酶解章魚(yú)下腳料的產(chǎn)物分析

黃惠莉, 張爽， 張育榮， 張鷺鷹， 王開(kāi)明

(1. 華僑大學(xué) 化工學(xué)院, 福建 廈門 361021;2. 華僑大學(xué) 環(huán)境與資源技術(shù)研究所, 福建 廈門 361021；3. 廈門東海洋水產(chǎn)品進(jìn)出口有限公司, 福建 廈門 361012)

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酶解章魚(yú)下腳料的產(chǎn)物分析

黃惠莉1,2, 張爽1， 張育榮3， 張鷺鷹3， 王開(kāi)明3

(1. 華僑大學(xué) 化工學(xué)院, 福建 廈門 361021;2. 華僑大學(xué) 環(huán)境與資源技術(shù)研究所, 福建 廈門 361021；3. 廈門東海洋水產(chǎn)品進(jìn)出口有限公司, 福建 廈門 361012)

摘要：為了提高下腳料的綜合利用率，用4種商業(yè)蛋白酶對(duì)章魚(yú)下腳料進(jìn)行水解，并初步分析檢測(cè)產(chǎn)物中的氨基酸和抗氧化多肽.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：動(dòng)物蛋白酶水解液中的復(fù)合氨基酸獲取率占總氨基酸的57.12%，達(dá)到57.12%；而4種蛋白酶水解產(chǎn)物中肽類物質(zhì)的·OH清除力IC50均小于1.28 mg·mL-1，F(xiàn)e2+螯合力IC50均小于2.82 mg·mL-1，還原力隨多肽質(zhì)量濃度增加而提升；這種工藝條件和方法可以同時(shí)獲取兩類活性物質(zhì)(復(fù)合氨基酸、抗氧化性多肽)，為章魚(yú)下腳料資源的最大化利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

關(guān)鍵詞：章魚(yú); 下腳料； 蛋白酶水解； 復(fù)合氨基酸； 抗氧化多肽

生物活性氨基酸和多肽在人體新陳代謝的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著十分重要的作用，可以作為改善人類健康和預(yù)防疾病的功能性食品、保健品和藥品[1].游離氨基酸關(guān)系到或構(gòu)建成進(jìn)行生理活動(dòng)的蛋白質(zhì)，同時(shí)也是激素和含氮堿基的前體[2].另外，食物中的必需氨基酸很好地維持機(jī)體的健康[3].從海洋生物蛋白質(zhì)中獲取的天然活性多肽，與活性蛋白質(zhì)相比更易被人體吸收，而與氨基酸相比又保持著多種多樣的功能性特征[4].Raghavan等[5]利用風(fēng)味酶水解羅非魚(yú)蛋白質(zhì)，獲得血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性肽.Anusha等[6]發(fā)現(xiàn)鱈魚(yú)可以在體內(nèi)自我水解，得到具有抗氧化活性的片段.許多商業(yè)蛋白酶已被用來(lái)獲取海洋水產(chǎn)品中的氨基酸和活性肽[7]，但對(duì)章魚(yú)下腳料的水解液研究較少.本文利用4種常見(jiàn)商業(yè)蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶A5)，酶解章魚(yú)下腳料中蛋白質(zhì)，對(duì)氨基酸和粗肽液分析，判斷獲取率和性能，為廢物的利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1材料與方法

1.1材料與試劑

1) 材料.章魚(yú)內(nèi)臟(-20℃保存，廈門市東海洋水產(chǎn)品進(jìn)出口有限公司)；堿性蛋白酶(6.668 mkat)、中性蛋白酶(6.668 mkat)、木瓜蛋白酶(33.34 mkat)、動(dòng)物(復(fù)合)蛋白水解酶A5(2.500 5 mkat)(-20℃保存，廣西市南寧龐博生物工程有限公司).

2) 試劑.磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，水楊酸，過(guò)氧化氫，F(xiàn)eSO4，F(xiàn)eCl2，K3Fe(CN)6，F(xiàn)eCl3，F(xiàn)errozine(西隴化工股份有限公司)；氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉，硫酸銅，三氯乙酸(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；牛血清白蛋白(美國(guó)Amresco公司).

1.2儀器與設(shè)備

JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)(江蘇省常州市國(guó)華電器有限公司)；pH700型pH計(jì)( 美國(guó)Eutech Instruments公司)；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；RO-NF-UF-4010型膜分離設(shè)備，HPS-10，HPS-1型超濾膜組件(上海摩速科學(xué)器材有限公司)；VIS-7220型分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司).

