• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    細(xì)菌的核酸適配體篩選的研究進(jìn)展

    2016-05-12 07:23:19陳爾凝趙新穎
    色譜 2016年4期
    關(guān)鍵詞:靶標(biāo)菌體復(fù)合物

    陳爾凝, 趙新穎, 屈 鋒

    (1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081; 2. 北京市理化分析測試中心, 北京 100089)

    ?

    細(xì)菌的核酸適配體篩選的研究進(jìn)展

    陳爾凝1,2,趙新穎2,屈鋒1*

    (1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081; 2. 北京市理化分析測試中心, 北京 100089)

    摘要:核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選的能夠以高親和力和高特異性識別靶標(biāo)分子或細(xì)胞的核糖核酸(RNA)和單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)。作為化學(xué)抗體,核酸適配體的制備和合成比抗體的成本更低。核酸適配體的靶標(biāo)范圍極其廣泛,包括小分子、生物大分子、細(xì)菌和細(xì)胞等。針對細(xì)菌靶標(biāo)篩選的適配體,目前主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和環(huán)境中的細(xì)菌檢測。細(xì)菌的核酸適配體篩選可以通過離心法將菌體-適配體復(fù)合物與游離的適配體分離,并通過熒光成像、熒光光譜分析、流式細(xì)胞儀分選、DNA捕獲元件、酶聯(lián)適配體分析等方法表征適配體與靶標(biāo)的相互作用。篩選出的適配體可結(jié)合生物、化學(xué)檢測方法用于細(xì)菌檢測。本文介紹了細(xì)菌適配體的篩選和表征方法以及基于適配體的檢測方法的最新進(jìn)展,分析了不同檢測方法的利弊,并列出了2011~2015年篩選的細(xì)菌的核酸適配體。

    關(guān)鍵詞:核酸適配體;細(xì)菌;篩選;指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù);綜述

    核酸適配體(aptamer)是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)體外篩選的能與靶標(biāo)高親和性和高特異性結(jié)合的核糖核酸(RNA)和單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)[1]。它通常由幾十個核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體組成,通過堿基的分子內(nèi)氫鍵作用,形成復(fù)雜的二級或三級結(jié)構(gòu),如發(fā)卡、莖環(huán)、G-四連體等。篩選適配體的主要步驟包括建立隨機(jī)寡核苷酸庫(簡稱“核酸庫”)、表征核酸庫與靶標(biāo)的相互作用、分離靶標(biāo)核酸復(fù)合物,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增可與靶標(biāo)結(jié)合的核酸形成新的次級庫。多次重復(fù)以上篩選步驟(一般需要4~20輪)以獲得親和力高、特異性好的適配體。篩選的最后步驟還包括核酸序列測序并計算它與靶標(biāo)形成的復(fù)合物的平衡解離常數(shù)(Kd)等。人工構(gòu)建的核酸庫一般包括正向引物序列、20~60個隨機(jī)核苷酸序列、反向引物序列3部分。如篩選RNA適配體則需使用RNA庫,首先要將RNA分子逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)后再進(jìn)行擴(kuò)增。由于RNA容易降解,故在篩選過程及應(yīng)用時需要采取保護(hù)措施,如使用2-氟-2-脫氧胞苷三磷酸和2-氟-2-脫氧尿苷三磷酸合成RNA[2]。篩選ssDNA適配體則相對簡單,因ssDNA庫可直接合成無需逆轉(zhuǎn)錄步驟,且DNA的穩(wěn)定性優(yōu)于RNA,合成和純化步驟較簡單。

    適配體作用的靶標(biāo)范圍很廣,包括小分子、生物大分子(蛋白質(zhì)和酶)、細(xì)菌及細(xì)胞等。因細(xì)菌廣泛存在于空氣、水、土壤以及各種生活環(huán)境中,故在食品、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域的細(xì)菌分析檢測必不可少。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測需要通過細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定、抗體識別、PCR等分析手段完成。這些檢測方法耗時長、成本高、不夠便利。而使用適配體則無需對細(xì)菌進(jìn)行大量培養(yǎng),也無需裂解提取DNA,有望實現(xiàn)原位在線檢測。相比抗體,適配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、相對分子質(zhì)量更小,完全通過人工合成方法大量制備,無需實驗動物,故制備周期短并且成本低。理論上,任何細(xì)菌都有可能通過SELEX方法篩選得到其適配體。

    多篇綜述總結(jié)了細(xì)菌的適配體應(yīng)用研究。Maureen等[3]統(tǒng)計了1990~2013年的492篇適配體篩選文獻(xiàn),其中有6%的文獻(xiàn)是以細(xì)菌或真核細(xì)胞為靶標(biāo)。Torres-Chavolla等[4]總結(jié)了2009年前的全細(xì)胞靶標(biāo)的適配體篩選,其中應(yīng)用于細(xì)菌檢測的有5篇。Hamula等[5]總結(jié)了2011年前致病菌適配體的篩選與應(yīng)用,其中有12篇文獻(xiàn)報道了以全細(xì)胞方式篩選的適配體,涵蓋了8屬9種病原菌。另有20篇文獻(xiàn)以菌體分子為靶標(biāo),涉及11種細(xì)菌。針對適配體的應(yīng)用,Amaya-González等[6]介紹了2004~2013年適配體在食品細(xì)菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用,這些應(yīng)用基于適配體分析、適配體傳感器和適配體芯片3個層次。Gedi等[7]總結(jié)了2014年前有關(guān)適配體與納米顆粒結(jié)合的應(yīng)用技術(shù),介紹了針對8屬10種病原菌的13篇文獻(xiàn)。McKeague等[8]總結(jié)了2011年前發(fā)表的適配體傳感器在食品細(xì)菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究,包括了8屬11種細(xì)菌的13個適配體傳感器,其中RNA適配體4個,ssDNA適配體9個。Ozalp等[9]總結(jié)了2013年前具有抗菌活性的適配體,這些適配體可以抑制細(xì)菌代謝、促進(jìn)人體免疫反應(yīng)或者阻礙細(xì)菌侵染人體。2011~2015年報道的細(xì)菌的適配體篩選,ssDNA適配體有15篇,RNA適配體為2篇(見表1)[10-26]。相比大量的應(yīng)用需求,實際可用的細(xì)菌適配體還極其有限,細(xì)菌適配體的篩選以及使用還面臨很大的困難。目前,細(xì)菌的適配體還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實際應(yīng)用需要,其中適配體的有效篩選是關(guān)鍵,也是瓶頸問題。本文總結(jié)了2011~2015年基于細(xì)菌全細(xì)胞的適配體篩選方法、適配體的親和力和特異性表征方法以及適配體在細(xì)菌分析檢測中的最新進(jìn)展。

    表 1   細(xì)菌全細(xì)胞的核酸適配體序列及其平衡解離常數(shù)(Kd)

    表 1   (續(xù))

    * Primers are marked with brackets. Show only favored (with lowestKdor suggested by author) sequences. FC, flow cytometry; FI, fluorescent imaging; FS, fluorescence spectrometry; DCE, DNA capture element; SPR, surface plasmon resonance; ELASA, enzyme linked aptamer sorbent assay. NA, not mentioned.

