絲狀真菌發(fā)酵小麥麩皮中酚類物質(zhì)抑制胰脂肪酶活性和HepG2細胞內(nèi)甘油三酯沉積的作用

王春麗，黃士淇，孫丹，蔡圣寶*

1(昆明理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明，650500)　2(昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院，云南 昆明，650500)

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絲狀真菌發(fā)酵小麥麩皮中酚類物質(zhì)抑制胰脂肪酶活性和HepG2細胞內(nèi)甘油三酯沉積的作用

王春麗1，黃士淇2，孫丹2，蔡圣寶2*

1(昆明理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明，650500)2(昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院，云南 昆明，650500)

摘要探討了2種食品加工中常用的絲狀真菌(米根霉和米曲霉)固態(tài)發(fā)酵小麥麩皮后，其總酚含量的變化，研究了發(fā)酵前后小麥麩皮中酚類物質(zhì)對脂肪酶活性和HepG2細胞內(nèi)甘油三酯沉積的抑制作用。結(jié)果表明：發(fā)酵能顯著提高小麥麩皮的總酚以及其抗氧化性 (P< 0.05)。發(fā)酵后的小麥麩皮酚類物質(zhì)抑制胰脂肪酶以及HepG2細胞內(nèi)甘油三酯沉積的活性均顯著增強 (P< 0.05)。未發(fā)酵、米根霉和米曲霉發(fā)酵的小麥麩皮乙酸乙酯萃取物抑制胰脂肪酶活性的IC(50)值分別是1.35、0.78和0.85 mg/mL。在90 μg/mL質(zhì)量濃度條件下，未發(fā)酵、米根霉發(fā)酵和米曲霉發(fā)酵小麥麩皮的乙酸乙酯組分對HepG2細胞內(nèi)甘油三酯沉積的抑制率分別為14.4%，26.2%和20.5%。

關(guān)鍵詞小麥麩皮；發(fā)酵；酚類物質(zhì)；胰脂肪酶；甘油三酯

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種最常見的慢性肝病，其定義為：在沒有過度飲酒和其他特定病因的情況下，肝細胞中出現(xiàn)甘油三酯(triglyceride, TG)的過度累積[1]。 現(xiàn)如今，NAFLD已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的疾病，在中國約有15%的人有NAFLD，而在西方國家，這一比例高達20%～40%，并且這一疾病的發(fā)病率還在快速地增加[2-3]。因此，如何有效地預(yù)防和治療NAFLD一直是一個研究的熱點。在過去幾十年里，研究者們在預(yù)防和治療NAFLD領(lǐng)域做了大量工作。根據(jù)NAFLD的發(fā)病機理，當(dāng)肝細胞中TG過度累積后，肝細胞更容易受到損傷，發(fā)展成為非酒精性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)[4]。因此，降低肝細胞中TG的累積被認為是預(yù)防NAFLD的一個有效手段，這一目的可以通過抑制肝細胞對游離脂肪酸(free fatty acids, FFAs)的吸收以及TG的合成來達到。前人研究發(fā)現(xiàn)，許多植物性食物中的生物活性物質(zhì)可以有效預(yù)防肝臟中TG的累積[5-7]。 而在這些活性物質(zhì)中，酚類物質(zhì)引起了廣泛的興趣。 研究發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)不但能夠通過抑制胰脂肪酶活性來降低FFAs的吸收[8-9]，而且還可以促進肝細胞對FFAs的氧化消耗[5], 從而最終降低肝細胞中TG的累積，預(yù)防NAFLD。

