差為0.62%?！窘Y(jié)論】采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化近江牡蠣多糖提取工藝具有可行性，可用于實際生產(chǎn)，以提高多糖提取率。

關(guān)鍵詞： 近江牡蠣；多糖；響應(yīng)面分析；提取工藝優(yōu)化

中圖分類號： R284.2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-0994-07

0 引言

【研究意義】牡蠣（Ostrea gigas thunberg）是分布于溫帶和熱帶海域的雙殼類海洋軟體動物（王俊等，2006）。近江牡蠣（Ostrea rivularis Gould）是牡蠣中的一種，其肉質(zhì)細膩，氣味芬芳，富含微量元素、蛋白質(zhì)、?；撬?、多糖等多種營養(yǎng)成分（張聰?shù)龋?009；吉宏武等，2010；田振華等，2013），具有降血脂、促進新陳代謝、改善高血糖癥狀、提高免疫力等功效，對抗癌和防止癌細胞擴散也有一定效果（張艷軍等，2012；Yang et al.，2013）。其中，牡蠣多糖具有增強機體細胞免疫和體液免疫功能、抗白細胞下降、抗腫瘤、抗血栓、降血脂等藥用價值（蔣楊，2013）。廣西北部灣沿海天然近江牡蠣資源豐富，主要分布于茅尾海海域附近（李翠等，2013；鐘方杰等，2014）。因此，充分利用地理優(yōu)勢，研究近江牡蠣多糖提取工藝，對其藥用開發(fā)與利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內(nèi)外已有不少學(xué)者對牡蠣多糖的提取工藝進行研究。張艷軍等（2012）采用正交試驗對茅尾海海域近江牡蠣多糖提取工藝進行優(yōu)化，確定水提取多糖的工藝參數(shù)為：pH 6、提取時間5 h、提取次數(shù)3次、水浴溫度75 ℃，在此條件下多糖提取率為2.56%。張碩和張崇禧（2012）采用星點設(shè)計—響應(yīng)面法優(yōu)化山東威海牡蠣多糖的提取工藝條件，在料液比1∶80、水浴溫度81 ℃的條件下提取2.9 h，得到多糖提取率為8.45%。田振華等（2013）采用正交試驗優(yōu)化得到牡蠣多糖提取條件為：pH 8.0、溫度65 ℃、時間4 h、次數(shù)3次、料液比1∶15，在此條件下的多糖提取率為2.71%。Cai等（2014）采用超聲波輔助酶解法提取巨牡蠣多糖，并通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化多糖提取工藝，得到多糖提取率為7.03%。【本研究切入點】響應(yīng)面法是一種合理的試驗設(shè)計方案，可通過建立多元二次回歸數(shù)學(xué)模型，實現(xiàn)提取工藝參數(shù)優(yōu)化并預(yù)測響應(yīng)值的目的（李璐等，2014；任雪峰等，2014）。目前，利用響應(yīng)面法優(yōu)化近江牡蠣多糖提取工藝，并提高多糖提取率的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以近江牡蠣為原料，考察提取溫度、提取時間、液料比、提取次數(shù)對近江牡蠣多糖提取率的影響，利用Box-Benhnken響應(yīng)面法對相關(guān)參數(shù)進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝，以提高近江牡蠣多糖提取率，為不同海域牡蠣多糖含量對比及其結(jié)構(gòu)分析打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

新鮮近江牡蠣采自廣西北部灣茅尾海海域。葡萄糖、98%硫酸、無水乙醇、苯酚、乙醚、丙酮等試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。pH 7.2磷酸緩沖液：取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液50 mL與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液35 mL，加新沸過的冷水稀釋至200 mL，搖勻即得。主要儀器設(shè)備：DS-1高速組織搗碎機（上海標(biāo)本模型廠）、FA1004電子分析天平（上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司）、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱101-3A（紹興市滬越科學(xué)實驗儀器廠）、LD4-2A離心機（上海梅香儀器有限公司）、DF-1型集熱式磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）、HHS-1型電熱恒溫水浴鍋（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）、TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1. 2 近江牡蠣粗多糖制備