    1靶標(biāo)類型

    針對細(xì)菌靶標(biāo)的適配體篩選,一般是以菌體表面分子為靶標(biāo)或以全細(xì)胞為靶標(biāo)?;诰w表面分子的篩選,通常需將靶標(biāo)細(xì)菌滅活,再分離純化菌體表面的蛋白質(zhì)、多糖等分子,并以這些大分子作為靶標(biāo)[23,27]。此種針對表面分子的篩選方法與蛋白質(zhì)、小分子等靶標(biāo)的適配體篩選方法類似[5]。由于對菌體表面分子的分離純化改變了其處于菌體表面時的空間構(gòu)型和環(huán)境狀態(tài),與其在細(xì)菌表面時的天然結(jié)構(gòu)存在差異[16],因而基于表面分子篩選的適配體在全細(xì)胞檢測中應(yīng)用時,顯然與針對表面分子檢測時不一致,這種針對表面分子篩選的適配體通常并不完全適用于全細(xì)胞檢測。所以直接使用完整的菌體細(xì)胞(滅活或活體)作為靶標(biāo),將最大限度地保持菌體的天然狀態(tài)和表面分子的天然結(jié)構(gòu),有利于對實際菌體樣品的檢測。而且直接利用全細(xì)胞菌體為靶標(biāo),還無需分離和提純菌體表面分子,大大簡化篩選步驟和復(fù)雜過程。特別值得一提的是,以單一來源的細(xì)菌為靶標(biāo)篩選得到的適配體,往往可以與同種細(xì)菌的不同來源的菌株結(jié)合。如由大腸桿菌(E.coli)(KCTC 2571)篩選得到的4條適配體E1、E2、E10和E12均可與E.coliKCTC 1681、KCTC 2617和KCTC 2618有較強(qiáng)的結(jié)合,但與不同種屬的K.pneumonia、C.freundii、E.aerogenes或S.epidermidis的結(jié)合很弱[11],表明該適配體同時具有種內(nèi)識別的通用性和種間識別的特異性,可以用于種水平上的細(xì)菌檢測與鑒定,但是不能用于菌株鑒定。

    然而,由于細(xì)菌存在細(xì)胞壁以及部分細(xì)菌莢膜結(jié)構(gòu),適配體很難直接與菌體表面特異性的蛋白質(zhì)或多糖接觸。而且不同溫度和不同培養(yǎng)基等條件下培養(yǎng)的細(xì)菌,其菌體狀態(tài)也會存在差異。因此全細(xì)胞的適配體篩選的確存在更多困難。目前的全細(xì)胞適配體篩選,所用的菌體靶標(biāo)既有滅活的菌體(如乙醇或甲醛滅活),也有活的細(xì)菌[22,24,28],對菌體細(xì)胞表面的不同處理方式肯定影響篩選的適配體的親和力。本課題組的研究表明,使用E.coli與嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)的原生質(zhì)體作為靶標(biāo)可以篩選到親和力更強(qiáng)的適配體,用乙醇滅活的大腸桿菌比甲醛滅活的大腸桿菌對核酸庫的親和力更強(qiáng)[29]。此外,滅活的菌體可以一次大量制備獲得,便于滿足后續(xù)多輪篩選的需要,也有利于菌體的定量、減小實驗誤差。但是滅活過程也會導(dǎo)致菌體表面蛋白質(zhì)變性,與實際活菌檢測的表面狀態(tài)不同。而以活菌為靶標(biāo)時,雖不存在表面蛋白質(zhì)的變性問題,但不同批次以及不同測定時間的活菌的數(shù)量和生長狀態(tài)存在一定差異,故需先對活菌定量(菌落計數(shù)或測定吸光度),并檢測和表征其生長狀態(tài),減少活菌靶標(biāo)的性狀差異,提高活菌檢測的重現(xiàn)性。

    2篩選方法

    全細(xì)胞菌體的適配體篩選前,需先將人工合成的隨機(jī)核酸庫進(jìn)行熱變性(95 ℃, 10 min)以破壞核酸分子間形成的聚合物,然后在冰上迅速降溫,避免核酸發(fā)生聚合,再與靶標(biāo)細(xì)胞在4~37 ℃下靜置或輕柔振蕩孵育30~90 min,以形成核酸-菌體復(fù)合物。Shamah等[30]認(rèn)為4 ℃孵育可以減少DNA降解,有利于適配體的篩選。另一方面,如考慮到適配體應(yīng)用于細(xì)菌檢測時的環(huán)境溫度,室溫或37 ℃孵育與實際應(yīng)用條件更接近。

    孵育完成后,可通過離心去除上清液中游離的核酸,并多次洗滌菌體沉淀,再將核酸-菌體復(fù)合物加熱變性,使菌體細(xì)胞與核酸分離。離心回收上清液。對上清液中的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再通過核酸的單鏈制備,得到次級單鏈核酸庫。核酸庫與初始核酸庫相比,對靶標(biāo)結(jié)合的親和力有所提高。重復(fù)以上孵育-分離-擴(kuò)增的篩選過程,經(jīng)過多輪篩選直到獲得對靶標(biāo)具有高親和力(nmol/L數(shù)量級)的核酸。對核酸進(jìn)行測序,并測定其與靶標(biāo)結(jié)合的Kd值。進(jìn)一步檢測其特異性,選出兼具高特異性與高親和力的核酸序列作為該種細(xì)菌的適配體。全細(xì)胞菌體的適配體篩選過程中,離心法是高效分離游離核酸與靶標(biāo)-核酸復(fù)合物的主要方法。