小麥麩皮是小麥種子的外層結(jié)構(gòu)，是一種常見的農(nóng)業(yè)廢棄物，富含酚類物質(zhì)[10-11]。 但是谷物麩皮中的大部分酚類物質(zhì)與脂肪酸、糖、蛋白質(zhì)或者其他大分子物質(zhì)形成結(jié)合物，這些結(jié)合狀態(tài)的酚類物質(zhì)較難被人體吸收利用[12-13]。因此，需要采用水解等方式將酚類物質(zhì)從麩皮中釋放出來。微生物固態(tài)發(fā)酵一直以來被用于食品的加工制作。這些微生物，特別是絲狀真菌，在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生多種不同的水解酶，從而可以將植物性食物中的結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)釋放出來。大量前人研究報道了固態(tài)發(fā)酵可以提升黑豆[14]，小麥[12]，燕麥[15]和大米[16]的酚類物質(zhì)和抗氧化能力。另外，有研究表明，固態(tài)發(fā)酵燕麥可以提高燕麥酚類物質(zhì)提取物抑制胰脂肪酶的作用[9]。然而，關(guān)于絲狀真菌發(fā)酵小麥麩皮的酚類物質(zhì)含量，抗氧化性，抑制胰脂肪酶和抑制肝細胞中TG累積的研究卻未見報道。因此，本研究的目的是探討經(jīng)兩種食品加工常用絲狀真菌發(fā)酵后的小麥麩皮中酚類物質(zhì)含量，抗氧化性，抑制胰脂肪酶和抑制HepG2細胞中TG累積活性的變化。

1材料與方法

1.1材料與試劑

熒光素鈉鹽，Trolox，偶氮二異丁脒鹽酸鹽(2,2-azobis-2-methylpropion-amidine dihydrochloride, AAPH)，2型豬胰脂肪酶195 U/g，油酸(oleic acid, OA)，牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)和對硝基苯月桂酸酯購自Sigma-Aldrich公司(中國，上海)。胎牛血清(foetal bovine serum, FBS)，青霉素-鏈霉素雙抗和DMEM培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle’s medium, DMEM)購自Gibco公司(中國，北京)。福林酚反應(yīng)試劑購自Merck公司(中國，北京)。兩株絲狀真菌米曲霉(Aspergillusoryzae，2064)和米根霉(Rhizopusoryzae，40282) 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。真菌接種到PDA培養(yǎng)基上后，在30 ℃條件下培養(yǎng)5 d，使其長出孢子，然后用0.9% NaCl 生理鹽水洗下孢子制備成孢子懸液。

1.2小麥麩皮發(fā)酵及提取物制備

小麥麩皮購自當(dāng)?shù)孛娣奂庸S。發(fā)酵方法參考文獻報道并稍加修改[9,15]。小麥麩皮(50 g)裝入500 mL錐形瓶中，然后121 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫后，每瓶樣品中加入孢子懸液(1×106個孢子/g小麥麩皮)和25 mL滅菌的生理鹽水。然后，所有樣品在30 ℃下培養(yǎng)4 d，并且每隔12 h充分搖晃1次。不加孢子懸液的一組樣品作為對照組。

提取物的制備方法參考文獻報道[15]。所有小麥麩皮樣品用體積分數(shù)為80%的乙醇在45 ℃條件下超聲提取30 min，然后離心10 min (離心力3 000 g)。收集上清后，利用相同條件對其沉淀再提取1次，合并每個樣品的上清。所有樣品的上清溶液在45 ℃ 條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成乙醇提取物。然后再用80%甲醇將這些提取物復(fù)溶，依次用石油醚，乙酸乙酯，水飽和正丁醇進行液液萃取。去除有機試劑，所有樣品凍干后儲存于-80 ℃。

1.3總酚含量測定

本研究采用Folin-Ciocalteu法測定每個樣品的總酚含量并稍加修改[17]。具體操作為：經(jīng)過適當(dāng)稀釋的樣品(1.0 mL)與Folin-Ciocalteu試劑(1.0 mL)進行充分混合。然后依次加入1.5 mL的200 g/L的Na2CO3溶液和7.5 mL蒸餾水，充分混合后在70 ℃水浴中反應(yīng)10 min。當(dāng)反應(yīng)液冷卻至室溫后，在765 nm條件下測定每個反應(yīng)液的吸光值。樣品中總酚含量表示為1 g提取物中含有的沒食子酸質(zhì)量(mg)，每個樣品重復(fù)3次。

