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      HPLC睧LSD同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)中3種三萜皂苷的含量

      2016-05-26 18:42:21吳培云任亞碩吳德玲喬金為
      中國(guó)中藥雜志 2016年7期
      關(guān)鍵詞:三萜含量測(cè)定

      吳培云 任亞碩 吳德玲 喬金為

      [摘要]建立了HPLCELSD測(cè)定醉魚草果實(shí)中三萜類成分含量的方法。采集不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)藥材共9批,采用反相高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定其三萜成分。色譜條件:Waters SunFireTM C18柱(46 mm×150 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇水(82∶18)溶液,體積流量1 mL·min-1,柱溫30 ℃。ELSD參數(shù):漂移管溫度106 ℃,噴霧溫度50 ℃,載氣(N2)流速15 L·min-1,增益系數(shù)1。結(jié)果表明醉魚草果實(shí)中的3種三萜成分clinoposaponin Ⅲ, desrhamnoverbascosaponin, mimengoside Ⅰ的進(jìn)樣量分別在0702~2808 μg(r=0999 2),0390~1560 μg(r=0998 9),0192~768 μg(r=0999 0)呈良好線性關(guān)系;平均加樣回收率(n=6)分別為9941%,9908%,9867%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為086%,16%,18%。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠,適用于測(cè)定醉魚草果實(shí)中三萜類成分的含量。

      [關(guān)鍵詞]醉魚草;三萜;HPLCELSD;含量測(cè)定

      [Abstract]To establish an HPLCELSD method for the quantification of triterpenoids in the fruits of Buddleja lindleyana The RPHPLCELSD method was used for the determination of triterpenoids in B lindleyana fruits, which were collected from different habitats The column used was a packed with 5 μm stationary phase Waters SunFireTM C18(46 mm×150 mm, 5 μm) The mobile phase consisted of Methanolwater(82∶18) at a flow rate of 1 mL·min-1 Column temperature: 30 ℃ ELSD conditions: drift tube temperature: 106 ℃; carrier gas (nitrogen) flow rate: 15 L·min-1; amplification factor: 1 The calibration curves showed good linear relationship on a range from 0702 to 2808 μg(r=0999 2) for Clinoposaponin III, 0390 to 1560 μg(r=0998 9) for Desrhamnoverbascosaponin and 0192 to 768μg(r=0999 0) for Mimengoside I The average recovery rate(n=6) were 9941%, 9908% and 9867% and it′s RSD were 086%, 156% and 180% This method can be used to determine the contents of triterpenoids in the fruits of Buddleja lindleyana for its simplicity, accurateness and reliability

      [Key words]Buddleja lindleyana; triterpenoids; HPLCELSD; determination of content

      doi:10.4268/cjcmm20160710

      醉魚草果實(shí)藥材為馬錢科Loganiaceae植物醉魚草Buddleja lindleyana Fortune的果實(shí),具有祛風(fēng)除濕、止咳化痰、散瘀之功效[1]。課題組通過對(duì)醉魚草果實(shí)的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn),醉魚草果實(shí)分離所得的單體化合物中,三萜及其苷類占絕大多數(shù),且具有一定的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性[24]。為了加強(qiáng)對(duì)醉魚草資源的綜合開發(fā)利用,本文對(duì)采集自萬佛山、天柱山、歙縣3個(gè)不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)中齊墩果烷型三萜皂苷的含量進(jìn)行了測(cè)定。

      三萜類成分的含量測(cè)定一般采用香草醛冰醋酸、高氯酸顯色法,本課題組前期已建立了紫外分光光度法測(cè)定醉魚草果實(shí)中總?cè)坪康姆椒╗5],雖可為醉魚草果實(shí)中三萜含量的測(cè)定提供參考,但該方法準(zhǔn)確度不高,專屬性較差,有一定的局限性,考慮到醉魚草果實(shí)中的三萜成分紫外吸收不強(qiáng),本實(shí)驗(yàn)選用通用型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light scattering detector,ELSD)。本文首次報(bào)道了HPLCELSD[67]測(cè)定醉魚草果實(shí)中三萜成分的含量,并對(duì)不同產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)藥材進(jìn)行分析,以期為醉魚草的質(zhì)量研究提供參考。