    目前全細(xì)胞的適配體篩選主要使用離心法分離菌體與游離的核酸。本課題組也使用了毛細(xì)管電泳(CE)進(jìn)行適配體篩選。因ssDNA與靶標(biāo)細(xì)菌形成復(fù)合物后,其質(zhì)荷比變化導(dǎo)致在CE中的遷移率改變。CE過程中,ssDNA、靶標(biāo)、靶標(biāo)-核酸復(fù)合物具有不同的遷移速率,故可通過CE分離并收集靶標(biāo)-核酸復(fù)合物,同時還可對核酸庫與靶標(biāo)的親和作用進(jìn)行比較[29]。因此,毛細(xì)管電泳是高效篩選適配體的有效方法之一,可在一次CE過程中完成復(fù)合物的收集和親和作用的比較。

    為了提高篩選的適配體的特異性,篩選過程中通常需要使用反向篩選。即使用高濃度的非靶標(biāo)細(xì)胞與核酸庫共同孵育,以除去非特異性結(jié)合的核酸。反向篩選常在第2輪及之后的輪次進(jìn)行,所選非靶標(biāo)細(xì)胞可以是其他種屬的細(xì)菌,對活細(xì)胞靶標(biāo)也可以使用滅活的靶細(xì)胞作為反向篩選的靶標(biāo)細(xì)胞[18]。Lee等[2]篩選E.coliO157的適配體時選用了同屬不同種的E.coliK12作為反向篩選的靶標(biāo)。Park等[21]使用銅綠假單胞菌與大腸桿菌作為反向篩選的靶標(biāo)用于Sal.typhimurium和Sal.enteritidis的適配體篩選。Labib等[18]篩選Sal.typhimurium的適配體時使用的是熱變性的靶細(xì)胞以及混合的S.enteritidis、E.coli、S.aureus、P.aeruginosa和C.freundii作為反向篩選的靶標(biāo),篩選到的適配體能區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。需要注意的是,Duan等[22]在篩選S.dysenteriae的適配體時選擇了不同屬的S.aureus、Sal.typhimurium、E.coli、L.monocytogenes和V.parahaemolyticus4種菌作為反向篩選靶標(biāo),當(dāng)進(jìn)行適配體的特異性驗證時,其對靶標(biāo)的親和力顯著高于同屬的S.boydii、S.sonnei和S.flexneri,這表明即使使用不同屬的菌株作為反向篩選的靶標(biāo),篩選的適配體也能對同屬不同種的細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。同時也說明依據(jù)細(xì)菌的生化反應(yīng)、形態(tài)特征劃分的細(xì)菌種屬,不能很好地反應(yīng)細(xì)菌表面特征分子的差異。S.dysenteriae的表面特征分子與同屬的S.boydii、S.sonnei和S.flexneri間存在差異,應(yīng)該足以通過適配體進(jìn)行鑒別,甚至不需要特別設(shè)置反向篩選的靶標(biāo)。另一方面,由于屬內(nèi)細(xì)菌的表面特征分子也存在較大差異,當(dāng)難以直接篩選屬內(nèi)通用的適配體時,可以優(yōu)化篩選方法,或者將一組針對屬內(nèi)不同種細(xì)菌的適配體聯(lián)合使用。

    3適配體親和性與特異性表征

    細(xì)菌靶標(biāo)與核酸結(jié)合的親和力和特異性是評價所篩選的適配體的重要參數(shù)。通常用靶標(biāo)-核酸復(fù)合物的Kd表征相互作用。Kd值越小表明兩者相互作用越強(qiáng)。當(dāng)使用梯度濃度的核酸與靶標(biāo)共同孵育后,檢測核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的濃度,按公式(1)可求算Kd[24,25,31]。

    (1)

    式中:Y為核酸-靶標(biāo)復(fù)合物濃度;X為核酸濃度;Bmax為常數(shù)。Kd測定時可使用熒光標(biāo)記的核酸。通過測定復(fù)合物的熒光強(qiáng)度求算Y值。

    3.1平衡解離常數(shù)的測定方法

    3.1.1熒光成像法

    將熒光標(biāo)記的核酸與靶標(biāo)的孵育混合物經(jīng)離心去除和清洗未結(jié)合的適配體后,置于熒光顯微鏡下觀測,直接對帶有熒光的成像菌體計數(shù),可求出Y值[11]。

    3.1.2熒光光譜法

    將核酸與靶標(biāo)的孵育混合物通過離心等方法分離后,使用熒光光譜儀測定核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度,可作為Y值[22]。

    3.1.3流式細(xì)胞儀法

    將孵育混合物通過流式細(xì)胞儀,測定帶有熒光標(biāo)記的核酸-靶標(biāo)復(fù)合物的數(shù)量[16]。流式細(xì)胞儀可以對復(fù)合物進(jìn)行絕對定量,同時將核酸-靶標(biāo)復(fù)合物與游離的核酸或靶標(biāo)分離。

    3.1.4表面等離子共振法

    表面等離子共振(SPR)技術(shù)將50 μmol/L核酸固定在親和素芯片上,再通入109CFU/mL的靶標(biāo)細(xì)菌孵育10 min,然后用Biacore 3000測定[17]。結(jié)果經(jīng)軟件分析后可求得Kd值。由于SPR可以直接檢測適配體與靶標(biāo)的結(jié)合狀態(tài),因此無需額外對適配體進(jìn)行修飾,最大限度地保持了適配體的空間結(jié)構(gòu)。

    3.1.5DNA捕獲元件(DCE)法

    使用3′端帶有量子點或熒光基團(tuán)標(biāo)記的適配體及5′端帶有猝滅基團(tuán)的適配體的互補(bǔ)序列形成雙鏈DNA。加入靶標(biāo)后,因靶標(biāo)與適配體序列結(jié)合將釋放出5′端攜帶的猝滅基團(tuán)的互補(bǔ)序列,而使適配體上的量子點或熒光基團(tuán)發(fā)光。檢測熒光強(qiáng)度可定量檢測適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的量。由于未與靶標(biāo)結(jié)合的適配體的熒光被猝滅,因而此方法的背景熒光低,具有較高的靈敏度[10]。

    3.1.6酶聯(lián)適配體分析法(ELASA)

    將5′端標(biāo)記有巰基的RNA適配體固定在銀膜上,經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫未固定的適配體后,加入靶標(biāo)細(xì)菌。孵育15 min后靶標(biāo)被銀膜上的適配體捕獲固定,用PBS沖洗后,再加入帶有6-羥基熒光素(FAM)標(biāo)記的適配體繼續(xù)孵育,使其與靶標(biāo)形成適配體-細(xì)菌-適配體夾心型復(fù)合物,洗脫未結(jié)合的適配體后,通過熒光成像即可觀察到帶有熒光的復(fù)合物,從而對靶標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行定量分析[12]。

