小分子靶標的核酸適配體篩選的研究進展

王　勇,　趙新穎,2,　石冬冬,　楊　歌,　屈　鋒*

(1. 北京理工大學生命學院, 北京 100081; 2. 北京市理化分析測試中心, 有機材料檢測技術(shù)

與質(zhì)量評價北京市重點實驗室, 北京 100089; 3. 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所, 北京 100081)

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小分子靶標的核酸適配體篩選的研究進展

王勇1,趙新穎1,2,石冬冬3,楊歌1,屈鋒1*

(1. 北京理工大學生命學院, 北京 100081; 2. 北京市理化分析測試中心, 有機材料檢測技術(shù)

與質(zhì)量評價北京市重點實驗室, 北京 100089; 3. 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所, 北京 100081)

摘要:核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(SELEX)技術(shù)篩選得到的核糖核酸(RNA)或單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)。核酸適配體通過高親和力特異性地識別小分子、蛋白質(zhì)、細胞、微生物等多種靶標,在生物、醫(yī)藥、食品和環(huán)境檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用日漸增多。但目前實際可用的核酸適配體有限,其篩選過程復雜,篩選難度大,制約了其應(yīng)用。與生物大分子、細胞和微生物等靶標不同,小分子靶標與核酸分子的結(jié)合位點少、親和力弱,且靶標通常需要固定在載體上。此外,小分子靶標結(jié)合核酸形成的復合物與核酸自身的大小、質(zhì)量、電荷性質(zhì)等方面差異較小,二者的分離難度大。故小分子靶標的核酸適配體篩選過程與大分子和細胞等復合靶標相比有明顯差異,篩選難度更大。因此需要根據(jù)其自身結(jié)構(gòu)特點和核酸適配體的應(yīng)用目的選定靶標或核酸庫的固定方法,優(yōu)化靶標核酸復合物的分離方法。本文介紹了不同類型小分子(具有基團差異的單分子、含相同基團分子和手性分子等)靶標的選擇及其核酸適配體的篩選方法,并對核酸庫的設(shè)計、與靶標結(jié)合的核酸的分離方法和親和作用表征方法進行了介紹,列出了自2008年以來報道的40余種小分子靶標的核酸適配體序列和復合物的平衡解離常數(shù)(Kd)。

關(guān)鍵詞:核酸適配體;小分子靶標;篩選;綜述

核酸適配體(aptamer)是通過鏈內(nèi)堿基間的氫鍵作用折疊形成穩(wěn)定的發(fā)卡、莖環(huán)、假結(jié)、口袋、凸環(huán)和G-四鏈體等二級或三級結(jié)構(gòu),并與靶標產(chǎn)生空間結(jié)構(gòu)匹配的高親和力和特異性結(jié)合的核糖核酸(RNA)和單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)[1,2]。核酸適配體一般由幾十個核苷酸組成,相對分子質(zhì)量小、易穿透細胞膜、性質(zhì)穩(wěn)定、容易制備和修飾,其結(jié)合的靶標范圍廣,包括離子、小分子、蛋白質(zhì)、細胞和微生物等。目前,蛋白質(zhì)、細胞和微生物等靶標的核酸適配體主要應(yīng)用于疾病診斷和治療、藥物研發(fā)、蛋白質(zhì)組學以及基因表達調(diào)控的機理研究[3]等。藥物、氨基酸、抗生素等小分子靶標的核酸適配體因其可特異性識別和區(qū)分小分子間極微小的結(jié)構(gòu)差異,通常作為化學和生物傳感器的識別分子用于食品和環(huán)境檢測以及生物分析等領(lǐng)域。理論上,任何靶標都可以篩選到核酸適配體,但目前實際可用的核酸適配體數(shù)量仍然非常有限。核酸適配體篩選過程復雜,篩選難度大,解決各種靶標的高效篩選問題是加快其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵一步[4]。

核酸適配體可以通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(SELEX)技術(shù)從隨機寡核苷酸庫(核酸庫)中篩選得到。SELEX過程包括核酸庫的建立、核酸庫與靶標相互作用的判定、與靶標結(jié)合的核酸分子的分離和擴增、循環(huán)篩選、篩選后的核酸序列測定以及序列與靶標的親和作用表征等步驟。完整的SELEX過程相當繁雜,需耗費大量的時間、人力和物力,成功率低,篩選效果常不能令人滿意。目前的核酸適配體篩選難以實現(xiàn)自動化,還沒有標準化的程序適用于不同類型的靶標。