      1材料

      11儀器美國(guó)Agilent 1260高效液相色譜儀(二元泵 G1312C,柱溫箱 G1316A;自動(dòng)進(jìn)樣器 G1329B,檢測(cè)器 380ELSD);分析天平(瑞士METTLER TOLEDO AB135S);高速中藥粉碎機(jī)(浙江省溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠 FZ02型);超聲清洗儀(天津奧特塞恩斯 AS3120);一體式超純水系統(tǒng)(德國(guó)默克密理博MilliQ)。

      12試藥clinoposaponin Ⅲ,desrhamnoverbascosaponin,mimengoside Ⅰ的對(duì)照品均從醉魚草果實(shí)提取物中分離得到,并由現(xiàn)代波譜技術(shù)鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu),見圖1。用歸一化法測(cè)得3種對(duì)照品純度均大于98%;甲醇為色譜純,水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水,其余試劑均為分析純。醉魚草果實(shí)藥材分別采自安徽舒城萬佛山(2012年11月)、潛山天柱山(2013年9月)以及歙縣(2013年11月)地區(qū),經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為馬錢科植物醉魚草B lindleyana的果實(shí)。

      2方法及結(jié)果

      21對(duì)照品溶液的制備精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的化合物clinoposaponin Ⅲ,desrhamnoverbascosaponin,mimengoside Ⅰ對(duì)照品2633,1462,721 mg,分別置于25 mL量瓶中,加甲醇溶解后定容至刻度,得質(zhì)量濃度為1053,0585,0288 g·L-1的對(duì)照品溶液,然后將此3個(gè)對(duì)照品溶液按1∶1∶1混合,即得質(zhì)量濃度分別為0351,0195,0096 g·L-1的混合對(duì)照品溶液。

      22供試品溶液的制備精密稱取不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)粗粉2 g,置50 mL圓底燒瓶中,加80%乙醇20 mL回流提取3次,每次1 h,合并濾液,轉(zhuǎn)移置100 mL量瓶中,加甲醇稀釋并定容至刻度,即得供試品溶液。

      23色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜條件:Waters SunFireTM C18柱(46 mm×150 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇水(82∶18)溶液,體積流量1 mL·min-1,柱溫30 ℃。ELSD參數(shù):漂移管溫度106 ℃,噴霧溫度50 ℃,載氣(N2)流速15 L·min-1,增益系數(shù)1。在色譜條件下,取供試品溶液、對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣20 μL,3種成分均能與其他組分達(dá)到基線分離,對(duì)照品溶液及供試品溶液的HPLC色譜圖見圖2。

      24線性關(guān)系考察對(duì)照品溶液采用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣,進(jìn)樣量依次為2, 5, 10, 20, 40, 60, 80 μL,按照23項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積,以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X,色譜峰面積值的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程見表1。

      25精密度試驗(yàn)對(duì)照品溶液采用自動(dòng)進(jìn)樣器精密吸取20 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積。得出clinoposaponin Ⅲ,desrhamnoverbascosaponin,mimengosideⅠ對(duì)應(yīng)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)分別為088%,096%,16%,說明儀器精密度良好。

      26重復(fù)性試驗(yàn)按22項(xiàng)方法制備6份供試品溶液,分別進(jìn)樣20 μL,測(cè)定clinoposaponin Ⅲ,desrhamnoverbascosaponin,mimengosideⅠ的色譜峰面積,計(jì)算平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2152%,0806%,0194%,RSD(n=6)分別為12%,10%,20%。表示該方法測(cè)定這3種三萜含量的重復(fù)性良好。

      27穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液,分別在0,2,4,8,12 h自動(dòng)進(jìn)樣20 μL,測(cè)定clinoposaponin Ⅲ,desrhamnoverbascosaponin,mimengosideⅠ的對(duì)應(yīng)色譜峰面積,計(jì)算RSD(n=5)分別為12%,084%,14%,說明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