    3.1.7毛細(xì)管電泳(CE)法

    依據(jù)ssDNA、靶標(biāo)和ssDNA-靶標(biāo)復(fù)合物質(zhì)荷比的差異將3組分分離,并通過測定各組分的峰面積,根據(jù)公式(2)計算Kd值[29]。

    (2)

    式中:A0為靶標(biāo)加入前游離ssDNA的峰面積;A為靶標(biāo)加入后游離ssDNA的峰面積;[L]為靶標(biāo)的濃度。

    在測定Kd值的同時,CE能夠?qū)sDNA-靶標(biāo)復(fù)合物分離富集,簡化了SELEX篩選的步驟。

    3.2特異性驗證

    篩選完成后,除了表征適配體的親和力,還需考察適配體對靶標(biāo)的特異性。特異性驗證可利用同種不同來源的菌株,也可用不同種屬的其他細(xì)菌。用單一菌種作為靶標(biāo)篩選的適配體,對同一種細(xì)菌不同來源的菌株系有結(jié)合作用,但無法識別不同種、不同屬的其他細(xì)菌,或?qū)ζ渌?xì)菌的親和力很弱[24,28]。例如Chang等[24]用金黃色葡萄球菌篩選得到的適配體對6株不同來源的金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的結(jié)合,與11株不同屬的細(xì)菌沒有結(jié)合,而與2株同為葡萄球菌屬但不同種的細(xì)菌有較弱的結(jié)合。

    4基于適配體的檢測方法

    食品、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域中細(xì)菌的檢測非常普遍,具有重要的實用意義?;诳贵w的細(xì)菌檢測技術(shù),因其速度快、特異性高而倍受青睞。近年來篩選的適配體已經(jīng)可以部分替代抗體用于細(xì)菌的分析檢測。目前篩選的適配體的Kd值在10~103nmol/L,對不同細(xì)菌的檢出限因所用分析方法不同差別較大,其范圍在102~106CFU/mL之間。適配體的高特異性與高親和力的特點,使其可以很好地用于識別和捕獲靶標(biāo)細(xì)菌,基于此可設(shè)計多種細(xì)菌分析方法。目前用于細(xì)菌檢測的適配體方法有酶聯(lián)免疫、同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、核酸染料、電化學(xué)傳感器、納米金顆粒、夾心法以及多適配體聯(lián)合等。

    4.1用適配體固定細(xì)菌的酶聯(lián)免疫分析

    為了從S.aureus和E.coliO157: H7的混合菌液中檢測Sal.typhimurium,將5′端標(biāo)記生物素的RNA適配體固定在包被有親和素的96孔板上,再將細(xì)菌樣品在96孔板上室溫孵育1 h,洗脫未結(jié)合的細(xì)菌后,加入該細(xì)菌特異性的抗體(一抗),再孵育、洗脫后,加入帶有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,再加入過氧化物酶底物溶液,在酶標(biāo)儀中檢測425 nm處的吸光值。利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)原理,以適配體取代抗體固定抗原,可定量分析Sal.typhimurium,而不受其他細(xì)菌干擾[19]。

    4.2放射性標(biāo)記適配體的液體閃爍計數(shù)法

    使用帶有同位素標(biāo)記的適配體,則可以免除后續(xù)一抗、二抗的使用,直接進(jìn)行檢測。如在小牛腸磷酸酶作用下將RNA適配體5′端脫磷酸后,用[γ-32P]ATP(腺苷三磷酸)在T4多聚核苷酸激酶作用下磷酸化,得到5′端有32P標(biāo)記的適配體。將待測的Sal.typhimurium包被在96孔板上,與帶有32P標(biāo)記的RNA適配體在室溫下共同孵育1 h,沖洗后用液體閃爍計數(shù)器測定與靶標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的帶有同位素標(biāo)記的適配體,從而對靶標(biāo)進(jìn)行定量,但是這種方法檢出限較高(106CFU/mL)[19]。

    4.3熒光標(biāo)記適配體的熒光光譜法

    除了同位素標(biāo)記,也可以在適配體上修飾熒光基團(tuán),用雙適配體夾心法進(jìn)行細(xì)菌分析。如將生物素修飾的適配體包被在96孔板上,與靶標(biāo)志賀氏菌在室溫下共同孵育1 h,沖洗去除未結(jié)合的志賀氏菌后,加入帶有FAM熒光標(biāo)記的適配體在室溫下孵育1 h,沖洗2次后測定熒光強(qiáng)度,檢出限可達(dá)50 CFU/mL,并且在102~107CFU/mL范圍內(nèi)都有良好的線性關(guān)系(R2=0.995 4)[22]。

    4.4量子點標(biāo)記適配體的熒光光譜法

    與使用熒光基團(tuán)標(biāo)記類似,在適配體上可以修飾量子點標(biāo)記。Duan等[32]將帶有量子點標(biāo)記的適配體與靶細(xì)胞V.parahaemolyticus或Sal.typhimurium在37 ℃下共同孵育1 h后,于3 000 r/min下離心除去未結(jié)合的適配體。使用流式細(xì)胞儀對適配體-細(xì)菌復(fù)合物進(jìn)行分離計數(shù)。此外,用于針對兩種不同細(xì)菌的適配體上分別修飾了535 nm和585 nm兩種不同的量子點標(biāo)記,在流式細(xì)胞分選時可以同時檢測兩種細(xì)菌。相對于熒光基團(tuán)標(biāo)記,量子點熒光的發(fā)射波長有更多的選擇,有利于多通道檢測,能夠?qū)崿F(xiàn)同時檢測多種細(xì)菌。

    4.5上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒修飾適配體的熒光光譜法

    上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒(upconversion nanoparticles, UCNP)利用反-斯托克斯發(fā)光(anti-Stokes)產(chǎn)生長壽命熒光,可以有效排除背景中細(xì)菌自發(fā)短壽命熒光的干擾,提高熒光信號的信噪比。Wu等[33]使用多色UCNP分別標(biāo)記了針對S.aureus、V.parahaemolyticus和S.typhimurium的適配體,結(jié)合磁分離技術(shù),在牛奶、對蝦樣品中同時檢測這3種致病菌,結(jié)果與傳統(tǒng)平板計數(shù)法一致。