與生物大分子、細胞和微生物等復合靶標不同,小分子靶標(Mr<1 000 )的結(jié)構(gòu)簡單,與核酸的結(jié)合位點少、親和力弱。小分子靶標與核酸結(jié)合的復合物與核酸分子自身的大小、質(zhì)量、電荷等性質(zhì)差異較小,二者的分離難度大,通常需將靶標固定在載體上進行篩選,而小分子靶標可用于鍵合固定的基團選擇性小。故小分子靶標的核酸適配體篩選過程與大分子和細胞等復合靶標相比有明顯差異,篩選難度更大。因此,需要根據(jù)小分子靶標的自身結(jié)構(gòu)特點和核酸適配體的應(yīng)用目的,選定靶標或核酸庫的固定方法,優(yōu)化靶標-核酸復合物的分離方法。目前國內(nèi)外關(guān)于小分子靶標的核酸適配體的綜述主要針對核酸適配體作為傳感分子在食品安全分析檢測中的應(yīng)用進展[5-8],專門針對篩選方法的總結(jié)報道不多。本文介紹了小分子靶標的選擇及其核酸適配體的篩選方法、核酸庫的設(shè)計、復合物的固相/液相分離方法和親和作用表征方法。統(tǒng)計了40余種小分子靶標的核酸適配體序列和平衡解離常數(shù)(Kd)。

1小分子靶標的類型

核酸適配體的篩選需考慮不同的研究和應(yīng)用目的,選擇不同特性的靶標。蛋白質(zhì)靶標的核酸適配體主要識別其氨基酸序列,細胞或微生物靶標的核酸適配體主要識別其表面的特定蛋白質(zhì),小分子靶標的核酸適配體主要識別其基團或空間結(jié)構(gòu)。小分子靶標通常包括不同基團組成的分子、含相同基團的同類分子和基團相同空間結(jié)構(gòu)不同的手性分子。

1.1不同基團組成的分子

以某種分子為靶標篩選的核酸適配體可用于構(gòu)建識別該分子的化學和生物傳感器。由于核酸適配體對其他雜質(zhì)分子或靶標的類似物沒有響應(yīng)或僅有弱響應(yīng),故可實現(xiàn)對該分子靶標的高選擇性識別。1994年,Jenison等[9]用瓊脂糖親和柱篩選得到茶堿的RNA 核酸適配體,Kd為100 nmol/L。茶堿與咖啡因的區(qū)別雖僅是N7原子上的一個甲基,但該核酸適配體與茶堿的親和力比咖啡因高10 000倍。相同條件下,即使是茶堿抗體的區(qū)分因子也只有1 000倍,說明該RNA 核酸適配體對官能團有微小差異的茶堿和咖啡因具有極高的識別和區(qū)分能力。

核酸適配體篩選通常需將靶標分子固定在載體上,而固定靶標的載體也可能與核酸庫中的核酸分子作用,因此有必要進行負篩選,即將核酸庫與載體預先混合孵育,扣除與載體結(jié)合的核酸分子,然后用余下的核酸庫與靶標作用。負篩選可以排除載體與核酸庫的結(jié)合,提高核酸適配體篩選效率和特異性。Jo等[10]篩選雙酚A(BPA)的DNA 核酸適配體,在第3輪后以乙醇胺修飾的環(huán)氧瓊脂糖凝膠6B載體為靶標進行負篩選,去除載體結(jié)合的DNA,最后得到BPA 核酸適配體,用熒光法測定Kd為8.3 nmol/L。該核酸適配體可以區(qū)分與BPA只有1個甲基差異的雙酚B,也可以區(qū)分有2個甲基差異的4,4′-雙酚。

為了提高核酸適配體的特異性還可以進行反篩選。即將核酸庫和與靶標具有相似結(jié)構(gòu)的分子混合孵育,扣除可能識別靶標相似結(jié)構(gòu)的分子,用余下的核酸庫與靶標進行篩選,以減小核酸適配體對相似結(jié)構(gòu)分子的結(jié)合,提高核酸適配體對靶標的特異性識別。Zhou等[11]通過環(huán)氧樹脂磁珠篩選鏈霉素的DNA 核酸適配體,每2輪篩選后都以修飾基團乙醇胺為靶標進行1次反篩選,經(jīng)過8輪篩選和3輪反篩選得到核酸適配體 STR1。液相色譜法測定其Kd為199.1 nmol/L。STR1對鏈霉素的結(jié)合率為76.5%,而對新霉素和卡那霉素等其他含相似結(jié)構(gòu)的氨基苷類抗生素的結(jié)合率均低于10%。

