D-松醇原藥對大鼠肝臟的毒性作用＊?

曾奇兵，徐玉艷，張　婷，唐艷明，李　敏，洪　峰，王　榮

(貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境污染與疾病監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽　550025)

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D-松醇原藥對大鼠肝臟的毒性作用＊?

曾奇兵，徐玉艷*，張婷，唐艷明，李敏，洪峰，王榮

(貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境污染與疾病監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025)

［摘要］目的:探討D-松醇原藥對大鼠肝臟的毒性。方法: 4～6周齡健康清潔級SD大鼠80只(雌雄各半)，隨機(jī)分成D-松醇原藥低劑量組、中劑量組、高劑量組及對照組，每組20只，雌雄各10只，低、中、高劑量組分別喂飼390.63 mg/kg、1 562.50 mg/kg和6 250.00 mg/kg的D-松醇原藥飼料，對照組喂飼普通標(biāo)準(zhǔn)飼料，連續(xù)喂飼90 d;觀察4組大鼠的一般情況、體重變化;第90天時(shí)，各組大鼠心臟取血檢測天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、總膽紅素(TBLL)、膽堿酯酶(CHE) 10項(xiàng)肝功能指標(biāo)，取各組大鼠肝臟計(jì)算肝臟臟體比及觀察肝臟病理組織學(xué)改變。結(jié)果: D-松醇原藥低、中、高劑量組雄性大鼠實(shí)際染毒量分別為33.58 mg/kg、149.39 mg/kg、543.98 mg/kg;雌性大鼠實(shí)際染毒劑量分別為30.88 mg/kg、127.06 mg/kg、483.88 mg/kg。高劑量組雌性大鼠GLO、TP低于對照組(P＜0.05) ;中、高劑量組雌性大鼠CHE高于對照組(P＜0.05) ;中、高劑量組雄性大鼠TBLL高于對照組(P＜0.05)。結(jié)論: D-松醇原藥90 d經(jīng)口喂養(yǎng)最大無作用劑量，雄性為30.88 mg/kg、雌性為33.58 mg/kg。雄性大鼠攝入D-松醇原藥127.06 mg/kg以及雌性大鼠攝入D-松醇原藥149.39 mg/kg時(shí)可以引起大鼠肝臟損傷。

［關(guān)鍵詞］藥物毒性;農(nóng)藥; D-松醇;大鼠，Sprague-Danley;肝臟

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2016－02－23網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.2014.036.html

近年來，農(nóng)藥引起的安全問題已經(jīng)受到社會各界的廣泛重視，農(nóng)藥暴露可引起生物體多器官、多系統(tǒng)損害。肝臟作為機(jī)體生物合成、加工與解毒的重要器官，血液供應(yīng)豐富，極易受到農(nóng)藥的毒性作用［1－2］。D-松醇(分子式C7H14O6)又名咳寧醇，是一種新型的植物源殺菌劑［3－4］。目前，國內(nèi)外對D-松醇的毒性研究較少，本研究通過大鼠90 d亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，探討D-松醇原藥對大鼠肝臟的亞慢性毒性效應(yīng)，為D-松醇原藥安全性評價(jià)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及分組

選擇4～6周齡健康清潔級SD大鼠80只，雌雄各半，雌性112～130 g、雄性114～134 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SCXK渝2012－0003)。所有試驗(yàn)前SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分成4組: D-松醇原藥低劑量組、中劑量組、高劑量組及對照組。每組20只，雌雄各10只。參考GB15670－1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》［5］設(shè)計(jì)劑量，以D-松醇原藥大鼠急性經(jīng)口毒性半數(shù)致死劑量(LD50)為標(biāo)準(zhǔn)，LD50的1/10是500.00 mg/ kg·bw，設(shè)為高劑量組的藥物含量，按4倍等比級數(shù)設(shè)低、中劑量組，藥物含量分別為31.25 mg/kg ·bw和125.00 mg/kg·bw，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按大鼠進(jìn)食量是其體重的8%的原則，配制D-松醇原藥動(dòng)物飼料，飼料中D-松醇原藥的濃度分別為低濃度390.63 mg/kg、中濃度1 562.50 mg/kg和高濃度6 250.00 mg/kg。

1.2給藥方法及飼養(yǎng)條件

各組各性別大鼠分別喂養(yǎng)，喂飼法給藥，低、中、高3個(gè)劑量組大鼠每天分別自由攝取低、中、高D-松醇原藥濃度的飼料，對照組每天自由攝取普通標(biāo)準(zhǔn)飼料，連續(xù)喂飼90 d。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ～24℃，濕度60%～70%，持續(xù)空調(diào)送風(fēng)系統(tǒng)換氣，保持良好通風(fēng)，空氣潔凈度10 000級，噪聲小于60 dB，人工晝夜12/12 h。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1一般情況及體重每天觀察大鼠的外觀體征、行為活動(dòng)、進(jìn)食量、糞便性狀、中毒癥狀及死亡情況，每周稱取大鼠體重1次，第90天時(shí)實(shí)測大鼠每周飼料消耗量，根據(jù)飼料消耗量計(jì)算D-松醇原藥的實(shí)際攝入量。