    4.6核酸染料輔助的適配體檢測方法

    AccuBlue染料可以與雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光,但它單獨(dú)存在時或與ssDNA結(jié)合后產(chǎn)生的熒光較弱。將AccBlue染料、適配體、與適配體互補(bǔ)的ssDNA結(jié)合使用,可以用于細(xì)菌的定量檢測[34]。檢測方法分為兩種模式:(1)“signal on”模式。將靶標(biāo)細(xì)菌與一定量的適配體共同孵育,形成靶標(biāo)-適配體復(fù)合物,再加入適配體的互補(bǔ)序列與AccBlue染料,體系中游離的適配體與互補(bǔ)序列形成dsDNA,結(jié)合染料后產(chǎn)生熒光,測定熒光強(qiáng)度的增加即可知游離的適配體濃度,進(jìn)而推算靶標(biāo)濃度。(2)“signal off”模式。將適配體與其互補(bǔ)序列先形成dsDNA與AccBlue染料產(chǎn)生熒光,再加入靶標(biāo)細(xì)菌與互補(bǔ)序列競爭結(jié)合適配體,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度隨著dsDNA的減少而降低。對V.parahaemolyticus和S.typhimurium的檢出限分別達(dá)到35 CFU/mL和25 CFU/mL。由于是通過dsDNA間接測定適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的濃度,因此針對不同樣品需要對核酸染料的用量進(jìn)行優(yōu)化,才能得到較顯著的熒光強(qiáng)度的變化,以保證檢測的特異性和靈敏度。

    4.7雙適配體夾心法

    雙適配體夾心法(aptamer-based sandwich assay, ABSA)將適配體固定在96孔板上,加入樣品孵育30 min后,沖洗除去未結(jié)合的細(xì)菌,再加入帶有熒光修飾的適配體孵育,沖洗去除游離的適配體后測定熒光強(qiáng)度。Lee等[17]使用L.monocytogenes的適配體對不同濃度的靶標(biāo)細(xì)菌的菌懸液進(jìn)行了測定,線性范圍為20~200 000 CFU/mL(R2=0.99)。

    4.8多適配體聯(lián)合的熒光成像法

    細(xì)菌表面的蛋白質(zhì)、多糖以及鞭毛等都有可能成為適配體作用的靶標(biāo)。故對同一細(xì)菌有可能篩選到針對蛋白質(zhì)、多糖以及鞭毛等多種靶標(biāo)的不同適配體。將這些適配體聯(lián)合使用,有助于對全細(xì)胞的高特異性結(jié)合,可以顯著提高檢測靈敏度與特異性。如Kim等[13]使用量子點標(biāo)記的3組不同適配體與E.coli結(jié)合,通過熒光成像發(fā)現(xiàn)這3組適配體可以同時非競爭性地與靶標(biāo)E.coli結(jié)合。聯(lián)合使用這3組適配體相對單獨(dú)使用一種適配體,對E.coli的檢出限從103CFU/mL降低到102CFU/mL。

    4.9適配體修飾的阻抗傳感器法

    適配體也可以與電化學(xué)檢測器聯(lián)用,從而提高靈敏度,進(jìn)一步降低檢出限。Labib等[18]將篩選得到的鼠傷寒沙門氏菌的適配體用硫醇修飾后,通過自組裝結(jié)合到納米金修飾的碳電極上。通過測定適配體與靶標(biāo)結(jié)合前后阻抗的變化,即可對靶標(biāo)進(jìn)行定量、定性分析。該方法可以從30 μL樣品中檢出最低18個細(xì)胞,且只檢測活的鼠傷寒沙門氏菌,對滅活的鼠傷寒沙門氏菌則沒有響應(yīng)。電化學(xué)的檢測方法有利于便攜檢測儀器的開發(fā)。

    4.10納米金顆粒的比色法

    先用納米金顆粒吸附鼠傷寒沙門氏菌或大腸埃希氏菌的適配體。當(dāng)這些適配體捕獲靶標(biāo)后,納米金顆粒會聚集沉淀,其溶液顏色由紅變紫,通過測定吸光度的變化,可對靶標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行定量。納米金顆粒對非靶標(biāo)的其他種屬的細(xì)菌如S.paratyphiA或金黃色葡萄球菌的吸附較少,故溶液顏色沒有變化。該方法的檢測特異性較好,但檢出限較高(105CFU/mL)[28]。

    5結(jié)論與展望

    細(xì)菌全細(xì)胞表面的分子組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜,具體信息未知。因此,利用全細(xì)胞篩選可以不受這些局限,針對其完整狀態(tài)篩選出可識別全細(xì)胞的適配體。提高細(xì)菌全細(xì)胞適配體篩選的成功率及其親和力和特異性,使適配體成為高效、穩(wěn)定的細(xì)菌識別分子,將是適配體廣泛用于細(xì)菌分析檢測的基礎(chǔ)。目前存在的問題是:(1)為保證適配體的高親和力,需要重復(fù)十幾甚至數(shù)十輪次的SELEX過程,篩選耗時長、步驟繁瑣、人力和財力成本很高。因缺少自動化的篩選方法和儀器,篩選輪次太多將使篩選的效率無法保證。(2)篩選過程中,難以監(jiān)測每輪次級庫的親和力變化。目前,除了CE方法便于連續(xù)監(jiān)測每輪篩選中次級庫的親和力變化外,其他篩選方法少有關(guān)于次級庫親和力變化的報道。(3)適配體的特異性高低在實際應(yīng)用中非常關(guān)鍵。特異性的提高受反向篩選的靶標(biāo)的影響。但目前反向篩選的靶標(biāo)選擇具有較大的隨意性,也缺少反向篩選靶標(biāo)對篩選特異性影響的研究?,F(xiàn)階段的主要解決方法是同時使用多種細(xì)胞作為反向篩選的靶標(biāo)以提高特異性。(4)適配體用于細(xì)菌檢測時的靈敏度還有很大的提升空間。使用熒光、同位素等手段標(biāo)記適配體,將其與其他傳感器、分析系統(tǒng)聯(lián)合使用,或利用針對同一靶標(biāo)的一組適配體代替單一適配體都可以降低檢出限。因此選擇合適的檢測方法將有助于改善適配體在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用效果。通過檢測方法的優(yōu)化,也可以在一定程度上降低對適配體親和力和特異性的要求。目前,細(xì)菌全細(xì)胞的適配體篩選方法研究還不充分,適配體在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用也還有很大的發(fā)展空間。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Green R, Ellington A D, Szostak J W. Nature, 1990, 347(6291): 406