1.2含相同基團的同類分子

以含有相同基團的一類分子為靶標篩選的核酸適配體能識別該基團,對含有該基團的一類分子具有親和力,而對不含該基團的分子親和力低或無親和力。為了提高特異性,可采用切換篩選,即分別以含相同官能團和不含官能團的分子為靶標進行篩選。切換篩選是在不同的目標靶間進行切換,是同時針對多目標靶進行篩選的一種方法。Derbyshire等[12]以慶大霉素和阿泊拉霉素、卡那霉素和妥布霉素、巴龍霉素和新霉素、鏈霉素和二雙氫鏈霉素4組氨基糖苷類抗生素為靶標,通過切換篩選得到可識別氨基糖苷類抗生素的RNA 核酸適配體。表面等離子共振法(SPR)測定該核酸適配體對氨基糖苷類靶標的Kd為10 nmol/L。Mei等[13]以對硝基苯磺酰基修飾的L-賴氨酸為靶標,將其固定在瓊脂糖微珠上,在第12～20輪篩選中以硝基苯甲酰修飾末位氨基的L-賴氨酸為靶標進行反篩選,得到2條氨烷基類分子的核酸適配體M6b-M14和M13a。等溫滴定量熱法測定其Kd分別為(3.98±0.72)和(4.59±1.56) μmol/L,它們對對硝基苯甲酰修飾末位氨基的L-賴氨酸和L-賴氨酸的親和力較弱。目前報道含相同官能團的分子靶標核酸適配體有氨基糖甙類、四環(huán)素類、麥角生物堿類等。

1.3手性分子

以R或S型分子篩選的核酸適配體可以結(jié)合該型的手性分子,區(qū)別其空間結(jié)構(gòu)不同的對映體。手性分子的核酸適配體可用作手性分子分離的拆分劑。Kim等[14]以物質(zhì)的量比為1∶1混合的異丁苯丙酸外消旋體布洛芬為靶標,篩選得到5條DNA序列。其中3條DNA序列對外消旋體和R-異丁苯丙酸都有親和力,是R-異丁苯丙酸的核酸適配體。利用平衡過濾法測定3條DNA序列復合物的Kd分別為3.0、5.2和3.2 μmol/L;另外2條DNA序列對外消旋體和S-異丁苯丙酸都有親和力,是S-異丁苯丙酸的核酸適配體,其Kd分別為1.5和3.8 μmol/L。以上5條核酸適配體可用于藥物動力學分析中體內(nèi)布洛芬的檢測以及布洛芬手性藥物的分離、純化等。Yang等[15]將L-色氨酸固定在瓊脂糖微珠上,選用的核酸庫先以L-酪氨酸為靶標進行反篩選,再與L-色氨酸相互作用。經(jīng)過12輪篩選得到特異性識別L-色氨酸的DNA 核酸適配體 Trp3a-1,其含有34個堿基,可用于D/L-色氨酸的手性拆分。熒光法測定其復合物的Kd為1.757 μmol/L?？梢灶A見,手性分子的核酸適配體將在生物和化學制藥行業(yè)中的天然多糖及衍生物、大環(huán)抗生素、手性大環(huán)配體、配體交換復合物、手性表面活性劑等的手性分離和檢測方面有巨大的應(yīng)用潛力[16]。

針對這些小分子靶標篩選的核酸適配體,可以特異性識別特定的基團、分子結(jié)構(gòu)及手性。核酸適配體可以是ssDNA或RNA。ssDNA因其性質(zhì)穩(wěn)定,篩選成本低,是廣泛應(yīng)用的小分子核酸適配體。目前報道的以單分子為靶標篩選的核酸適配體以ssDNA為主(見表1)。

表 1　　　小分子靶標的核酸適配體序列及其平衡解離常數(shù)

表 1　　　(續(xù))

表 1　　　(續(xù))

* ‘t’ indicates 5-(2-(6-(arginamido)hexylamino)-2-oxoethyl)-dU.

