軟烤貽貝加工過程中微生物的控制

渠飛翔，李學英，楊憲時*，遲海

1(中國水產(chǎn)科學研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)　2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

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軟烤貽貝加工過程中微生物的控制

渠飛翔1,2，李學英1，楊憲時1*，遲海1

1(中國水產(chǎn)科學研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

摘要模擬軟烤貽貝加工過程，對工藝參數(shù)(溫度和時間、水分含量和水分活度以及pH)和微生物變化(細菌數(shù)量與組成)進行相關性分析，探討了加工過程中微生物的控制。結(jié)果表明，軟烤貽貝加工中菌落總數(shù)呈現(xiàn)顯著下降趨勢，而耐熱菌數(shù)只是略有降低，說明3次熱冷交替主要殺滅的是非耐熱菌，并且成品殘存菌數(shù)在300 CFU/g內(nèi)，經(jīng)鑒定主要是蠟樣芽孢桿菌。溫度和時間以及水分活度(或水分含量)的控制顯著影響著菌落總數(shù)的變化，但pH無顯著影響主要是協(xié)同效應。焙干和烘烤階段、調(diào)味浸漬過程分別是水分含量和水分活度、pH控制的關鍵工序，可以確定為微生物危害控制的關鍵控制點，此外安全生產(chǎn)全過程溫度和時間要嚴格控制，尤其3次熱冷交替。

關鍵詞軟烤貽貝；加工；微生物控制；工藝參數(shù)；柵欄因子

貽貝，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，享有“海中雞蛋”的美稱[1-2]，目前在我國貽貝以鮮銷為主，鮮品容易變質(zhì)且安全與營養(yǎng)不易保證，主要加工品(即淡菜)附加值低而且失去鮮品品質(zhì)[3-4]。為此，我們開發(fā)了附加值高的新型溫和加工產(chǎn)品即軟烤貽貝，該產(chǎn)品營養(yǎng)豐富、軟硬適口、色澤誘人并且貨架期較長，受到消費者的廣泛歡迎[5-6]。但是該產(chǎn)品處理條件溫和，常存在微生物危害的潛在風險，控制不當甚至殘存致病菌，若不加以全過程控制，軟烤貽貝微生物安全難以保證[7]。賈艷華、王煥慶等[8-9]分別研究了水分含量和水分活度的控制對軟烤扇貝和南美白對蝦品質(zhì)變化、菌相組成及貯藏性的影響，突出了加工過程中微生物安全保證中水分含量和水分活度控制的重要性。陳舒等[7]通過分析軟烤扇貝加工過程中細菌變化發(fā)現(xiàn)溫度和時間、pH的控制也對微生物變化影響較大。溫度、水分活度和pH及其協(xié)同效應是影響微生物生長的重要因素[10-11]，基于柵欄效應理論，加工全過程工藝參數(shù)(溫度和時間、水分含量和水分活度以及pH)必須嚴格控制，才能保證產(chǎn)品微生物安全[7,10-11]，但軟烤貽貝加工全過程微生物控制有關研究未見報道。

本研究模擬軟烤貽貝的加工全過程，測定和分析加工過程中微生物有關工藝參數(shù)(溫度、時間、水分含量和水分活度以及pH)，并通過相關性分析方法探討工藝參數(shù)對產(chǎn)品微生物變化(細菌數(shù)量與組成)的影響，分析了加工過程中微生物控制有關問題，為軟烤貽貝加工過程工藝優(yōu)化與安全控制提供數(shù)據(jù)參考和理論支持。

1材料和方法

1.1材料與試劑

單凍貽貝，購于東方國際水產(chǎn)中心，由冷庫0.5 h內(nèi)運抵實驗室，放入-20 ℃冰箱備用。調(diào)味料，購于卜蜂蓮花超市。營養(yǎng)瓊脂，北京陸橋技術有限責任公司；GPID測試板，英國TREK Diagnostic Systems LTD；革蘭氏染色液試劑盒、液體石蠟油(CP)、氯化鈉(分析純)等，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器

MPR-414F型冰箱，日本Sanyo公司；9240MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博正實業(yè)有限公司；YXD-8B型烤箱，廣州市花都區(qū)新粵海西廚設備廠；DZQ400-2D真空(充氣)包裝機，上海余特包裝機械制造有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；JYL-350型絞肉機，上海九陽股份有限公司；LabMASTER-Aw型水分活度儀，瑞士Novasina 公司； pHS-2C 型酸度計，上海偉業(yè)儀器廠；JM624探針測溫儀，天津今明儀器有限公司；830-T2紅外測溫儀，德國Testo集團；SEX-TJ系列凈化工作臺，上海整新電子設備；拍擊式均質(zhì)機，西班牙IUL公司；YXQ-LS-50SII型全自動立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JLQ-S1型菌落計數(shù)器，無錫市安全滑觸線有限公司；CX41RF型生物顯微鏡，日本Olympus 公司；微生物鑒定和藥敏分析儀，英國TREK Diagnostic Systems 公司。