1.3.2肝功能指標(biāo)第90天時(shí)，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，心臟取血并分離血清，用奧林巴斯AU400全自動(dòng)生化分析儀檢測血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、總膽紅素(TBLL)和膽堿酯酶(CHE) 10項(xiàng)肝功能指標(biāo)。

1.3.3肝臟組織留取血液標(biāo)本后處死動(dòng)物，分離肝臟，用電子天平稱重，計(jì)算肝臟臟體比(肝臟臟體比=肝臟臟器重量/體重×100%)。將稱重后的肝臟用10%中性福爾馬林固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，組織細(xì)胞學(xué)檢查。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS(V13.0)統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況

4組大鼠飲水、進(jìn)食正常，糞便性狀正常。對照組與低劑量組大鼠未見明顯異常表現(xiàn)，高、中劑量組大鼠在染毒第6～9周開始出現(xiàn)煩躁不安、背毛蓬松、會陰污穢。對照組及各劑量組雌、雄性大鼠體重增長，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1、2。

2.2染毒量

根據(jù)大鼠每周飼料實(shí)際消耗量計(jì)算D-松醇原藥的實(shí)際攝入量。低劑量組雌、雄性大鼠D-松醇原藥實(shí)際染毒量為33.58 mg/kg、30.88 mg/ kg;中劑量組雌、雄性大鼠D-松醇原藥實(shí)際染毒量為149.39 mg/kg、127.06 mg/kg;高劑量組雌、雄性大鼠D-松醇原藥實(shí)際染毒量為543.98 mg/ kg、483.88 mg/kg。

2.3肝功能

高劑量組雌性大鼠GLO、TP低于對照組(P＜0.05) ;中、高劑量組雌性大鼠CHE高于對照組(P ＜0.05) ;中、高劑量組雄性大鼠TBLL高于對照組(P＜0.05)。其余肝功能指標(biāo)4組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1、2。

2.4肝臟組織變化

4組雌、雄大鼠肝臟臟體比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。4組雌、雄大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉清晰可見，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，單行排列成板狀結(jié)構(gòu)，核橢圓形，可見一個(gè)或多個(gè)核，胞漿嗜酸性。肝細(xì)胞索之間可見肝血竇，血竇壁可見內(nèi)皮細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞。匯管區(qū)內(nèi)動(dòng)、靜脈及膽管形態(tài)正常。未見明顯病理改變。

圖1　D-松醇原藥各劑量組雄性大鼠體重變化趨勢Fig.1　Weight change trend of male rats in each D-pinitol dose group

圖2　D-松醇原藥各劑量組雌性大鼠體重變化趨勢Fig.2　Weight change trend of female rats in each D-pinitol dose group

表1　各組大鼠毒性試驗(yàn)90 d時(shí)血清AST、ALT、ALP、ALB及GLO結(jié)果(±s) Tab.1 AST、ALT、ALP、ALB and GLO levels of rats in each group on 90 d

表1　各組大鼠毒性試驗(yàn)90 d時(shí)血清AST、ALT、ALP、ALB及GLO結(jié)果(±s) Tab.1 AST、ALT、ALP、ALB and GLO levels of rats in each group on 90 d

(1)與對照組比較，P＜0.05

組別　　性別　n　 AST(U/L)　ALT(U/L)　ALP(U/L)　ALB(g/L)　 GLO(g/L)對照組　　雄性　10　 175.21±73.11　 59.98±23.34　 77.88±32.91　 32.02±1.98　 39.34±2.89低劑量組　雄性　10　 214.58±84.25　 52.61±16.88　 85.79±21.30　 31.97±1.95　 40.50±4.02中劑量組　雄性　10　 215.75±110.89　 51.57±17.13　 94.40±25.96　 32.28±1.87　 42.12±3.70高劑量組　雄性　10　 202.80±76.00　 41.55±7.87　 83.89±13.63　 33.14±1.56　 39.22±3.67對照組　　雌性　10　 147.13±43.31　 50.11±32.39　 68.01±39.42　 35.52±1.24　 42.09±2.47低劑量組　雌性　10　 171.89±71.26　 36.76±15.93　 62.13±18.24　 35.81±1.47　 42.27±3.17中劑量組　雌性　10　 150.99±36.65　 35.08±7.47　 46.61±13.70　 35.26±2.78　 40.44±2.40高劑量組　雌性　10　 151.31±56.91　 30.15±5.63　 61.35±32.37　 33.61±1.34　 39.07±1.87(1)