1.4抗氧化能力指數(shù)(ORAC法)

參照前人報道的ORAC法[15]測定所有樣品的抗氧化能力。實驗在黑色96-微孔板(Nunc, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark)上進行。具體操作如下：首先用磷酸緩沖液(75 mmol/L, pH 7.4)配制熒光素鈉鹽溶液(7.98×10-4mmol/L)和AAPH溶液(173 mmol/L)。然后取100 μL熒光素鈉鹽溶液加入到25 μL 適當(dāng)濃度的樣品中，混合均勻后于37 ℃下孵育10 min。然后加入75 μL之前配制好的AAPH溶液，從而啟動反應(yīng)。利用多功能微孔讀板器(SpetraMax M5, Molecular Device)每隔2 min讀取熒光值(485 nm激發(fā)波長，515 nm發(fā)射波長)，共讀取2 h。實驗結(jié)果表示為：μmol trolox/g提取物。

1.5胰脂肪酶活性抑制實驗

胰脂肪酶活性抑制實驗方法參照文獻并稍加修改[9]。首先將胰脂肪酶溶解于超純水中，使其質(zhì)量濃度為5 mg蛋白/mL，然后在10 000 g 離心力下離心5 min后，取其上清供后續(xù)實驗使用。實驗中，反應(yīng)緩沖液采用Tris-HCl (100 mmol/L, pH 8.2)。將對硝基苯月桂酸酯溶于乙酸鈉緩沖液(5 mmol/L, pH 5.0，并含有體積分數(shù)為1%的Triton X- 100)中制成1.0 g/L的反應(yīng)底物儲備液。取100 μL溶于DMSO中的提取物，加入到250 μL的反應(yīng)底物和500 μL 反應(yīng)緩沖液中。充分混勻后，加入150 μL胰脂肪酶啟動反應(yīng)，將反應(yīng)液放于37 ℃條件下反應(yīng)120 min。反應(yīng)結(jié)束后，所有反應(yīng)樣品在10 000 g下離心60 s，然后在400 nm 波長下測定上清的吸光值(OD)。按公式(1)計算胰脂肪酶抑制率：

(1)

1.6細胞培養(yǎng)和細胞毒性實驗

HepG2細胞購自中國科學(xué)院昆明動物所細胞庫。細胞用含有體積分數(shù)為10%的胎牛血清(FBS)和體積分數(shù)為1%的雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)。每2天換1次細胞培養(yǎng)液DMEM。

采用稍加修改的MTT法對所有測試樣品和油酸(OA)的HepG2細胞毒性經(jīng)行檢測[18]。將HepG2細胞接種于24孔板培養(yǎng)24 h后(1×104/孔)，加入含有測試樣品或者OA的新鮮DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液將細胞清洗1遍，然后每孔加入150 μL含有0.5 mg/mL MTT的不完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后將培養(yǎng)基去除干凈，再加入150 μL DMSO 溶解細胞內(nèi)形成的甲瓚。充分溶解后，利用多功能微孔讀板器(SpetraMax M5, Molecular Devices)在570 nm 測定每孔的吸光值。結(jié)果表明本研究中所采用的樣品濃度和油酸濃度均對HepG2細胞沒有毒性。

1.7HepG2內(nèi)甘油三酯(TG)的測定

參照前人的研究報道構(gòu)建HepG2 細胞內(nèi)TG累積模型[7,19]。首先將HepG2細胞(1×104/孔)接入24-孔板并培養(yǎng)24 h。然后將培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基更換為含有0.7 mmol/L 油酸-牛血清白蛋白(OA-BSA) 復(fù)合物(摩爾比, OA∶BSA=4∶1)和樣品。只含有OA-BSA復(fù)合物的組為模型組，只含有牛血清白蛋白的組為對照組。培養(yǎng)24 h后， 移除培養(yǎng)基并清洗干凈后，將每孔內(nèi)HepG2細胞裂解用于測定細胞內(nèi)的TG含量。樣品對細胞內(nèi)TG累積的抑制率按公式(2)計算：

