基于UPC—Q/TOF—MS技術(shù)的果糖誘導(dǎo)高尿酸血癥大鼠血清脂質(zhì)代謝組學(xué)研究お

張淑麗 王怡萍 杜振霞 薛夢(mèng)?┱漚開(kāi)┞砣?

[摘要]利用脂質(zhì)代謝組學(xué)技術(shù)，研究果糖誘導(dǎo)高尿酸血癥大鼠與正常大鼠血清中脂類代謝物的變化，篩選出與高尿酸血癥相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物。通過(guò)超高效合相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPC2Q/TOFMS）技術(shù)分析高尿酸血癥大鼠（模型組）和正常大鼠（對(duì)照組）血清代謝譜圖，采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法比較2組的代謝譜差異，篩選出差異性代謝物。結(jié)果顯示，模型組和對(duì)照組的代謝譜圖存在明顯差異，并篩選出11個(gè)差異代謝物，利用精確質(zhì)量數(shù)結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜圖初步確定了花生四烯酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸等8種潛在生物標(biāo)記物。該文建立了基于UPC2Q/TOFMS技術(shù)進(jìn)行果糖誘導(dǎo)高尿酸血癥大鼠血清脂質(zhì)代謝組學(xué)研究的方法，推測(cè)脂肪酸代謝異?？赡芘c高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，為高尿酸血癥的早期診斷和預(yù)防奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]果糖；高尿酸血癥；脂質(zhì)代謝組學(xué)；生物標(biāo)記物

近年來(lái)隨著人們生活水平和飲食結(jié)構(gòu)的改變，高尿酸血癥及其相關(guān)疾病的發(fā)病率也急劇增加[1]。作為世界范圍內(nèi)一般人群中患病率較高的代謝性疾病，高尿酸血癥在當(dāng)前并未引起足夠重視[2]。毒理病理學(xué)研究證實(shí)，脂代謝紊亂與代謝性疾病如糖尿病、腎病等具有相關(guān)性[34]，例如，尿酸與血脂代謝紊亂之間存在密切關(guān)系[58]。脂質(zhì)代謝組學(xué)（lipidomics）作為最重要的代謝組學(xué)分支，在脂質(zhì)代謝疾病的預(yù)防和診斷，脂質(zhì)生物標(biāo)志物、藥物靶點(diǎn)的鑒定以及藥物研發(fā)等方面都取得了重要進(jìn)展[910]。

高尿酸血癥和痛風(fēng)患病率的增加與含果糖飲料的消耗增加有關(guān)[1112]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明，與其他糖類不同，高果糖飲食可引起嚙齒類動(dòng)物血尿酸水平快速升高[1316]，因此本實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)造模方法[17]。本文應(yīng)用建立的UPC2Q/TOFMS脂質(zhì)代謝組學(xué)方法研究果糖誘導(dǎo)高尿酸血癥大鼠血清代謝物的改變，確定其潛在的生物標(biāo)記物，以期為高尿酸血癥的早期診斷和預(yù)防提供依據(jù)。

1材料與方法

11儀器與試劑超高效合相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPC2Q/TOFMS，美國(guó)Waters公司）；ACQUITY UPC2TM HSS C18 SB色譜柱（30 mm×100 mm，18 μm）；低溫高速離心機(jī)（GL21M，上海盧湘儀公司）。

D果糖（AMRESCO）；血尿酸試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150227）；甲酸、醋酸銨、異丙醇（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；氯仿、甲醇、乙腈均為分析純；超純水（MilliQ純水機(jī)自制，美國(guó)Millipore公司）。

12動(dòng)物分組與造模SD大鼠，雄性，體重（240±20） g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）20120001。

SD雄性大鼠16只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組8只，喂飼普通飼料，同時(shí)對(duì)照組飲去離子水，模型組飲10%果糖水。2組動(dòng)物均自由飲食、飲水，飼料和水每天更換1次，并記錄飲水量。造模期間，每7 d尾靜脈取血一次，連續(xù)21 d。

13生化學(xué)檢查取靜脈血1 mL，按尿酸試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

14樣本的預(yù)處理與UPC2Q/TOFMS分析條件靜脈血3 mL，于4 ℃下4 000 r·min-1離心15 min，取上清液放入-20 ℃冰箱待用。取80 μL血清加入15 mL EP管中，加入320 μL氯仿甲醇（3∶1）渦旋2次，每次15 s，10 000 r·min-1常溫離心10 min，取上清液10 μL注入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。

色譜條件：ACQUITY UPC2TM HSS C18 SB色譜柱（30 mm×100 mm，18 μm）；流動(dòng)相A為CO2，流動(dòng)相B為02%甲酸[異丙醇甲醇（6∶1）溶液]，梯度洗脫，0～05 min，99%A，05～9 min，99%～60%A，9～10 min，60%A，10～11 min，60%～99%A，11～13 min，99%A，流速15 mL·min-1；柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用Xevo G2S QTOFMS質(zhì)譜系統(tǒng)，掃描范圍m/z 50～1 200，離子化模式電噴霧電離（ESI），采用負(fù)離子V模式檢測(cè)，毛細(xì)管電壓2 500 V，離子源溫度120 ℃，霧化氣溫度450 ℃，錐孔氣流速50 L·h-1。