1.3實驗方法

1.3.1樣品制備及其加工工序

A解凍：貽貝噴淋解凍4 min，凈水漂洗3次，每次1 min；B調(diào)味浸漬：貽貝放入裝有含適當比例白砂糖、食鹽、檸檬酸和味精等的調(diào)味料溶液(料液比3∶2)的盆中浸漬調(diào)味并放置12 h(8 ℃冷藏室中)；C焙干：貽貝擺盤后在80 ℃干燥箱中焙干并冷卻(5 ℃冷藏室中)；D烘烤：在170 ℃烤箱中烘烤貽貝5 min并冷卻(5 ℃冷藏室中)；E二次殺菌：貽貝真空包裝后90 ℃水浴殺菌1 h并冷卻(5 ℃冷藏室中)。下文將各加工工序簡寫為A-E。

1.3.2溫度測定

貽貝產(chǎn)品的溫度用探針式溫度計測定其中心溫度，部分不便環(huán)節(jié)(如烘烤、殺菌等環(huán)節(jié))，使用紅外測溫儀測定其表面溫度。

1.3.3水分含量和水分活度測定

水分含量按照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》中105 ℃恒質(zhì)量法測定；水分活度采用GB/T 23490—2009《食品中水分活度的測定》中的水分活度儀擴散法測定。

1.3.4pH測定

稱取10 g已絞碎貽貝加入90 mL無CO2的去離子水，攪拌，浸漬30 min后測pH，平行3次。

1.3.5菌落總數(shù)測定

在無菌室中操作，稱取25 g絞碎貽貝，放入無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)，制得10-1混懸液，并將其依次進行10倍梯度稀釋。選擇2～3個適宜稀釋度的混懸液，涂布平板，置于37 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)，每個稀釋度做2個平行[12]。

1.3.6耐熱菌數(shù)測定

取10-1混懸液10 mL于試管中，85 ℃水浴保溫30 min后，冰水混合物冷卻1 h后測定菌落總數(shù)[7]。

1.3.7細菌分離、純化與鑒定

從二次殺菌前后的培養(yǎng)基中挑選菌落數(shù)在30～150的平板，按照菌落的形態(tài)特征分組，并對每組進行微生物計數(shù)，對每組再劃線分離和純化，37 ℃培養(yǎng)48 h，重復劃線分離、純化和培養(yǎng)，所有純化后的細菌先進行革蘭氏染色初步鑒定，然后利用Sensititre細菌鑒定系統(tǒng)進行上機鑒定[12]。

1.3.8數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)主要通過采用SPSS 20.0和Origin 9.0進行相關處理與分析，其中相關性與顯著性主要通過SPSS 20.0分析，圖形主要通過Origin 9.0繪制，但溫度-時間履歷圖采用Auto CAD 2014繪制。圖表中數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準差，同一指標差異顯著(P<0.05)，使用不同英文小寫字母表示，否則使用相同字母。

2結(jié)果與討論

2.1軟烤貽貝加工過程溫度-時間履歷

軟烤貽貝加工過程溫度-時間履歷，見圖1。采用噴淋解凍控制貽貝中心溫度為-2～0 ℃，使用食鹽、白砂糖、檸檬酸等調(diào)味浸漬貽貝并在8 ℃冷藏室內(nèi)放置12 h，低溫冷藏協(xié)同逐漸降低的pH和水分活度來減緩微生物的生長繁殖。瀝干水分后擺盤并焙干、冷卻、烘烤、冷卻、真空包裝、水浴殺菌和冷卻，也就是軟烤貽貝加工過程中的3次熱冷交替，殺死絕大部分的非耐熱菌和一些耐熱菌(例如葡萄球菌等)，顯著影響著菌落總數(shù)的變化，使成品殘存菌數(shù)在300 CFU/g以內(nèi)。焙干時貽貝的溫度約60 ℃，烘烤時溫度約83 ℃，殺菌時溫度約77 ℃，熱處理比較溫和，再加上適度降低的pH和水分活度，處理條件溫和，說明軟烤貽貝是一種溫和加工產(chǎn)品。但溫和熱處理仍能殺死絕大部分細菌，保證產(chǎn)品微生物安全，主要因為熱冷交替和調(diào)味過程中加入的適量的食鹽、白砂糖、檸檬酸等調(diào)味料使微生物的致死溫度降低[6]，同時也說明在軟烤貽貝微生物控制中也離不開水分活度和水分含量以及pH的調(diào)控。

圖1　軟烤貽貝加工過程溫度-時間履歷Fig.1　Tempratue-time antecedents of light-baked mussels during process