2核酸庫的設(shè)計

無論是生物大分子,還是細胞、微生物等復合靶標,SELEX篩選中均需要設(shè)計合理的核酸庫。核酸庫可選擇RNA或ssDNA庫。選擇RNA庫時,需要將RNA分子反轉(zhuǎn)錄為DNA才能進行擴增。ssDNA庫比RNA庫穩(wěn)定性高,不需進行轉(zhuǎn)錄,容易合成和純化。使用ssDNA庫篩選,篩選步驟較少,對操作環(huán)境的要求較低。對核酸庫進行修飾可以增加核酸庫的穩(wěn)定性,同時也利于形成特定的結(jié)構(gòu)以增加對靶標的親和力[4,59-61],如戊糖2′位的取代(2′-氨基、2′-甲氧基、2′-氟)、磷酸修飾(磷酸酯、磷酰胺、嗎啉)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)等。此外,核酸庫的設(shè)計還可以借助計算機輔助完成。以AutoNock為代表的多種分子模擬軟件已經(jīng)可以完成基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計、先導化合物優(yōu)化、虛擬篩選、組合庫設(shè)計、化學機制研究等多種工作,并且大部分都有可視化的效果圖。核酸庫設(shè)計的合理性、靶標和核酸庫結(jié)合親和力的預測、核酸庫修飾效果的評價以及模擬的篩選路線等,都有望通過計算機輔助設(shè)計得以實現(xiàn)[62]。

小分子的核酸適配體篩選較大分子等更為困難,所以對核酸庫的選擇和設(shè)計要求更高。Liu等[63]將總長為103個堿基、隨機區(qū)域為59個堿基的ssDNA核酸庫轉(zhuǎn)錄為RNA核酸庫,然后與固定血紅素的親和色譜柱孵育。再用含血紅素的淋洗液洗脫,獲得與血紅素有特異性結(jié)合的RNA序列。然后再反轉(zhuǎn)錄為DNA序列,經(jīng)PCR擴增,獲得新一級的ssDNA核酸庫。如此反復篩選,可得到血紅素的RNA 核酸適配體。該課題組[64]還建立了用偶氮苯修飾的腺苷酸取代全部腺苷酸的修飾RNA核酸庫,經(jīng)過8輪篩選得到在可見光照射下與血紅素結(jié)合而在紫外光照下與血紅素解離的光敏RNA 核酸適配體,該研究為光敏小分子核酸適配體的篩選提供了重要的參考。然而由于修飾的核酸分子不能直接進行PCR擴增,反復篩選無疑增加了篩選的復雜程度,所以選用修飾的核酸庫更需要高效的篩選方法,以減少篩選步驟[44]。計算機輔助設(shè)計的推廣有望為解決小分子靶標的核酸適配體篩選問題提供新的途徑,但目前的報道還不多。

表 2　　　部分小分子靶標的核酸適配體篩選輪次與分離方法

3與靶標結(jié)合的核酸的分離方法

在SELEX篩選過程中,簡單、快速地得到與靶標結(jié)合的核酸是提高篩選效率的關(guān)鍵。固相分離法將靶標或核酸庫通過化學鍵合固定到載體上,利用不同的溶劑分別去除和清洗未與靶標結(jié)合的核酸,再通過溶劑洗脫使與靶標結(jié)合的核酸解離下來。該方法操作簡單,技術(shù)成熟,已被廣泛使用。此外,利用毛細管電泳(CE)法可以實現(xiàn)靶標-核酸復合物與未結(jié)合核酸在自由溶液中的快速分離,得到的靶標-核酸復合物可直接用于后續(xù)的PCR擴增。小分子靶標的核酸適配體篩選循環(huán)通常在3～20輪不等,而使用CE法進行篩選一般僅需1～4輪,是高效的篩選方法。部分小分子靶標的核酸適配體篩選和分離方法見表2。

3.1固相分離

3.1.1固定靶標

瓊脂糖親和色譜柱是常見的固相分離載體。早在SELEX技術(shù)發(fā)展之初,Ellington等[1]就是通過交聯(lián)瓊脂糖珠親和色譜柱篩選得到與代謝輔因子結(jié)構(gòu)相似的染料辛巴藍3GA、活性紅120、活性黃86、活性棕10、活性綠19和活性藍4的RNA 核酸適配體。利用這種方法已經(jīng)篩選得到多種小分子的核酸適配體,如ATP[65,66]、S-腺苷同型半胱氨酸[67]、L-精氨酸[68]和輔酶A[69]等。Song等[28]利用溴化氰活化的瓊脂糖親和色譜柱固定卡那霉素,經(jīng)過9輪篩選得到DNA 核酸適配體,熒光法測定的Kd為78.8 nmol/L。應(yīng)用瓊脂糖親和色譜柱一般經(jīng)過3～18輪篩選可以得到小分子靶標的核酸適配體。用瓊脂糖親和色譜柱固定小分子靶標技術(shù)較成熟,但所需樣品量大,且靶標和載體的修飾方法選擇性不多,固定靶標的反應(yīng)時間較長。