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1復(fù)合氨基酸的制備蛋白酶(廣西南寧龐博生物工程有限公司)的水解最優(yōu)條件,如表1所示.表1中：θ為溫度；ρ為底物質(zhì)量濃度；t為時(shí)間.復(fù)合氨基酸的制備過(guò)程如下：章魚(yú)下腳料勻漿→調(diào)固液比、pH值、預(yù)熱至反應(yīng)溫度10 min→加酶水解→滅酶(100 ℃水浴，10 min)→4 500 r·m-1，離心15 min→上清液通過(guò)氨基酸分析儀分析檢測(cè).

表1　4種蛋白酶的最優(yōu)水解條件

抗氧化肽類的制備如下：章魚(yú)下腳料勻漿→調(diào)固液比、pH值、預(yù)熱至反應(yīng)溫度10 min→加酶水解→滅酶(100 ℃水浴，10 min)→紗布過(guò)濾→超濾膜10 ku(截留相對(duì)分子質(zhì)量10 ku)過(guò)濾→超濾膜1 ku(截留相對(duì)分子質(zhì)量1 ku)過(guò)濾→1～10 ku的濃縮液→冷凍干燥備用→檢測(cè)抗氧化性能時(shí)用去離子水溶解即可.

1.3.2氨基酸的測(cè)定酸解液(全部氨基酸溶液GBT 5009.124-2003)及水解液(游離氨基酸溶液)委托青島科標(biāo)檢測(cè)中心進(jìn)行檢測(cè).

1.3.3抗氧化性能檢測(cè)1) 羥基(·OH)清除能力的測(cè)定.將0.5 mL不同質(zhì)量濃度的多肽溶液，0.5 mL 的FeSO4(6 mmol·L-1)，及0.5 mL的H2O2(6 mmol·L-1)混勻，靜置10 min.在溶液中加入0.5 mL的水楊酸(6 mmol·L-1)，記為Ai；在溶液中加入去離子水，記為Aj；在溶液中加入多肽，記為Aj.將溶液靜置30 min后，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液于510 nm下測(cè)定吸光度，即

(1)

式(1)中：Y為羥基(·OH)清除率，%；Ai為多肽水溶液吸光值；Aj為多肽水溶液空白吸光值；Ao為試劑空白吸光值.

(2)

3) 還原能力的測(cè)定.將1 mL不同質(zhì)量濃度的多肽溶液，1 mL的PBS(pH值為6.6)，1 mL的 K3Fe(CN)6(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)混勻，在50℃下，反應(yīng)20 min.在溶液中加入1 mL的TCA(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%)后，3 000 r·min-1離心10 min.取1 mL的上清液，加入1 mL的去離子水和0.2 mL的FeCl3(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.1%)，于700 nm下測(cè)定吸光度，做多肽濃度與吸光值的曲線.

4) 粗肽液驗(yàn)證.利用反相高效液相色譜法，對(duì)4種蛋白酶水解液中的1～10 ku的粗肽液進(jìn)行初步分離純化，判斷其純化效果.具體實(shí)驗(yàn)條件如下：色譜柱為Bio-C18；流動(dòng)相A為0.1%的TFA，B為乙腈-TCA；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為5 μL；多肽質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1.

2結(jié)果與分析

2.1水解產(chǎn)物中氨基酸分析

根據(jù)節(jié)1.3.1的實(shí)驗(yàn)方法，利用氨基酸分析儀，對(duì)4種商業(yè)蛋白酶水解章魚(yú)下腳料獲取的復(fù)合氨基酸上清液進(jìn)行氨基酸分析，不同水解方法獲得的17種氨基酸結(jié)果，如表2所示.

表2　不同蛋白酶水解產(chǎn)物中氨基酸質(zhì)量比

由表2可知：堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、以及動(dòng)物蛋白酶A5水解得到的復(fù)合游離氨基酸的質(zhì)量比分別為0.227 5，0.126 9，0.071 1，0.360 5，分別占蛋白質(zhì)全部水解生成復(fù)合氨基酸總量的36.05%，20.11%，11.27%，57.12%.由此可見(jiàn)：動(dòng)物蛋白酶水解章魚(yú)下腳料獲取氨基酸的效果最好；4種蛋白酶水解得到的必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別占每種蛋白酶水解液中總游離復(fù)合氨基酸的53.93%，54.53%，55.56%，49.72%.