      28加樣回收率試驗(yàn)精密稱取萬佛山產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)粗粉9份(3種三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2152%,0806%,0194%),每份10 g,分別向其中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液(分別相當(dāng)于藥材原有含量的50%,100%,150%),每一質(zhì)量濃度取3份,按22項(xiàng)方法制備供試品溶液,得6份加標(biāo)溶液。采用自動(dòng)進(jìn)樣器分別精密進(jìn)樣20 μL,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果得clinoposaponin Ⅲ的加樣回收率為9941%,RSD 086%;desrhamnoverbascosaponin的加樣回收率為9908%,RSD為16%;mimengosideⅠ的加樣回收率為9867%,RSD 18%,結(jié)果見表2,實(shí)驗(yàn)證明,加樣回收率良好。

      29樣品含量測(cè)定取不同產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)(萬佛山、天柱山、歙縣),按22方法進(jìn)行操作,分別制成供試品溶液,同一批次平行測(cè)定2份。在23色譜條件下各進(jìn)樣20 μL,測(cè)定不同產(chǎn)地醉魚草果實(shí)中clinoposaponin Ⅲ,desrhamnoverbascosaponin,mimengosideⅠ的平均含量(n=3),結(jié)果見表3。

      從試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出,不同產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)中三萜成分的含量存在差異,以天柱山產(chǎn)地的clinoposaponin Ⅲ含量較高,而萬佛山產(chǎn)地的desrhamnoverbascosaponin,mimengosideⅠ含量較高。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLCELSD法測(cè)定3種三萜皂苷的含量,可以在一定程度上反映出醉魚草果實(shí)中三萜類成分的總含量。

      3討論

      本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究基礎(chǔ)上,參考正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選出的最佳提取工藝[8],最終選定80%乙醇,回流提取3次,每次1 h,料液比1∶10提取。

      MimengosideⅠ附近的峰分離有一定難度,本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇水系統(tǒng)80∶20,85∶15,82∶18,84∶16等多種流動(dòng)相的比例,最終選定甲醇水82∶18時(shí)分離度最好,峰形也較好,并能使檢測(cè)組分在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)較好的分離。根據(jù)流動(dòng)相比例,分別在100,106,110 ℃的漂移管溫度下,考察載氣流速,最終確定ELSD檢測(cè)器最優(yōu)參數(shù):漂移管溫度106 ℃,N2流速15 L·min-1。

      本文選取從醉魚草果實(shí)中分得的3種齊墩果烷型三萜皂苷類化合物clinoposaponin Ⅲ,desrhamnoverbascosaponin,mimengosideⅠ作為指標(biāo)性成分,其中mimengosideⅠ為課題組首次報(bào)道的新化合物[3],采用HPLCELSD測(cè)定其中三萜類成分,相比于課題組前期建立的紫外分光光度法[5],準(zhǔn)確度更高、專屬性更強(qiáng)。HPLCELSD測(cè)得結(jié)果,在一定程度上能反應(yīng)醉魚草果實(shí)中三萜類成分的總含量,方法學(xué)試驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠,表明該方法可行性較高。不同產(chǎn)地的醉魚草果實(shí)中三萜成分的含量存在差異,這可能與產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境、藥材采收時(shí)間等因素有關(guān),后續(xù)可開展有關(guān)醉魚草不同采收期化學(xué)成分研究的實(shí)驗(yàn)工作。

      [參考文獻(xiàn)]

      [1]江蘇新醫(yī)學(xué)院 中藥大辭典下冊(cè)[M] 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社,1986: 1128

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      [4]吳德玲, 汪洋奎, 劉勁松 醉魚草果實(shí)的化學(xué)成分研究:Ⅱ[J]中成藥, 2011, 33(12): 2107

      [5]任亞碩, 吳德玲, 張偉, 等 紫外分光光度法測(cè)定醉魚草果實(shí)中總?cè)坪縖J] 安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 31(5): 78

      [6]沙東旭, 劉兆妍, 張滿來, 等 HPLCELSD測(cè)定知母中知母皂苷BII的含量[J]藥物分析, 2009, 29(12): 2106

      [7]張正光, 朱玲英, 錢士輝 HPLCELSD法測(cè)定細(xì)柱五加果實(shí)中兩個(gè)齊墩果烷型三萜皂苷的含量[J]中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2012, 18(18): 82

      [8]沈炳香, 吳德玲, 任亞碩, 等 正交設(shè)計(jì)優(yōu)選醉魚草果實(shí)總?cè)铺崛」に嘯J] 安徽醫(yī)藥, 2013, 17(2): 186

      [責(zé)任編輯呂冬梅]

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