磁珠是近年來廣泛使用的固相載體,它對靶標用量少,分離操作簡便快速,且磁珠表面的復合物無需洗脫就可直接進行PCR擴增。此外,磁珠載體的表面修飾形式種類較多,如環(huán)氧基活化磁珠[11]、鏈霉親和素包被磁珠[27,58]、羧基修飾磁珠[30]、氨基修飾磁珠[32]、甲苯磺?；揎棿胖閇55,70]等。利用磁珠固相載體進行分離,一般經(jīng)過8～24輪篩選可以得到小分子靶標的核酸適配體。McKeague等[30]利用羧酸修飾磁珠固定伏馬菌素B1,經(jīng)過18輪篩選得到了6條DNA序列,其中核酸適配體 FB139的Kd為(100±30) nmol/L。Chen等[32]利用氨基修飾磁珠固定玉米烯酮,經(jīng)過14輪篩選,得到DNA 核酸適配體 8Z(31)的Kd為(41±5) nmol/L。Joeng等[40]利用氨基和羧基反應(yīng)將雙氯芬酸固定在含氨基的磁珠M-270表面,通過Flu-Mag SELEX從容量為2.4×1014的DNA庫中篩選到56條可與其結(jié)合的DNA 核酸適配體。Niazi等[55]以氧四環(huán)素為正篩選靶標、四環(huán)素和多西環(huán)素作為反篩選靶標,利用甲苯磺酰基活化磁珠篩選了7條四環(huán)素特異的DNA 核酸適配體,其Kd為63～483 nmol/L。Kiani等[39]將生物素?；牡馗咝涟苍阪溍褂H和素磁珠表面,經(jīng)過11輪篩選得到地高辛的DNA 核酸適配體,熒光法測定的Kd為8.2 nmol/L。Grozio等[58]將生物素修飾的脫落酸固定在鏈霉親和素磁珠表面,經(jīng)過7輪篩選,得到其DNA 核酸適配體,Kd為(0.80±0.07) μmol/L。

微孔板是酶聯(lián)適配體分析法(ELAA)常用的反應(yīng)載體,可用于固定小分子靶標。先將靶標連接到介質(zhì)蛋白質(zhì)上,再通過蛋白質(zhì)包被微孔板將靶標固定到微孔板表面。該法樣品用量少、操作簡單,但存在孵育時接觸面積小、所需時間長的不足。Kim等[26]以牛血清白蛋白為介質(zhì)蛋白質(zhì),間接將氧四環(huán)素固定到微孔板上,經(jīng)過12輪篩選得到其核酸適配體,通過ELAA測定Kd為4.7 nmol/L。Gong等[43]將N-糖神經(jīng)氨酸與羥基丁二酰亞胺反應(yīng)活化后連接到牛血清白蛋白的N-末端,利用微孔板載體篩選了N-糖神經(jīng)氨酸的核酸適配體。載玻片也可以作為固相載體。Lauridsen等[41]提出一步篩選α-金環(huán)蛇毒素DNA 核酸適配體的方法。靶標通過N-羥基丁二酰亞胺活化聚乙二醇固定到載玻片上,經(jīng)過1輪選擇成功得到DNA 核酸適配體,表面等離子共振法測定Kd為7.58 μmol/L。

溶膠-凝膠(SOL-GEL)是室溫下合成的硅酸鹽材料,通過水解和縮聚反應(yīng)形成納米級的空洞和微米級的通道[71],通常用來固定蛋白質(zhì)、酶等生物大分子。利用SOL-GEL的空洞和通道可簡單地固定小分子靶標而不需化學鍵合反應(yīng),固定后的小分子仍然可與核酸分子接觸產(chǎn)生相互作用。Bae等[22]利用SOL-GEL經(jīng)過7輪篩選到靈敏度低至1 μmol/L的黃嘌呤特異性的核酸適配體,Kd約為10 μmol/L,而將黃嘌呤通過共價鍵固定到聚合樹脂進行SELEX卻不能篩選到特異的核酸適配體。該研究顯示SOL-GEL法固定靶標黃嘌呤篩選小分子靶標的核酸適配體具有更好的效果。