由于人和脊椎動(dòng)物無(wú)法自身合成必需氨基酸，或合成速度很慢，所以必需從食物和飼料中攝取和補(bǔ)充，而4種蛋白酶水解生成的必需氨基酸，均符合食品與飼料所需的全部8種必需氨基酸.

根據(jù)Cui等[8]利用堿性和中性蛋白酶對(duì)不同動(dòng)物下腳料進(jìn)行水解研究，發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)臟所得氨基酸比例與種類基本相似，從而判斷一種商業(yè)蛋白酶對(duì)不同蛋白質(zhì)的酶切位點(diǎn)基本一致.本實(shí)驗(yàn)堿性蛋白酶水解產(chǎn)生的氨基酸集中在Glu，Phe，Lys，Leu上(均大于2%)，與Kechaou等[9]利用堿性蛋白酶水解烏賊下腳料生成的氨基酸種類相似.堿性蛋白酶水解生成氨基酸順序?yàn)椋篖eu，Lys，Glu，Phe，Tyr，Thr(大于50%)，中性蛋白酶為L(zhǎng)eu，Glu，Lys，Phe，Aps(大于50%)，木瓜蛋白酶為Glu，Leu，Lys，Phe(大于50%).較多集中在疏水性氨基酸上，證實(shí)了3種蛋白酶具有內(nèi)切酶的特性.而動(dòng)物蛋白酶水解生成氨基酸順序?yàn)長(zhǎng)eu，Glu，Lys，Tyr，Phe，Thr(大于50%)，疏水性與親水性的氨基酸數(shù)量基本一致，證實(shí)了這種蛋白酶在水解過(guò)程，同時(shí)發(fā)揮了內(nèi)切和外切酶的特性.另外，部分芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味有突出貢獻(xiàn)，降低了氨基酸水解液的腥味.

2.2水解產(chǎn)物中肽類物質(zhì)的抗氧化性能檢測(cè)

化合物抗氧化作用的方式和機(jī)制有很多種，對(duì)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物進(jìn)行體外抗氧化活性檢測(cè)，包括清除自由基的能力、還原能力和金屬螯合能力[10].

用4種商業(yè)蛋白質(zhì)水解章魚(yú)下腳料，水解條件，如表1所示.水解液經(jīng)10 ku的膜分離裝置獲取濾過(guò)液，再經(jīng)過(guò)1 ku的膜分離裝置獲取濃縮液，即相對(duì)分子質(zhì)量1～10 ku的粗肽液.不同類型和質(zhì)量濃度的多肽難以比較，所以選擇IC50為指標(biāo)進(jìn)行抗氧化性能的評(píng)價(jià).

2.2.1羥基(·OH)清除能力檢測(cè)自由基是機(jī)體正常氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的一種有害物質(zhì).一般經(jīng)過(guò)體內(nèi)抗氧化酶和其他氧化劑就可以達(dá)到清除的效果[11].其中，羥基是自由基中氧化性最強(qiáng)的一種，F(xiàn)e2+和H2O2置換生成Fe3+,OH-和·OH，再通過(guò)水楊酸與·OH反應(yīng)生成可顯色的二羥基苯甲酸，對(duì)比吸光度和IC50即可判斷清除能力的高低.用OriginPro 8.0進(jìn)行擬合分析，結(jié)果如圖1所示.

圖1　不同質(zhì)量濃度肽類的·OH清除能力Fig.1　·OH scavenging ability of different concentrations of peptides

堿性蛋白酶：y=101.02-68.16/[1+(x/0.85)2.8]，R2=0.992 3，IC50=0.58 mg·mL-1；

中性蛋白酶：y=138.45-114.08/[1+(x/2.26)1.59]，R2=0.998 8，IC50=1.04 mg·mL-1；

木瓜蛋白酶：y=102.41-73.32/[1+(x/0.86)2.15]，R2=0.992 1，IC50=0.56 mg·mL-1；

動(dòng)物蛋白酶A5：y=99.75-75.82/[1+(x/1.66)2.48]，R2=0.999 9，IC50=1.28 mg·mL-1.

由圖1可知：4種蛋白酶水解產(chǎn)物的擬合R2均在0.99以上，擬合度高.堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的最高清除能力可達(dá)95%以上，IC50分別為0.58，0.56 mg·mL-1；中性蛋白酶和動(dòng)物蛋白酶水解產(chǎn)物的最高清除能力在95%以下，IC50分別為1.04，1.28 mg·mL-1.酶解產(chǎn)物清除·OH的能力由大到小的蛋白酶為：木瓜蛋白酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>動(dòng)物蛋白酶A5.