    [2]Lee Y J, Han S R, Maeng J S, et al. Biochem Bioph Res Commun, 2012, 417(1): 414

    [3]McKeague M, McConnell E M, Cruz-Toledo J, et al. J Mol Evol, 2015, 81(5): 150

    [4]Torres-Chavolla E, Alocilja E C. Biosens Bioelectron, 2009, 24(11): 3175

    [5]Hamula C L A, Zhang H, Li F, et al. TrAC-Trends Anal Chem, 2011, 30(10): 1587

    [6]Amaya-González S, De-Los-Santos-Alvarez N, Miranda-Ordieres A J, et al. Sensors, 2013, 13(12): 16292

    [7]Gedi V, Kim Y P. Sensors, 2014, 14(10): 18302

    [8]McKeague M, Giamberardino A, Derosa M C. Environmental Biosensors. Ontario, Canada: In Tech, 2011: 17

    [9]Ozalp V C, Bilecen K, Kavruk M, et al. Future Microbiol, 2013, 8(3): 387

    [10]Fan M, McBurnett S R, Andrews C J, et al. Biomol Tech, 2008, 19(5): 311

    [11]Kim Y S, Song M Y, Jurng J, et al. Anal Biochem, 2013, 436(1): 22

    [12]Maeng J S, Kim N, Kim C T, et al. J Nanosci Nanotechnol, 2012, 12(7): 5138

    [13]Kim Y S, Chung J, Song M Y, et al. Biosens Bioelectron, 2014, 54(12): 195

    [14]Li H, Ding X, Peng Z, et al. Can J Microbiol, 2011, 57(6): 453

    [15]Hamula C L A, Zhang H, Guan L L, et al. Anal Chem, 2008, 80(20): 7812

    [16]Suh S H, Dwivedi H P, Choi S J, et al. Anal Biochem, 2014, 459: 39

    [17]Lee S H, Ahn J Y, Lee K A, et al. Biosens Bioelectron, 2015, 68: 272

    [18]Labib M, Zamay A S, Kolovskaya O S, et al. Anal Chem, 2012, 84(21): 8966

    [19]Han S R, Lee S W. J Microbiol Biotechnol, 2013, 23(6): 878

    [20]Duan N, Wu S, Chen X, et al. J Agric Food Chem, 2013, 61(13): 3229

    [21]Park H C, Baig I A, Lee S C, et al. Appl Biochem Biotech, 2014, 174(2): 793

    [22]Duan N, Ding X, Wu S, et al. Microbiol Meth, 2013, 94(3): 170

    [23]Han S R, Lee S W. Ann Microbiol, 2014, 64: 883

    [24]Chang Y C, Yang C Y, Sun R L, et al. Sci Rep-UK, 2013, 3: 1863

    [25]Turek D. World J Transl Med, 2013, 2(3): 67

    [26]Duan N, Wu S, Chen X, et al. J Agric Food Chem, 2012, 60: 4034

    [27]Degrasse J A. PLoS One, 2012, 7(3): 65

    [28]Wu W H, Li M, Wang Y, et al. Nanoscale Res Lett, 2012, 7(1): 658

    [29]Meng C, Zhao X, Qu F, et al. J Chromatogr A, 2014, 1358: 269

    [30]Shamah S M, Healy J M, Cload S T. Accounts Chem Res, 2008, 41(1): 130

    [31]Moon J, Kim G, Park S, et al. Sensors, 2015, 15(4): 8884

    [32]Duan N, Wu S, Ye Y, et al. Anal Chim Acta, 2013, 804(804C): 151

    [33]Wu S, Duan N, Shi Z, et al. Anal Chem, 2014, 86(6): 3100

    [34]Duan N, Wu S, Ma X, et al. Anal Biochem, 2014, 454(1): 1

    Research advances of aptamers selection for bacterium targets

    CHEN Erning1,2, ZHAO Xinying2, QU Feng1*

    (1. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China)

    Abstract:Aptamers are RNA or singal stranded DNA (ssDNA), which are selected by systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Compared to antibodies, aptamers as chemical antibodies are artificially synthesized with low cost. They can bind a wide range of targets, including small molecules, large biological molecules, bacteria and cells. Aptamers targeting bacteria have the potential to be used for pathogen detection in food, medicine and environment. To select aptamers with high affinity to bacteria, centrifugation is mostly used. Binding affinity can be estimated by fluorescence imaging, fluorescence spectra, flow cytometry, DNA capture element (DCE) and enzyme-linked aptamers sorbent assay (ELASA). Selected aptamers combined with biological and chemical analysis methods can be used in bacteria detection. This article introduces the latest development in aptamer selection, characterization and application for bacteria detection and summarizes the aptamers for bacteria from 2011 to 2015.

    Key words:aptamer; bacteria; selection; systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX); review

    中圖分類號:O658

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    文章編號:1000-8713(2016)04-0389-08

    基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(21175011,21375008);北京市科學(xué)技術(shù)研究院青年骨干計劃項目.

    *收稿日期:2015-12-17

    DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.12021

    多尺度靶標(biāo)的核酸適配體篩選研究進(jìn)展專欄

    ·專論與綜述

    *通訊聯(lián)系人.Tel:(010)68918015,E-mail:qufengqu@bit.edu.cn.

    Foundation item: National Nature Science Foundation of China (Nos. 21175011, 21375008); Key Youth Project of Beijing Academy of Science and Technology.