3.1.2固定靶標類似物或核酸庫

當小分子靶標難以固定時,也可將核酸庫固定到載體上。這種方法需要在核酸庫的隨機序列中設(shè)計一段用于固定的堿基序列作為“橋接”序列,同時在載體上設(shè)計一段互補序列。利用該“橋接”序列與載體上的互補序列雜交,通過氫鍵作用將核酸庫固定在載體上。當核酸庫中的核酸分子與靶標結(jié)合時,“橋接”序列構(gòu)象發(fā)生變化,從載體表面釋放出來。Stoltenburg等[25]將ssDNA核酸庫固定在磁珠表面,利用Capture-SELEX經(jīng)過13輪篩選得到卡那霉素A的核酸適配體。He等[48]通過在瓊脂糖親和色譜柱表面固定ssDNA核酸庫篩選了啶蟲脒的核酸適配體。這種固定核酸庫的方法可以解決難固定的小分子靶標的核酸適配體的篩選問題,同時保持了靶標的天然結(jié)構(gòu)不受破壞。然而,當核酸結(jié)合靶標后,如不能產(chǎn)生構(gòu)象變化,結(jié)合的序列則不能脫離載體,也不能與核酸庫中其他序列分離,不能實現(xiàn)篩選。此外,由于核酸分子的堿基互補配對的作用力較弱,使載體表面固定的核酸結(jié)合力不如化學鍵合強,因此也可能導致部分未結(jié)合靶標的核酸也在洗脫過程中脫落下來,產(chǎn)生假陽性,降低篩選效率。

3.2毛細管電泳分離

靶標和核酸庫在自由溶液中相互作用時有利于保持二者的天然結(jié)構(gòu),也可以模擬生物體環(huán)境,因此在自由溶液中實現(xiàn)靶標結(jié)合核酸的分離是最為理想的方法。目前,僅有CE法可在自由溶液中實現(xiàn)靶標與核酸的相互作用以及靶標-核酸復合物與未結(jié)合核酸的同步分離。CE法中可將遷移率有明顯差異的靶標-核酸復合物與未結(jié)合核酸進行分離,同時可以在毛細管出口端定時收集靶標-核酸復合物,該過程為CE-SELEX。一般CE-SELEX只需要1～4輪篩選就可獲得蛋白質(zhì)等生物大分子的核酸適配體。但是由于小分子靶標結(jié)合核酸形成的復合物與未結(jié)合的核酸相比遷移率差異很小,在CE中難以分離,通常認為CE-SELEX并不適合小分子靶標的核酸適配體篩選。最近,Yang等[23]提出靶標-核酸復合物與未結(jié)合核酸雖不能完全分離,但二者的遷移時間仍有差異,通過對未結(jié)合核酸電泳峰的前段組分進行收集,仍可進行小分子核酸適配體的篩選。他們在25 mmol/L Tris-192 mmol/L 甘氨酸-5 mmol/L KH2PO4溶液(pH 8.3)中經(jīng)過3輪篩選得到小分子N-甲基卟啉二丙酸(NMM)的DNA 核酸適配體,熒光法測定的Kd為(0.88±0.12) μmol/L。該核酸適配體與初始核酸庫相比,親和力提高了50倍以上。該結(jié)果證明了CE-SELEX用于篩選小分子靶標的核酸適配體的可行性。本課題組也利用相似方法篩選了克倫特羅的核酸適配體,并取得了較好的結(jié)果(文章待發(fā)表)。