2.2軟烤貽貝加工過程中水分含量和水分活度變化

相關性分析顯示菌落總數(shù)與水分活度(或水分含量)的變化顯著正相關(r>0.950，P<0.05)，所以軟烤貽貝中微生物控制過程中水分活度(或水分含量)有必要降低，水分含量與水分活度的變化如圖2。

圖2　軟烤貽貝加工過程中水分含量與水分活度變化Fig.2　Changes in moisture content and water activity of light-baked mussels during process

水分含量和水分活度隨著加工工序的降低趨勢一致，呈顯著正相關(r=0.996，P<0.05)。調(diào)味浸漬后(B)比解凍后(A)水分含量無顯著變化(P>0.05)，而水分活度顯著降低(P<0.05)，主要由于調(diào)味浸漬后貽貝中滲入了食鹽和白砂糖。焙干和烘烤過程中(C和D)水分含量和水分活度均顯著降低(P<0.05)，說明焙干和烘烤過程是控制水分活度和水分含量的關鍵工序，故生產(chǎn)中把該過程水分活度(或水分含量)的控制確定為關鍵控制點(CCP)。二次殺菌前后(D和E)水分含量和水分活度無顯著變化(P>0.05)?？刂扑趾?，實質(zhì)為了控制水分活度，水分活度是水分與食品結(jié)合程度，是微生物酶和化學反應能觸及的水分，是微生物生長繁殖的重要因素[13-14]，每種微生物一般都有最低的水分活度要求，但是軟烤產(chǎn)品的水分活度控制過低，感官品質(zhì)差[8-9,13]，故軟烤貽貝安全加工過程需適度降低水分活度(或水分含量)，成品水分活度一般可控制在0.905±0.005，水分含量一般控制在46.5%±1.3%。

2.3軟烤貽貝加工過程中pH變化

軟烤貽貝加工過程中pH的變化如圖3所示，雖與菌落總數(shù)的變化不存在顯著相關性(r=0.550，P>0.05)，但pH協(xié)同水分活度、溫度等柵欄因子可以有效抑制微生物的生長[6,10-11,14]。解凍后(A)貽貝的pH較高，說明軟烤貽貝較新鮮，因為pH可反映原料的新鮮度[17]。調(diào)味浸漬后(B)pH顯著降低(P<0.05)，主要是因為調(diào)味過程中檸檬酸的添加，后續(xù)加工工序的pH基本保持恒定(P>0.05)。微生物的生長繁殖受pH的影響較大，絕大部分細菌在6.6～7.5時生長最好，從最適pH開始降低或者升高pH均不利于微生物生長。陳舒等[7]在軟烤扇貝調(diào)味過程中使用檸檬酸降低pH時發(fā)現(xiàn)，pH<5.5時酸味明顯，pH在5.7～5.9之間時，不僅無明顯酸味，而且有一定去腥效果。李賢良等[18]將高水分烤蝦水分活度控制到0.92，pH值調(diào)至5.89，既可以達到抑制微生物的目的，又可以保持較好的感官品質(zhì)，因此實驗中將軟烤貽貝成品pH的控制在約5.81，并將調(diào)味浸漬過程中pH控制確定為安全加工的關鍵控制點(CCP)。

圖3　軟烤貽貝加工過程中pH變化Fig.3　Changes in pH of light-baked mussels during process

2.4軟烤貽貝加工過程中細菌數(shù)量變化

軟烤貽貝加工過程中細菌數(shù)量變化，如圖4。軟烤貽貝加工中，菌落總數(shù)總體上呈下降趨勢，而耐熱菌數(shù)略微減少(P>0.05)，同時根據(jù)兩者差值變化加工過程中主要殺滅非耐熱菌。調(diào)味浸漬后(B)比解凍后(A)的菌落總數(shù)只是略有提升(P>0.05), 主要是低溫和較低pH抑制了微生物的增加。經(jīng)過熱冷交替即擺盤焙干、冷卻、烘烤、冷卻(D和E工序)，菌落總數(shù)顯著下降(P<0.05)，主要是因為高溫加熱和低溫冷卻之間的迅速變化以及水分活度的顯著降低導致絕大部分非耐熱菌被殺死，不過耐熱菌數(shù)只是略有下降(P>0.05)，說明3次熱冷交替主要殺滅的是非耐熱菌。二次殺菌(E)后菌落總數(shù)顯著降低(P<

圖4　軟烤貽貝加工過程中細菌數(shù)量變化Fig.4　Changes in bacterial abundance of light-baked mussels during process

0.05)，耐熱菌數(shù)略微減少(P>0.05)，說明軟烤貽貝二次殺菌過程中熱冷交替有效殺滅絕大部分非耐熱菌，同時也殺死少量耐熱菌，菌落總數(shù)剩余約280 CFU/g(低于企業(yè)標準300 CFU/g)，耐熱菌數(shù)約有40 CFU/g，這與陳舒等研究的結(jié)果一致[7]。