(2)

1.8統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)測定3次，數(shù)據(jù)表示為平均值(n=3)± 標準偏差(SD)，并通過單因素方差分析(one-way ANOVA)對所有數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P< 0.05認為具有顯著性差異(Tukey檢測)，所有數(shù)據(jù)均采用Origin 8.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析并作圖。

2結(jié)果與討論

2.1各樣品中總酚含量(TPC)

小麥麩皮中所含的酚類物質(zhì)具有很好的生理活性。但是，麩皮中的很多酚類物質(zhì)都是和大分子物質(zhì)酯化，以不可溶狀態(tài)存在。之前大量研究表明，絲狀真菌固態(tài)發(fā)酵可以將植物中的結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)水解出來[12, 15]。本研究中所使用的米曲霉和米根霉通常認為是安全的，并且在亞洲常被用來進行發(fā)酵食品的加工，這兩種絲狀真菌在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生多種酶，從而可以將酯化的營養(yǎng)物質(zhì)水解釋放出來[15]。

這兩種真菌發(fā)酵后小麥麩皮不同提取物的總酚含量結(jié)果見圖1。如圖1所示，對于米根霉發(fā)酵的小麥麩皮來說，除了石油醚萃取組分外(P> 0.05)，其他3個組分的總酚含量都顯著增加(P< 0.05)。而對于米曲霉發(fā)酵的小麥麩皮不同萃取物來說，其正丁醇和乙酸乙酯萃取物組分的總酚含量也顯著升高(P< 0.05)。另外，不論小麥麩皮發(fā)酵與否，4個組分中，乙酸乙酯萃取物組分的總酚含量最高(P< 0.05)。相對于未發(fā)酵的小麥麩皮乙酸乙酯萃取物組分，米根霉和米曲霉發(fā)酵的小麥麩皮乙酸乙酯萃取物組分的總酚含量分別上升大約2.6倍和1.7倍。

圖1　發(fā)酵和未發(fā)酵小麥麩皮不同萃取組分的總酚含量Fig.1　The total phenolic content (TPC) of varied extracts from nonfermented and fermented wheat bran注：柱狀圖中相同溶劑萃取組分不同字母表示具有顯著差異(P< 0.05)

2.2各樣品的抗氧化能力

采用ORAC法測得的各樣品抗氧化能力結(jié)果如圖2所示，抗氧化能力表示為μmoL trolox/g 提取物。從圖2可以看出，不論是發(fā)酵還是未發(fā)酵小麥麩皮，其乙酸乙酯組分的抗氧化能力是最強的，具有最高的ORAC值(P< 0.05)，其次是正丁醇和水相組分，但是，石油醚組分抗氧化能力最低(P< 0.05)。食品原料中很多天然化合物具有抗氧化性，在這些天然成分中，酚類物質(zhì)，尤其是多酚類化合物，不但含量豐富，而且抗氧化能力強[20-23]。已有研究表明谷物中也含有豐富的酚類物質(zhì)，主要集中的谷物的麩皮中，是谷物抗氧化性的主要活性物質(zhì)[24-25]。本研究也發(fā)現(xiàn)，樣品總酚含量和ORAC值之間具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.985,P<0.01)，這表明酚類物質(zhì)也是小麥麩皮中主要的抗氧化性物質(zhì)。

圖2　發(fā)酵和未發(fā)酵小麥麩皮不同萃取組分的抗氧化性(ORAC)Fig.2　The antioxidant potentials of varied extracts from nonfermented and fermented wheat bran注：柱狀圖中相同溶劑萃取組分不同字母表示具有顯著差異(P< 0.05)