    猜你喜歡
    靶標(biāo)菌體復(fù)合物
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術(shù)探析
    東北酸菜發(fā)酵過程中菌體的分離與鑒定
    BeXY、MgXY(X、Y=F、Cl、Br)與ClF3和ClOF3形成復(fù)合物的理論研究
    “百靈”一號超音速大機(jī)動靶標(biāo)
    納米除草劑和靶標(biāo)生物的相互作用
    柚皮素磷脂復(fù)合物的制備和表征
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:18
    黃芩苷-小檗堿復(fù)合物的形成規(guī)律
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:18
    菌體蛋白水解液應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    黃芩苷對一株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌體內(nèi)外抗菌作用的研究
    復(fù)雜場景中航天器靶標(biāo)的快速識別
    亚洲天堂国产精品一区在线| 日本a在线网址| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品亚洲一级av第二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 后天国语完整版免费观看| 露出奶头的视频| 91av网一区二区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品亚洲美女久久久| 又黄又粗又硬又大视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产熟女xx| 国产精品久久电影中文字幕| 黄色视频,在线免费观看| 男人舔女人的私密视频| 看黄色毛片网站| 亚洲欧美激情综合另类| 国产成人精品久久二区二区91| 国产不卡一卡二| 99视频精品全部免费 在线 | 久久香蕉精品热| 麻豆一二三区av精品| 国产成人av教育| 日本免费a在线| 国产又色又爽无遮挡免费看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 最新美女视频免费是黄的| 午夜免费激情av| 久久久国产精品麻豆| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲色图av天堂| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲五月婷婷丁香| 男女床上黄色一级片免费看| 久久久久亚洲av毛片大全| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产日本99.免费观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 真人做人爱边吃奶动态| 国产伦在线观看视频一区| 波多野结衣高清无吗| 午夜精品一区二区三区免费看| 成人性生交大片免费视频hd| 精品国产乱码久久久久久男人| 日本 av在线| 97碰自拍视频| 精品不卡国产一区二区三区| 国产激情偷乱视频一区二区| av片东京热男人的天堂| 十八禁人妻一区二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 香蕉av资源在线| 嫩草影视91久久| 午夜两性在线视频| 成年版毛片免费区| 亚洲国产欧美网| 久久午夜综合久久蜜桃| 狂野欧美激情性xxxx| 女警被强在线播放| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 午夜免费观看网址| 日本与韩国留学比较| 日韩中文字幕欧美一区二区| 少妇的逼水好多| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产69精品久久久久777片 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产成人啪精品午夜网站| 99精品久久久久人妻精品| 丝袜人妻中文字幕| 久久中文字幕人妻熟女| 久久中文看片网| 美女午夜性视频免费| 波多野结衣高清无吗| 三级国产精品欧美在线观看 | 露出奶头的视频| 两个人视频免费观看高清| 中文字幕熟女人妻在线| 日韩欧美三级三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美日韩黄片免| 757午夜福利合集在线观看| 一本综合久久免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产激情久久老熟女| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产男靠女视频免费网站| 男人的好看免费观看在线视频| 国产午夜精品久久久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜福利在线在线| 三级国产精品欧美在线观看 | 91av网站免费观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 五月玫瑰六月丁香| 国产高清激情床上av| 男人舔女人下体高潮全视频| 男女午夜视频在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 免费看光身美女| 在线观看舔阴道视频| 看片在线看免费视频| 国产成人av激情在线播放| 国产激情久久老熟女| 国产单亲对白刺激| 精品熟女少妇八av免费久了| 美女cb高潮喷水在线观看 | 脱女人内裤的视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 九色国产91popny在线| 91老司机精品| 美女被艹到高潮喷水动态| 脱女人内裤的视频| 国产精品电影一区二区三区| 一级毛片女人18水好多| xxx96com| 久久午夜综合久久蜜桃| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品久久电影中文字幕| 99热这里只有精品一区 | 亚洲av成人精品一区久久| 级片在线观看| 在线播放国产精品三级| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产成人欧美在线观看| www国产在线视频色| 国产精品久久电影中文字幕| 国产人伦9x9x在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 级片在线观看| 欧美大码av| 日本一本二区三区精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 成人欧美大片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 岛国在线观看网站| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产午夜福利久久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 男人舔奶头视频| 我的老师免费观看完整版| 午夜两性在线视频| 亚洲专区国产一区二区| 曰老女人黄片| 国产黄片美女视频| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品乱码一区二三区的特点| 搡老熟女国产l中国老女人| 人人妻人人看人人澡| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久久久久久免费视频了| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美极品一区二区三区四区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美丝袜亚洲另类 | 中文字幕熟女人妻在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一夜夜www| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 搡老熟女国产l中国老女人| 人人妻人人看人人澡| 日日夜夜操网爽| 一本精品99久久精品77| 久久伊人香网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲av片天天在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 级片在线观看| 亚洲美女黄片视频| 黄色日韩在线| 国产精品久久电影中文字幕| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品永久免费网站| 制服人妻中文乱码| 九色国产91popny在线| 亚洲avbb在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 老司机午夜十八禁免费视频| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲人与动物交配视频| 操出白浆在线播放| 操出白浆在线播放| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久国产成人精品二区| 欧美3d第一页| 亚洲男人的天堂狠狠| 天堂影院成人在线观看| 怎么达到女性高潮| 国产伦精品一区二区三区四那| 看黄色毛片网站| 亚洲国产欧美网| 韩国av一区二区三区四区| 一个人看的www免费观看视频| 国产亚洲av高清不卡| 黄色成人免费大全| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久久久久久黄片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 丰满人妻一区二区三区视频av | 欧美3d第一页| 精品无人区乱码1区二区| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 伦理电影免费视频| 天堂网av新在线| 国产激情偷乱视频一区二区| www日本在线高清视频| h日本视频在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 国产高清有码在线观看视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 中出人妻视频一区二区| 免费看十八禁软件| 后天国语完整版免费观看| 亚洲精华国产精华精| 久久精品91无色码中文字幕| 麻豆av在线久日| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲熟妇熟女久久| 视频区欧美日本亚洲| 麻豆av在线久日| 免费在线观看亚洲国产| 午夜久久久久精精品| 欧美日韩国产亚洲二区| 两个人的视频大全免费| www日本黄色视频网| 午夜免费观看网址| 一级a爱片免费观看的视频| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩精品青青久久久久久| 国内精品美女久久久久久| 亚洲真实伦在线观看| 美女午夜性视频免费| 十八禁网站免费在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 日韩高清综合在线| e午夜精品久久久久久久| 色尼玛亚洲综合影院| 一级毛片高清免费大全| 亚洲国产高清在线一区二区三| 男人舔女人的私密视频| 久久久成人免费电影| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 亚洲美女黄片视频| 亚洲国产看品久久| 岛国视频午夜一区免费看| 极品教师在线免费播放| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲人成电影免费在线| 美女 人体艺术 gogo| 最近最新中文字幕大全电影3| 搞女人的毛片| 男人舔女人的私密视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美在线一区亚洲| 最新在线观看一区二区三区| 99热精品在线国产| 韩国av一区二区三区四区| 九九在线视频观看精品| 国产一区二区在线观看日韩 | 可以在线观看毛片的网站| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 精品国产亚洲在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 一进一出好大好爽视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 中亚洲国语对白在线视频| 两人在一起打扑克的视频| 真实男女啪啪啪动态图| av天堂中文字幕网| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久国产精品麻豆| 久久久久久久精品吃奶| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品 欧美亚洲| 人人妻人人看人人澡| 九九在线视频观看精品| 国产高清激情床上av| 黄色视频,在线免费观看| 我要搜黄色片| 