2.5軟烤貽貝二次殺菌前后細菌組成

軟烤貽貝的最后腐敗變質(zhì)主要是二次殺菌后的殘留細菌生長和繁殖引起的，為了更有針對性地殺菌，對軟烤貽貝二次殺菌前后細菌組成進行了鑒定，如表1。革蘭氏染色后鏡檢，結(jié)果均為革蘭氏陽性菌，二次殺菌前有芽孢桿菌、球菌和無芽孢桿菌，二次殺菌后無球菌，僅剩余芽孢桿菌和無芽孢桿菌。進一步生理生化分析，如表2，鑒定出兩種細菌類型(蠟樣芽孢桿菌和葡萄球菌)，即二次殺菌前的主要菌群是蠟樣芽孢桿菌和葡萄球菌，而二次殺菌后主要菌群是蠟樣芽孢桿菌，無芽孢桿菌未鑒定出。故軟烤貽貝產(chǎn)品主要菌群是條件致病菌蠟樣芽孢桿菌，和軟烤扇貝和軟烤南美白對蝦中的主要菌群一致[7-9]，當該菌在食品中達到103～104CFU/g，便可以引起食物中毒[15-16]。據(jù)觀察，控制不當?shù)能浛井a(chǎn)品二次殺菌后易殘留葡萄球菌，而溫度、水分活度和pH及其協(xié)同效應是影響微生物生長重要因素[10-11]，基于柵欄效應理論，加工全過程工藝參數(shù)(溫度和時間、水分含量和水分活度以及pH)必須嚴格控制，才能保證產(chǎn)品微生物安全。

表1　軟烤貽貝二次殺菌前后細菌組成

3結(jié)論

軟烤貽貝是一種溫和加工產(chǎn)品，加工過程中微生物控制意義重大，其成品主要殘存條件致病菌蠟樣芽孢桿菌。溫度和時間、水分活度以及pH等柵欄因子協(xié)同影響著軟烤貽貝中的微生物，焙干和烘烤階段中水分活度(或水分含量)、調(diào)味浸漬過程中pH控制均應被列為安全加工的關鍵控制點，此外生產(chǎn)整個過程的溫度要嚴格控制，尤其3次熱冷交替過程。綜合考慮感官品質(zhì)，水分活度和水分含量以及pH應該適度降低，軟烤貽貝成品水分活度和水分含量分別控制為0.905±0.005和46.5%±1.3%，成品pH控制為5.81±0.02，但軟烤貽貝中條件致病菌蠟樣芽孢桿菌的控制需建立生長非生長模型來進一步量化pH、溫度和水分活度等柵欄因子來協(xié)同抑制蠟樣芽孢桿菌繼續(xù)生長繁殖。

表2　軟烤貽貝中兩種細菌類型鑒定結(jié)果

注：+表示陽性；-表示陰性。

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Study on microbial control during process of light-baked mussels

QU Fei-xiang1, 2, LI Xue-ying1, YANG Xian-shi1*, CHI Hai1

1(East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China)2(Shanghai Ocean University, College of Food Science and Technology, Shanghai 201306, China)

ABSTRACTThe process of light-baked mussels was simulated in the lab. The correlation between the process parameters (temperature and time, water content and water activity and pH) and its microflora changes (bacterial abundance and bacterial flora composition) was analyzed in order to investigate microbial control during the process. It showed that total bacteria count decreased significantly during the process, but heat-resistant bacteria count decreased slightly, which indicated that most of the non-heat-resistant bacteria were killed after three alternations of heat and cold . And total bacteria count of the final product was less than 300 CFU/g, most of which were identified as Bacillus cereus. The control of temperature and time and water activity (or moisture content) had significant effects on the changes of total bacteria count, pH had no significant effect but the synergistic effect. Drying and baking processes and the seasoning impregnation were the key processes for water activity and moisture content control and pH control respectively, which can be determined as critical control points (CCP) of microbial hazard control. Besides, temperature and time was strictly controlled during the safe production process, especially for three times of alternation between heat and cold.

Key wordslight-baked mussels; process; microbial control; processing parameters; hurdle factors

收稿日期：2015-10-23，改回日期：2015-12-01

基金項目：水產(chǎn)品溫和加工技術應用與產(chǎn)業(yè)化示范(上海市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目，滬農(nóng)科轉(zhuǎn)字2015第2-1號)；水產(chǎn)品溫和加工關鍵技術引進(農(nóng)業(yè)部948計劃，2011-Z12)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603030

第一作者：碩士研究生(楊憲時研究員為通訊作者，E-mail：xianshiyang@126.com)。