4親和作用表征

靶標與隨機核酸庫中的核酸分子具有高親和性、特異性的結(jié)合是SELEX篩選核酸適配體的基礎(chǔ)。經(jīng)過多輪篩選,靶標與次級庫的親和力逐漸增加,強于與初始核酸庫的作用。因此,靶標與核酸庫和次級庫的結(jié)合力可用于定性評價每輪篩選的效果,毛細管區(qū)帶電泳和親和毛細管電泳法都可用于快速、定性地表征親和力的相對大小。此外,多輪篩選得到的核酸適配體與靶標結(jié)合形成的復合物的Kd通常用于表示親和力強弱。計算復合物的Kd可用組分分離法,即使溶液中的靶標、靶標-核酸復合物與未結(jié)合核酸完全分離,依據(jù)其平衡濃度求算Kd,所用方法有透析法、超速離心法、超濾法、凝膠電泳法、毛細管電泳法和液相色譜法[11,72-75]等。也可以不經(jīng)分離,直接利用靶標、靶標-核酸復合物與未結(jié)合核酸混合溶液測定,所用方法有熒光各向異性/偏振、圓二色譜、SPR等。對小分子靶標進行親和力表征時,所用方法有超濾法[11,21,55]、熒光光譜法[28-31]、熒光各向異性/偏振法[42]、紫外光譜法[13,17,24]、ELAA法[26,43]、SPR法[12,18,19]等。熒光光譜法靈敏度高、操作簡單、定量準確,是測定Kd的主要方法。例如Barthelmebs等[29]利用羧基熒光素標記的DNA 核酸適配體與固定于磁珠表面的赭曲霉毒素A相互作用,利用熒光光度計測定結(jié)合的核酸適配體,通過擬合飽和曲線得到核酸適配體的Kd為96 nmol/L。SPR法也是親和力測定的常用方法。Rouah-Martin[56]等將生物素修飾的靶標固定到鏈霉親和素包被的SPR芯片上,通過測定不同濃度的核酸適配體流經(jīng)芯片表面時的響應(yīng)值,測定了麥角生物堿核酸適配體的Kd為44 nmol/L。此外,紫外光譜法、ELAA法測定Kd的應(yīng)用也較多。

5展望

小分子靶標的核酸適配體可用作各種傳感器的識別分子,解決實際樣品中小分子快速、靈敏檢測的問題。但目前可應(yīng)用的小分子靶標的核酸適配體的數(shù)量和效果遠遠不能滿足實際需要。深入理解小分子靶標的核酸適配體篩選的本質(zhì)和SELEX過程的特點,克服篩選過程中的困難,提高小分子靶標的核酸適配體的親和力和特異性,是小分子靶標的核酸適配體得以廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。納米材料、高通量測序和計算機輔助設(shè)計等多種新技術(shù)的快速發(fā)展有望為小分子靶標的核酸適配體的高效篩選提供新方法和新思路,也是核酸適配體篩選的發(fā)展方向。

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Research advances of aptamers selection for small molecule targets

WANG Yong1, ZHAO Xinying1,2, SHI Dongdong3, YANG Ge1, QU Feng1*

(1. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;2. Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing Key Laboratory of Organic Materials Testing Technology & Quality Evaluation, Beijing 100089, China;3. Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Abstract:Aptamers are ribonucleic acid (RNA) or single-stranded deoxyribonucleic acid (ssDNA) selected by systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Aptamers can identify small molecules, proteins, cells, microorganisms and other targets with high affinity and specificity, and have been widely applied in biology, medicine, food and environmental monitoring. However, available aptamers of practical use are limited. The complex and difficult screening of aptamers are the key to restrict its wide application. Differing from biomacromolecules, cells and microorganisms, small molecules have less binding sites and weaker affinity with nucleic acids. And they usually need to be immobilized on substrates. In addition, due to the tiny differences of size, weight and charge of the target-ssDNA/RNA complex and ssDNA/RNA, their separation is difficult. Therefore, the aptamer selection of small molecules is more difficult than biomacromolecules or cells. The selection of methods for immobilizing the targets or library and the optimization of separation process proceed mainly based on the structure characteristics and applications of aptamers. In this paper, the screening methods for molecules with different groups, molecules containing the same group and chiral molecules are introduced. Also, the library design, the methods for separating targets-ssDNA complex and characterizing affinity interaction are discussed. The sequences and dissociation constants (Kd) of about 40 aptamers reported since 2008 are listed.

Key words:aptamer; small molecule targets; screening; review

中圖分類號:O658

文獻標識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)04-0361-09

基金項目:國家自然科學基金項目(21175011,21375008);北京市科學技術(shù)研究院青年骨干計劃項目;“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2011BAD26B040406).

*收稿日期:2015-05-05

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.05001

多尺度靶標的核酸適配體篩選研究進展專欄

·專論與綜述

*通訊聯(lián)系人.E-mail:qufengqu@bit.edu.cn.

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21175011, 21375008); Youth Plan of Beijing Academy of Science and Technology; Twelfth Five-Year-Plan in National Science and Technology for the Rural Development (No. 2011BAD26B040406).