2.3各樣品對胰脂肪酶活性的抑制效果

在胃腸道中，甘油三酯被水解成甘油和游離脂肪酸后被身體吸收，而在這一生化過程中，胰脂肪酶起著關(guān)鍵的作用，大約70%的甘油三酯是需要胰脂肪酶來進行水解[26]。因此，抑制胰脂肪酶活性作為預(yù)防和治療非酒精性脂肪肝和肥胖癥的一個措施和靶點已經(jīng)被廣泛研究。前人的許多研究表明多種酚類化合物具有很好的胰脂肪酶抑制活性[8-9]。

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，本研究測定了在1.0 mg/mL下每個萃取組分對胰脂肪酶活性的抑制作用，結(jié)果見圖3。如圖3所示，不論發(fā)酵與否，乙酸乙酯組分對胰脂肪酶活性的抑制作用最強(P< 0.05)，其次是正丁醇組分。但是，石油醚組分和水相組分抑制作用最弱，且彼此之間沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P> 0.05)。兩株絲狀真菌固態(tài)發(fā)酵均能顯著提高小麥麩皮萃取物對胰脂肪酶的抑制作用，尤其是乙酸乙酯萃取組分(P< 0.05)。對于米根霉發(fā)酵小麥麩皮的乙酸乙酯萃取組分來說，其抑制作用比未發(fā)酵小麥麩皮的乙酸乙酯組分的抑制作用增強了2倍。對于米曲霉發(fā)酵小麥麩皮的乙酸乙酯組分來說，其抑制作用提高了大約1.7倍(圖3)。為了獲得乙酸乙酯組分抑制胰脂肪酶的IC50值，測定了不同濃度乙酸乙酯組分對胰脂肪酶的抑制作用，結(jié)果如圖4所示。不論發(fā)酵與否，乙酸乙酯組分對胰脂肪酶的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。對于未發(fā)酵、米根霉發(fā)酵和米曲霉發(fā)酵的小麥麩皮乙酸乙酯組分來說，抑制胰脂肪酶作用的IC50值分別為1.35, 0.78和0.85 mg/mL，發(fā)酵樣品的IC50顯著低于未發(fā)酵樣品(P< 0.05)。

圖3　發(fā)酵和未發(fā)酵小麥麩皮不同萃取組分對胰脂肪酶的抑制率Fig.3　Pancreatic lipase inhibitory rates of varied extracts from nonfermented and fermented wheat bran注：柱狀圖中相同溶劑萃取組分不同字母表示具有顯著差異(P< 0.05)

通過分析發(fā)現(xiàn)，樣品總酚含量和對胰脂肪酶抑制作用呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r = 0.937,P< 0.01)，這個表明不論發(fā)酵與否，小麥麩皮中的酚類物質(zhì)是其抑制胰脂肪酶的主要物質(zhì)。食物中酚類物質(zhì)抑制胰脂肪酶的作用已經(jīng)被廣泛研究。GONDOIN等人體外研究表明綠茶和白茶中的酚類物質(zhì)能顯著抑制脂肪酶活性，尤其是其中的STRICTININ[8]。MORENO等人也發(fā)現(xiàn)富含咖啡酸、阿魏酸和苯甲酸的花生殼提取物在體外能抑制胰脂肪酶的活性[27]。葡萄籽富含多種酚類物質(zhì)，研究也發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物具有抑制胰脂肪酶活[28]。

圖4　發(fā)酵和未發(fā)酵小麥麩皮不同濃度的乙酸乙酯萃取組分對胰脂肪酶的抑制率Fig.4　Pancreatic lipase inhibitory effects of ethyl acetate fractions from nonfermented and fermented wheat bran at various concentrations注：*表示與兩種真菌發(fā)酵的小麥麩皮相比具有顯著差異(P< 0.05)； #表示與米曲霉發(fā)酵的小麥麩皮相比具有顯著差異(P< 0.05)