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：含硫氨基酸(Cys，Met)、芳香族氨基酸(Trp，Tyr，Phe)、含咪唑基氨基酸(His)能有效清除羥基，但是單個(gè)氨基酸存在時(shí)無(wú)法發(fā)揮活性，只能通過(guò)肽鏈或與蛋白質(zhì)的結(jié)合達(dá)到清除羥基的活性作用[12].由此推斷堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解章魚(yú)下腳料水解產(chǎn)物的肽類能暴露更有益于清除·OH的肽鍵和氨基酸.

2.2.2Fe2+螯合能力檢測(cè)抗氧化化合物在抑制或緩解氧化時(shí)，也可以通過(guò)螯合金屬的方式.1894年,Fenton[13]發(fā)現(xiàn)Fe2+與H2O2反應(yīng)可以產(chǎn)生·OH，證明Fe2+能置換出羥基，進(jìn)而危害人類健康.所以實(shí)驗(yàn)中利用Fe2+,Fe3+和Ferrozine的顯色機(jī)理，控制肽類的質(zhì)量濃度減少Fe2+的生成率，對(duì)比吸光度和IC50即可判斷螯合能力的高低.用OriginPro 8.0進(jìn)行擬合分析，結(jié)果如圖2所示.

圖2　不同質(zhì)量濃度肽類的Fe2+螯合能力Fig.2　Fe2+ chelating ability of different concentrations of peptides

堿性蛋白酶：y=90.11-46.22/[1+(x/0.61)6.54]，R2=0.999 9，IC50=0.46 mg·mL-1；

中性蛋白酶：y=80.60-79.14/[1+(x/0.99)2.42]，R2=0.999 4，IC50=1.20 mg·mL-1；

木瓜蛋白酶：y=59.21-55.11/[1+(x/1.25)2.13]，R2=0.999 9，IC50=2.66 mg·mL-1；

動(dòng)物蛋白酶A5：y=62.81-63.38/[1+(x/1.62)2.48]，R2=0.999 2，IC50=2.82 mg·mL-1.

由圖2可知:4種蛋白酶水解產(chǎn)物的R2均在0.999以上，有的甚至達(dá)到0.999 9，擬合度高.堿性蛋白酶的IC50為0.46 mg·mL-1是4種蛋白酶水解產(chǎn)物中最小的，說(shuō)明其水解產(chǎn)物中多肽能十分有效快速地螯合Fe2+；另外與·OH清除率相比，中性比木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物更有效地螯合Fe2+，但中性比木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的螯合能力大20%，IC50分別為1.22 mg·mL-1和2.66 mg·mL-1；在動(dòng)物蛋白酶中，隨著肽類質(zhì)量濃度增加，螯合率變化平緩，IC50為2.82 mg·mL-1.

對(duì)金屬螯合能力起到有效作用的多肽一般含有酸性或者堿性的氨基酸側(cè)鏈.Chen等[14]發(fā)現(xiàn)多肽的疏水性與螯合能力基本沒(méi)有關(guān)系，而與含有His的多肽鏈有關(guān).判斷堿性蛋白酶在水解章魚(yú)下腳料后的水解產(chǎn)物中肽類能暴露出更多有益于螯合Fe2+的片段.

2.2.3還原能力檢測(cè)還原能力的檢測(cè)是判斷酶解產(chǎn)物中的肽類是否具有將已被氧化的物質(zhì)還原的能力，還原力越強(qiáng)即自身抗氧化活性越好.肽類將Fe3+(鐵氰化鉀)還原成Fe2+(亞鐵氰化鉀)，F(xiàn)e2+與FeCl3反應(yīng)生成普魯士藍(lán)(Fe4[Fe(CN)6]3)，在700 nm下有最大吸收值，對(duì)比吸光度即可判斷還原力的高低.用OriginPro 8.0進(jìn)行擬合分析，得到結(jié)果如圖3所示.圖3中：D表示吸光度.

圖3　不同質(zhì)量濃度多肽的吸光度Fig.3　Absorbance of differentconcentrations of peptides

堿性蛋白酶：y=1 499.78-1 499.62/[1+(x/

150.7)1.84]，R2=0.992 1；

中性蛋白酶：y=0.99-0.84/[1+(x/2.11)1.83]，R2=0.988 3；

木瓜蛋白酶：y=158.71-158.82/[1+(x/

11 275.79)0.6]，R2=0.992 1；

動(dòng)物蛋白酶A5：y=8.08-8.02/[1+(x/41.49)0.86]，R2=0.994 1.