15數(shù)據(jù)處理利用Markerlynx V 41軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和歸一化處理，應(yīng)用SIMCAP 1303軟件（Umctrics Sweden）對(duì)樣品進(jìn)行分組和（正交）偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）。分析結(jié)果以二維和三維得分圖和Splot圖表示。以VIP>1的成分作為對(duì)模型具有明顯值貢獻(xiàn)的標(biāo)記物。組間比較采用t檢驗(yàn)，篩選P<005的數(shù)據(jù)得到有意義的變量。

2結(jié)果

21生化指標(biāo)造模第7天時(shí)，2組血清尿酸值開(kāi)始出現(xiàn)明顯差異（P<001）。造模14，21 d后的2組血清尿酸值保持明顯差異（P<005），說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)期間模型穩(wěn)定，選擇造模7 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行脂質(zhì)代謝組學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

22血清樣品的LCMS分析利用ESI負(fù)離子模式分別采集對(duì)照組和模型組大鼠血清樣本數(shù)據(jù)，得到血清樣本的BPI圖，見(jiàn)圖1。所有代謝物在13 min內(nèi)就能得到很好的分離，且2組的輪廓明顯不同。為保證數(shù)據(jù)的可靠性，在數(shù)據(jù)采集過(guò)程中，每間隔6個(gè)樣品，使用質(zhì)控樣品進(jìn)樣1次，以監(jiān)測(cè)采集系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

23數(shù)據(jù)分析采用OPLSDA對(duì)Markerlynx導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分型，結(jié)果見(jiàn)圖2，3。各組血清數(shù)據(jù)分析的Splot圖見(jiàn)圖4，模型組與對(duì)照組分離明顯，S型曲線兩端的數(shù)據(jù)對(duì)分別代表每個(gè)樣本組可信度最高的特征離子，即潛在生物標(biāo)記物。

24生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)與鑒定經(jīng)OPLSDA分析，選取VIP>1的差異變量，采用t檢驗(yàn)對(duì)篩選的差異變量在對(duì)照組與模型組進(jìn)行驗(yàn)證，只有P<005的變量可作為與高尿酸血癥大鼠相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物，參照有關(guān)文獻(xiàn)并根據(jù)一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，利用HMDB（http：//wwwhmdbca/）和LIPID MAPS（http：//wwwlipidmapsorg/）等數(shù)據(jù)庫(kù)，以m/z 303277 4的離子為例，使用精確相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)檢索，再通過(guò)ESI負(fù)模式下的二級(jí)碎裂方式推測(cè)代謝物結(jié)構(gòu)，碎裂方式為：m/z 303277 4 [M-H]-，25956[M-CH2O3-H]-，5893[C2H3O2]-，見(jiàn)圖5。通過(guò)LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫(kù)MS/MS譜圖和花生四烯酸對(duì)照品對(duì)比，m/z 303277 4的離子被鑒定為花生四烯酸，其他10種代謝物使用類似方法鑒別，見(jiàn)表 2。

3討論與結(jié)論

UPC2Q/TOFMS技術(shù)在分離能力、分析時(shí)間及靈敏度方面較常規(guī)液質(zhì)聯(lián)用（LCMS）有很大優(yōu)勢(shì)，分析鑒定能力強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)快速分離，能獲得包含更多數(shù)目的代謝譜圖[18]。其無(wú)需對(duì)脂質(zhì)樣品進(jìn)行衍生化處理[19]，直接有機(jī)相溶解后進(jìn)樣分析，簡(jiǎn)化了工作流程，同時(shí)可快速解析出脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇UPC2QTOF/MS的脂質(zhì)代謝組學(xué)技術(shù)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂肪酸FA（C16∶1），F(xiàn)A（C16∶0），F(xiàn)A（C18∶1）含量模型組高于對(duì)照組，F(xiàn)A（C20∶4），F(xiàn)A（C24∶0），F(xiàn)A（C24∶1）含量低于對(duì)照組。

脂肪酸的合成與利用，加速ATP的分解，使HUA生成增加，從而產(chǎn)生高尿酸血癥[20]。飽和脂肪酸攝入過(guò)多是導(dǎo)致高胰島素血癥的危險(xiǎn)因素[21]，尤其是棕櫚酸（C16∶0）[6]。另外不飽和脂肪酸花生四烯酸、類花生酸類物質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化物的快速產(chǎn)生和蓄積，而花生四烯酸是體內(nèi)白三烯生物合成的前體物質(zhì)，白三烯與許多炎癥有關(guān)，包括痛風(fēng)[22]。有研究表明血清脂肪酸在反映機(jī)體脂代謝方面比TG，TC敏感，在單純高尿酸血癥階段，需注意檢測(cè)血清脂肪酸濃度的變化，盡早糾正血清脂肪酸及脂代謝紊亂，避免動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂肪酸代謝異?？赡芘c高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，從脂質(zhì)代謝組學(xué)角度為高尿酸血癥與代謝綜合征的相關(guān)性提供了依據(jù)。

本研究應(yīng)用UPC2Q/TOFMS的脂質(zhì)代謝組學(xué)方法分析果糖誘導(dǎo)高尿酸血癥大鼠與正常大鼠血清的脂類代謝物變化，并對(duì)其進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥大鼠模型血清中脂肪酸類成分發(fā)生變化。該方法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，工作流程簡(jiǎn)化，達(dá)到快速區(qū)分高尿酸血癥大鼠和對(duì)照組大鼠的目的，并發(fā)現(xiàn)了部分潛在生物標(biāo)記物，為從代謝通路的角度闡述其發(fā)病機(jī)制及高尿酸血癥的早期診斷和預(yù)防奠定了基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯曹陽(yáng)陽(yáng)]