黄色片一级片一级黄色片| 精品一区二区三区av网在线观看| 一个人看的www免费观看视频| av国产免费在线观看| 舔av片在线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美中文日本在线观看视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产 一区 欧美 日韩| 搞女人的毛片| 午夜两性在线视频| 午夜福利高清视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 色吧在线观看| 舔av片在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 中文字幕最新亚洲高清| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 久久中文字幕人妻熟女| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲av片天天在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99热只有精品国产| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲男人的天堂狠狠| 中文字幕av在线有码专区| 欧美日韩黄片免| av欧美777| 亚洲黑人精品在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 伦理电影免费视频| 成人国产综合亚洲| 国产野战对白在线观看| 午夜福利免费观看在线| 亚洲成av人片免费观看| 日本三级黄在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲 国产 在线| 亚洲中文av在线| 国产亚洲精品久久久com| 国产人伦9x9x在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 成人三级做爰电影| 国产毛片a区久久久久| 精华霜和精华液先用哪个| 两个人视频免费观看高清| 伦理电影免费视频| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜视频精品福利| 久久久久久久午夜电影| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲国产欧美人成| 精品一区二区三区视频在线 | e午夜精品久久久久久久| 日本一本二区三区精品| 欧美日韩综合久久久久久 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 黄色 视频免费看| 亚洲激情在线av| 国产真实乱freesex| 日韩欧美在线乱码| www.自偷自拍.com| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产探花在线观看一区二区| 男人舔奶头视频| 亚洲熟妇熟女久久| 三级毛片av免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 国产亚洲欧美98| 无限看片的www在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 两性夫妻黄色片| 一级毛片高清免费大全| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久精品欧美日韩精品| 99久久精品国产亚洲精品| 99国产精品一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av视频在线观看入口| 少妇的丰满在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲,欧美精品.| 99精品久久久久人妻精品| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩欧美免费精品| 成人亚洲精品av一区二区| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品在线观看二区| 九九热线精品视视频播放| 最近在线观看免费完整版| 淫妇啪啪啪对白视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 丰满的人妻完整版| 日韩av在线大香蕉| 日韩欧美在线二视频| 超碰成人久久| 91av网一区二区| www.www免费av| 亚洲人成网站高清观看| 国产一区二区三区视频了| 亚洲av电影在线进入| 精品久久久久久成人av| 999久久久精品免费观看国产| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| e午夜精品久久久久久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 99久久国产精品久久久| 久久精品国产综合久久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产成人福利小说| 久久久色成人| 一级毛片高清免费大全| 久久久国产欧美日韩av| 日本免费a在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 中文亚洲av片在线观看爽| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 中文字幕高清在线视频| 嫩草影视91久久| 亚洲七黄色美女视频| 天堂影院成人在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 我要搜黄色片| 真实男女啪啪啪动态图| 国产三级中文精品| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲美女黄片视频| 俺也久久电影网| 午夜激情欧美在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 香蕉国产在线看| 香蕉久久夜色| 午夜免费观看网址| 欧美乱妇无乱码| 中文资源天堂在线| 色哟哟哟哟哟哟| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久久久久国产a免费观看| 1024手机看黄色片| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产三级在线视频| 欧美成人性av电影在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产男靠女视频免费网站| a级毛片在线看网站| 亚洲av片天天在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久午夜亚洲精品久久| netflix在线观看网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产成人av激情在线播放| 国产精品影院久久| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产99白浆流出| 久久久久久久午夜电影| 成人18禁在线播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 给我免费播放毛片高清在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费高清视频大片| 欧美成人免费av一区二区三区| 悠悠久久av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 99久久精品热视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 最新在线观看一区二区三区| 动漫黄色视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 免费看日本二区| 一级黄色大片毛片| 国产一区二区激情短视频| 狂野欧美激情性xxxx| 精品不卡国产一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 免费av不卡在线播放| 免费大片18禁| 久久人妻av系列| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产av麻豆久久久久久久| 五月伊人婷婷丁香| 在线观看日韩欧美| 99视频精品全部免费 在线 | 99国产精品99久久久久| 国产精品一及| 国产日本99.免费观看| 91老司机精品| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | av天堂在线播放| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产探花在线观看一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 大型黄色视频在线免费观看| 午夜免费激情av| 又黄又爽又免费观看的视频| 天堂√8在线中文| 日本三级黄在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 一级作爱视频免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 香蕉丝袜av| 99久久精品一区二区三区| 宅男免费午夜| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 99久久久亚洲精品蜜臀av| 天天躁日日操中文字幕| 香蕉久久夜色| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 最新美女视频免费是黄的| 一进一出好大好爽视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日韩欧美国产一区二区入口| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久中文字幕人妻熟女| 久久午夜综合久久蜜桃| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 午夜福利18| 美女 人体艺术 gogo| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品久久久久久久末码| 日韩精品中文字幕看吧| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中文字幕高清在线视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 观看免费一级毛片| 日韩欧美三级三区| www.熟女人妻精品国产| 在线观看一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人国产一区最新在线观看| 欧美色视频一区免费| 国产99白浆流出| 午夜福利视频1000在线观看| 麻豆成人av在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日韩国内少妇激情av| 亚洲九九香蕉| 一级毛片精品| 国产av不卡久久| 日韩欧美国产在线观看| 热99在线观看视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 啦啦啦免费观看视频1| 国产v大片淫在线免费观看| 最好的美女福利视频网| 久久久久性生活片| 男人舔奶头视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 三级国产精品欧美在线观看 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 九色成人免费人妻av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 在线观看一区二区三区| 女人被狂操c到高潮| 国产精品影院久久| 日韩精品青青久久久久久| 黄色片一级片一级黄色片| 国产99白浆流出| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲黑人精品在线| 日韩国内少妇激情av| 成人午夜高清在线视频| 欧美乱色亚洲激情| 午夜福利免费观看在线| 麻豆一二三区av精品| 天天添夜夜摸| 亚洲av片天天在线观看| av在线天堂中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| 成在线人永久免费视频| 中文资源天堂在线| 观看美女的网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 18禁美女被吸乳视频| 99国产精品一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 99国产精品一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久久久国内视频| 久久精品91蜜桃| 麻豆国产av国片精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美又色又爽又黄视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲精品一区av在线观看| www国产在线视频色|