稱一定量去殼的新鮮近江牡蠣，勻漿后用等量的丙酮和無水乙醇溶液分別浸泡12和4 h，濾除有機相后加入pH 7.2磷酸緩沖液，水浴提取，過濾后離心，取上清液濃縮，用3倍體積的95%乙醇醇沉24 h，離心后取沉淀冷凍干燥，所得干粉即為近江牡蠣粗多糖，放入干燥器中備用。

1. 3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考劉軍海等（2009）的方法，準(zhǔn)確稱取20 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于500 mL容量瓶中定容，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL置于錐形瓶中，以蒸餾水補足至10.0 mL，加入5.0 mL濃硫酸和1.0 mL 80%苯酚溶液，搖勻，冷卻至室溫后放置20 min，于490 nm處測吸光值。另以10.0 mL水溶液作空白對照。以葡萄糖用量為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 4 近江牡蠣多糖含量測定

參考陳麗等（2012）的方法，取一定量近江牡蠣干粉，在一定液料比、提取溫度、提取時間的條件下提取多糖，采用苯酚—硫酸法測定吸光值后，再根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算近江牡蠣多糖提取率。

多糖提取率（%）=X×（M/m）/A×10-6×100

式中，X為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的多糖溶液中多糖質(zhì)量（μg）；M為近江牡蠣樣品制成的近江牡蠣干粉質(zhì)量（g）；m為提取時取用的近江牡蠣干粉質(zhì)量（g）；A為去殼近江牡蠣樣品質(zhì)量（g）。

1. 5 單因素試驗設(shè)計

1. 5. 1 液料比對近江牡蠣多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1 g近江牡蠣醇沉多糖干粉5份，以水為提取溶劑，在提取溫度80 ℃、提取時間2 h的條件下，研究不同液料比（60∶1、70∶1、80∶1、90∶1和100∶1）對近江牡蠣多糖提取率的影響。

1. 5. 2 提取時間對近江牡蠣多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1 g近江牡蠣醇沉多糖干粉5份，以水為提取溶劑，在液料比80∶1、80 ℃條件下分別水浴提取1、2、3、4和5 h，離心，取上清液，測定近江牡蠣多糖含量，研究不同提取時間對近江牡蠣多糖提取率的影響。

1. 5. 3 提取溫度對近江牡蠣多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1 g近江牡蠣醇沉多糖干粉5份，以水為提取溶劑，液料比80∶1，分別在60、70、80、90和100 ℃下水浴提取2 h，離心，取上清液，測定近江牡蠣多糖含量，研究不同提取溫度對近江牡蠣多糖提取率的影響。

1. 5. 4 提取次數(shù)對近江牡蠣多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1 g近江牡蠣醇沉多糖干粉5份，以水為提取溶劑，在液料比80∶1、90 ℃的條件下提取3 h，重復(fù)上述操作，分別提取1、2和3次，研究不同提取次數(shù)對近江牡蠣多糖提取率的影響。

1. 6 響應(yīng)面分析法試驗設(shè)計

以單因素試驗為依據(jù)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理（張凱淵等，2006），選取對近江牡蠣多糖提取率有較大影響的液料比、提取時間、提取溫度3個因素，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗方案，以優(yōu)化近江牡蠣多糖提取工藝。響應(yīng)面因素與水平見表1。

1. 7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Duncans多重比較進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚—硫酸比色法測定不同質(zhì)量濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，以吸光值對葡萄糖用量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），并進行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.00025x+

0.00518（R2=0.99932），該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2. 2 單因素試驗結(jié)果

2. 2. 1 液料比對近江牡蠣多糖提取率的影響 由圖2可知，液料比為60∶1～90∶1時，隨著液料比的增大，近江牡蠣多糖提取率逐漸升高，且增加速率較快；液料比超過90∶1后，多糖提取率增加緩慢，于100∶1時達最大值。液料比過高，會使溶出性雜質(zhì)增多，競爭性抑制多糖溶解，且液料比為100∶1時的多糖提取率與液料比90∶1的多糖提取率相差小，考慮到節(jié)約成本，故選擇90∶1為最佳液料比。