由圖3可知：4種蛋白酶水解產(chǎn)物中粗酶液在還原能力檢測(cè)上R2接近0.99，擬合度較好；堿性蛋白酶水解產(chǎn)物中肽類隨著質(zhì)量濃度的增加，還原能力大大增大，而其他3種蛋白酶水解產(chǎn)物中的肽類隨著質(zhì)量濃度的增加呈直線上升水平.試驗(yàn)是通過(guò)吸光度判斷肽類的還原能力，而IC50的原理是計(jì)算清除率50%的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，所以這里不用IC50、僅對(duì)比吸光度判斷肽類的還原能力.對(duì)比其他文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這4種蛋白酶水解章魚(yú)下腳料的時(shí)間較短，但還原力較高[15-16]，可以作為很好的還原劑加以利用.

圖4　4種粗肽液的反相高效液相色譜Fig.4　RP-HPLC of four crude peptide liquids

2.3多肽的驗(yàn)證

對(duì)粗肽液進(jìn)行反相高效液相色譜分析，判斷多肽的可純化程度結(jié)果，如圖4所示.圖4中：1為堿性蛋白酶；2為動(dòng)物蛋白酶；3為中性蛋白酶；4為木瓜蛋白酶.

由圖4可知：Bio-C18柱可以有效地分離多肽混合液.4種蛋白質(zhì)水解液在相同質(zhì)量濃度下進(jìn)行分離純化的，所以對(duì)比發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解液中多肽的種類和質(zhì)量濃度較多，而動(dòng)物蛋白酶的較少.由此推斷動(dòng)物蛋白酶可以將章魚(yú)下腳料中的蛋白質(zhì)大部分水解成氨基酸，而堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶可以獲取具有抗氧化活性較高的多肽，其中，堿性蛋白酶的抗氧化效果最好.另外，通過(guò)反相高效液相色譜和Bio-C18柱的結(jié)合，可以一次性有效得分離純化水解液中的小分子肽，相對(duì)于其他獻(xiàn)中需要結(jié)合凝膠色譜、離子交換色譜等方法，更加簡(jiǎn)便快捷.

3結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)4種常見(jiàn)商業(yè)蛋白酶對(duì)章魚(yú)下腳料中蛋白質(zhì)的初步水解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物蛋白酶A5水解后獲取的復(fù)合氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，有著蛋白酶用量少、酶解時(shí)間較短的優(yōu)點(diǎn)，可以作為工廠大規(guī)模加工獲取復(fù)合氨基酸的參考及選擇.另外，4種蛋白酶水解章魚(yú)下腳料后獲取的粗肽液均有不同程度的抗氧化能力，可以作為提取天然抗氧化的基礎(chǔ)，但還需進(jìn)一步純化分析才能獲取活性更好的化合物.

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(責(zé)任編輯： 陳志賢英文審校： 劉源崗)

Product Analysis of Protein Hydrolysate From Octopus Leftovers

HUANG Huili1,2， ZHANG Shuang1， ZHANG Yurong3,ZHANG Luying3, WANG Kaiming3

(1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;2. Environment and Resource Institute, Huaqiao University, Xiamen 361021, China；3. Xiamen East China Sea Aquatic Products Import and Export Company Limited， Xiamen 361012, China)

Abstract：In order to improve the comprehensive utilization of leftovers, four kinds of proteases were used to hydrolyze the octopus leftovers, and the amino acids and antioxidant peptides from the hydrolysate were preliminarily analyzed. The results show that the compound amino acid content from the animal protease hydrolysate could reach up to 57.12%. The ·OH scavenging ability IC50 of four kinds of hydrolysates were all less than 1.28 mg·mL-1, and the Fe2+chelating ability IC50 were all less than 2.82 mg·mL-1. The reduction increased with the peptide concentration increasing. It indicates that the process conditions and method can obtain two kinds of active substances (amino acid and antioxidant peptide), which provides experimental basis for the maximum utilization of the octopus leftovers.

Keywords：octopus; leftovers； enzymatic hydrolysis； compound amino acid； antioxidant peptide

中圖分類號(hào)：TS 254.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：福建省廈門市農(nóng)業(yè)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2013N0022)

通信作者：黃惠莉(1962-)，女，教授，主要從事海洋資源開(kāi)發(fā)與利用的研究.E-mail：hlhuang@hqu.edu.cn

收稿日期：2015-05-03

doi:10.11830/ISSN.1000-5013.2016.03.0330

文章編號(hào)：1000-5013(2016)03-0330-06