2.4各樣品抑制HepG2細胞內(nèi)甘油三酯累積的作用

根據(jù)前人的研究和當(dāng)前實驗的結(jié)果，發(fā)酵和未發(fā)酵小麥麩皮的富含酚類物質(zhì)組分(乙酸乙酯組分)被用來測試其抑制肝細胞TG累積的作用。因此，首先測定了各樣品和油酸的細胞毒性。根據(jù)測得的結(jié)果表明，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為90 μg/mL和油酸濃度為0.7 mmol/L時對HepG2細胞均沒有表現(xiàn)出毒性。所以在本研究中，樣品質(zhì)量濃度選為90 μg/mL；并用0.7 mmol/L油酸進行造模。如圖5所示，未發(fā)酵小麥麩皮的乙酸乙酯組分具有較好的抑制甘油三酯沉積作用，在90 μg/mL 時，其抑制率為14.4%。而發(fā)酵后的小麥麩皮乙酸乙酯組分對甘油酸酯的抑制率顯著提高(P< 0.05)。米根霉和米曲霉發(fā)酵小麥麩皮乙酸乙酯組分對甘油酸酯的抑制率分別為26.2%和20.5%。大量前人研究也表明，富含酚類物質(zhì)的提取物在體內(nèi)或體外實驗中，都表現(xiàn)出較好的抑制TG累積的作用，如綠茶提取物、藍莓提取物、黑米提取物等等[5,29,30]。

圖5　發(fā)酵和未發(fā)酵小麥麩皮乙酸乙酯組分對HepG2細胞內(nèi)甘油三酯的抑制率Fig.5　Inhibitory effect of ethyl acetate fractions from nonfermented and fermented wheat bran on TG accumulation in HepG 2 cells注：柱狀圖中不同字母表示具有顯著差異(P< 0.05)

3結(jié)論

本項研究結(jié)果表明，小麥麩皮乙酸乙酯提取物不但具有較好的抗氧化性，還能顯著抑制胰脂肪酶活性，清除HepG2細胞內(nèi)甘油三酯的累積。而且，用米根霉和米曲霉固態(tài)發(fā)酵都能顯著提升小麥麩皮的上述三種生物活性。因此，發(fā)酵后的小麥麩皮可能在預(yù)防肝細胞脂肪變性方面具有一定的應(yīng)用價值，可以作為一種健康促進成分添加到日常的膳食中。

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Invitroinhibitory effects of phenolic compounds from fungi-fermented wheat bran on pancreatic lipase activity and triglyceride accumulation in HepG2 cells

WANG Chun-li1, HUANG Shi-qi2, SUN Dan2, CAI Sheng-bao2*

1(Faculty of Chemical Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)2(Yunnan Institute of Food Safety, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

ABSTRACTWheat bran is a side-product of agriculture and is rich in phenolic compounds. However, information about the inhibitory effects of phenolic compounds from fungi-fermented wheat bran on pancreatic lipase activity and triglyceride accumulation is still scarce. The aim of the present work was to study the total phenolic content, hepatic TG clearance and lipase inhibition of wheat bran after fermentation by two filamentous (Aspergillus Oryzae and Rhizopus Oryzae). The results indicated that fermentation could significantly increase total phenolic content and antioxidant activity of wheat bran (P< 0.05). Moreover, the in vitro inhibitory effects of phenolic compounds from fungi-fermented wheat bran on pancreatic lipase activity and triglyceride accumulation in HepG2 cells also increased dramatically (P< 0.05). For non-fermented, R. Oryzae and A. Oryzae fermented wheat bran, the inhibitory ratio of 90 μg/mL extract on TG accumulation were 14.4%, 26.2% and 20.5%, respectively, and IC50 value of lipase inhitiory effect were 1.35, 0.78 and 0.85 mg/mL, respectively.

Key wordswheat bran; fermentation; phenolic compounds; pancreatic lipase; triglyceride

收稿日期：2015-11-28，改回日期：2015-12-17

基金項目：昆明理工大學(xué)省級人才培養(yǎng)項目(14118781)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603011

第一作者：碩士，助理實驗師(蔡圣寶副教授為通訊作者，E-mail: caikmust2013@163.com)。