2. 2. 2 提取時間對近江牡蠣多糖提取率的影響 由圖3可知，近江牡蠣多糖提取率隨提取時間的延長先升高后降低，當(dāng)提取時間為3 h時，多糖提取率達最大值，之后牡蠣多糖提取率隨提取時間的延長反而下降。提取時間過短，近江牡蠣多糖未充分溶出；提取時間過長，會使其他可溶性雜質(zhì)溶出，抑制多糖的溶解，綜合考慮節(jié)約時間與成本，選擇3 h為最佳提取時間。

2. 2. 3 提取溫度對近江牡蠣多糖提取率的影響 由圖4可知，近江牡蠣多糖提取率隨提取溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢，當(dāng)提取溫度升至90 ℃時，多糖提取率達最大值，之后多糖提取率隨著提取溫度的繼續(xù)升高而快速降低。這可能是由于提取溫度升高，使得細胞組織軟化，細胞壁破壞，多糖溶出速度加快；但提取溫度過高，會引起部分多糖分解，近江牡蠣中蛋白質(zhì)等物質(zhì)變性，增加多糖溶出的阻力，從而導(dǎo)致多糖提取率降低。因此，選擇90 ℃為最佳提取溫度。

2. 2. 4 提取次數(shù)對近江牡蠣多糖提取率的影響 由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，近江牡蠣多糖提取率由8.71%增至9.21%。近江牡蠣樣品提取1次的多糖提取率占提取3次多糖提取率的94.79%，且提取2次僅比提取1次得到的多糖提取率增加2.75%，提取3次比提取2次得到的多糖提取率增加2.68%，提取率增加不明顯。提取次數(shù)的增加雖能提高多糖提取率，但提高幅度過小，綜合考慮到節(jié)省時間與提高提取效率，在近江牡蠣多糖提取過程中，提取1次即可。

2. 2. 5 各因素與多糖提取率的方差分析 利用SPSS 19.0對不同提取條件的近江牡蠣多糖提取率進行方差分析，結(jié)果如表2所示。由表2可知，提取溫度、提取時間、液料比及提取次數(shù)對近江牡蠣多糖提取率均有極顯著影響（P<0.01，下同），但提取次數(shù)的影響相對較小。

2. 3 模型方程的建立與顯著性分析

采用Design-Expert 8.0.6對響應(yīng)面試驗結(jié)果（表3）進行回歸擬合，得到以近江牡蠣多糖提取率為響應(yīng)值（Y），以液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）為因素變量的二次多項回歸方程：Y=9.65-0.18A-0.071B+

0.080C-0.27AB-0.24AC-0.52BC-2.6A2-1.34B2-1.35C2。

回歸方程中各變量對近江牡蠣多糖提取率影響的顯著性經(jīng)方差分析，結(jié)果如表4所示。由表4可知，回歸模型P<0.01極顯著，失擬項P>0.05不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=50.20/50.35=0.997，表明該模型具有極顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，誤差較小，擬合度好，適用于近江牡蠣多糖提取工藝的優(yōu)化。方程中的AB、BC、A2、B2、C2對近江牡蠣多糖提取率影響極顯著，A和AC影響顯著（P<0.05，下同），B和C影響不顯著（P>0.05）；表明各因素對結(jié)果的影響并非簡單的線性關(guān)系，二次項與交互項均對結(jié)果影響較大。P越小則相應(yīng)變量對結(jié)果影響的顯著性越高，因此，影響近江牡蠣多糖提取率的顯著性順序為：液料比>提取溫度>提取時間。

2. 4 因素間交互作用分析

在3D響應(yīng)面圖中，響應(yīng)值隨著因素的增加變化越大，即斜面的傾斜度越大，說明該因素對響應(yīng)值的影響越顯著；在等高線中，兩兩因素構(gòu)成的等高線越像橢圓形，說明這兩種因素對響應(yīng)值有交叉影響。由圖6～8可知，兩兩因素間的等高線圖均為橢圓形，說明不同因素間對近江牡蠣多糖提取率均有交叉影響。從圖6可以看出，隨著提取時間的延長和液料比的增大，近江牡蠣多糖提取率呈先上升后下降的變化趨勢，但多糖提取率沿液料比方向增加速率較大，沿提取時間方向增加速率較小，說明近江牡蠣多糖提取率受液料比的影響較顯著；從圖7可以看出，隨著液料比的增大和提取溫度的升高，近江牡蠣多糖提取率也呈先上升后下降的變化趨勢，但多糖提取率沿液料比方向的變幅明顯大于提取溫度方向，說明液料比對近江牡蠣多糖提取率的影響比提取溫度顯著；從圖8可以看出，近江牡蠣多糖提取率隨著提取溫度的升高和提取時間的延長，也呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，但多糖提取率沿提取溫度方向的增幅較大，而沿提取時間方向的增幅相對較小，說明提取溫度對近江牡蠣多糖提取率影響比提取時間顯著。

2. 5 最佳提取工藝的驗證試驗結(jié)果

由Design-Expert 8.0.6分析得到的近江牡蠣多糖最佳提取工藝為：液料比90∶1、提取溫度90 ℃、提取時間3 h、提取次數(shù)1次，預(yù)測多糖提取率為9.66%。經(jīng)驗證試驗，最佳提取工藝條件下的多糖提取率為9.72%，與預(yù)測值相對偏差為0.62%，說明該模型具有一定的適用性，采用響應(yīng)面法優(yōu)化近江牡蠣多糖提取工藝具有可行性。

3 討論

目前提取多糖常用的方法有溶劑浸提法、酶提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等。其中，溶劑浸提法是最傳統(tǒng)的提取方法，雖然提取時間較長，但具有工藝簡單、便于企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。本研究以水為提取溶劑，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化近江牡蠣多糖的提取工藝，得到最佳的提取工藝條件為：液料比90∶1、提取溫度90 ℃、提取時間3 h，經(jīng)驗證得到近江牡蠣多糖提取率為9.72%，與理論預(yù)測值9.66%基本一致，較張艷軍等（2012）、田振華等（2013）采用正交試驗優(yōu)化提取工藝得到的牡蠣多糖提取率高。在實際生產(chǎn)中，若采用本研究優(yōu)化的近江牡蠣多糖提取工藝參數(shù)，可極大提高生產(chǎn)率。

響應(yīng)面法不僅能確保理論預(yù)測值與試驗實際值偏差小，還可分析各影響因素之間的交互作用。本研究結(jié)果表明，液料比與提取時間、提取時間與提取溫度的交互作用對近江牡蠣多糖提取率有極顯著影響，液料比、液料比與提取溫度的交互作用對近江牡蠣多糖提取率有顯著影響，與張碩和張崇禧（2012）的研究結(jié)果不完全一致，可能與試驗材料分布在不同海域有關(guān)。

孔祥會等（2008）的研究結(jié)果表明，鋸緣青蟹中可溶性多糖含量隨季節(jié)的不同而發(fā)生變化。本研究采用的原料為北部灣茅尾海海域的近江牡蠣，其環(huán)境條件也是動態(tài)變化，下一步將對可能影響牡蠣多糖含量變化的因素（海域、季節(jié)、貯藏階段）進行研究，以期為牡蠣多糖的開發(fā)利用提供更多科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化近江牡蠣多糖提取工藝，得到最佳工藝條件為：液料比90∶1、提取溫度90 ℃、提取時間3 h、提取次數(shù)1次，在此條件下的近江牡蠣多糖提取率為9.72%，與預(yù)測值（9.66%）相對偏差為0.62%。表明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化近江牡蠣多糖提取工藝具有可行性，可用于實際生產(chǎn)，以提高多糖提取率。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）