表2　各組大鼠毒性試驗(yàn)90 d時(shí)血清CHE、TP、CHO、GLU及TBLL結(jié)果(±s)Tab.2 CHE、TP、CHO、GLU and TBLL levels of rats in each group on 90 d

表2　各組大鼠毒性試驗(yàn)90 d時(shí)血清CHE、TP、CHO、GLU及TBLL結(jié)果(±s)Tab.2 CHE、TP、CHO、GLU and TBLL levels of rats in each group on 90 d

(1)與對照組比較，P＜0.05

組別　　性別　n　 CHE(U/L)　TP(g/L)　CHO(mmol/L)　 GLU(mmol/L)　 TBLL(μmol/L)對照組　　雄性　10　 0.20±0.10　 71.35±4.36　 1.08±0.52　4.42±2.03 1.79±0.65　4.46±1.20　 1.21±0.53 0.55±0.62低劑量組　雄性　10　 0.21±0.07　 72.47±5.13　 1.51±0.66　4.39±3.33　 0.63±0.36中劑量組　雄性　10　 0.22±0.07　 74.40±4.29　 1.45±0.39　3.80±2.42　 1.16±0.36(1)高劑量組　雄性　10　 0.21±0.09　 72.36±4.51　 1.48±0.46　3.45±1.28　 1.27±0.63(1)對照組　　雌性　10　 0.63±0.16　 77.62±3.24　 1.92±0.83　3.01±2.17　 1.47±0.79低劑量組　雌性　10　 0.63±0.13　 78.08±4.43　 1.43±0.62　3.60±1.35　 1.48±0.85中劑量組　雌性　10　 0.86±0.16(1)　75.70±5.10　 1.60±0.38　4.83±1.54　 0.95±0.43高劑量組　雌性　10　 0.82±0.24(1)　72.68±3.04(1)

表3　各組大鼠毒性試驗(yàn)90 d時(shí)肝臟臟體比(±s) Tab.3 Liver body-organ ratio of rats in 4 groups on 90 d

表3　各組大鼠毒性試驗(yàn)90 d時(shí)肝臟臟體比(±s) Tab.3 Liver body-organ ratio of rats in 4 groups on 90 d

組別　　性別　n　　肝臟臟體比(×10－3)對照組　　雄性10　29.14±2.57低劑量組　　雄性　10　28.34±2.17中劑量組　　雄性　10　29.42±1.57高劑量組　　雄性　10　27.41±2.90對照組　　雌性　10　30.58±4.37低劑量組　　雌性　10　28.02±1.30中劑量組　　雌性　10　28.71±1.83高劑量組　　雌性10　28.73±1.85

3　討論

D-松醇作為一種新型植物源殺菌劑，應(yīng)用前景非常廣闊，目前國內(nèi)外關(guān)于D-松醇毒性的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過SD大鼠亞慢性經(jīng)口染毒，觀察D-松醇原藥對其肝臟的毒性作用。體重變化是反映機(jī)體各個(gè)器官對毒物反映的最基本指標(biāo)［6］，本試驗(yàn)表明，對照組及各劑量組雌、雄大鼠體重增長差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在該暴露水平下，D-松醇原藥對大鼠的體重影響較小。ALB、GLO主要在肝臟中合成，當(dāng)肝臟的合成功能障礙時(shí)，可以使血清白蛋白減少，白蛋白/球蛋白比例倒置［7］。同時(shí)，肝臟也是一個(gè)酶工廠，有著生物體代謝活動(dòng)的許多酶類如ALP、AST、ALT等，這些生物酶在血液中含量的變化反映肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損的情況，常作為反映肝功能的重要酶學(xué)指標(biāo)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組雌性大鼠GLO、TP低于對照組，提示高劑量組雌性大鼠肝臟的合成功能已經(jīng)受損;而高劑量雄性大鼠GLO、TP改變與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮D-松醇原藥對大鼠肝臟的合成功能可能存在性別差異。CHE是一類糖蛋白，廣泛存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血漿、肝、腎、腸中，當(dāng)肝臟蛋白質(zhì)合成增加時(shí)，CHE可以增高。本研究中、高劑量組雌性大鼠CHE高于對照組，提示中、高劑量組雌性大鼠蛋白質(zhì)合成增加，其原因有待于進(jìn)一步探索。TBIL為直接膽紅素和間接膽紅素的總和，當(dāng)肝臟受損時(shí)，血清中TBIL升高，因此血清中TBIL可作為判斷肝臟受損的一個(gè)輔助指標(biāo)［9］。中、高劑量組雄性大鼠TBLL高于對照組，提示中、高劑量組大鼠肝臟已經(jīng)受損。結(jié)合肝臟臟體比及組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，各劑量組雌、雄大鼠肝臟臟體比及組織病理學(xué)均未見明顯改變，提示在該劑量下，D-松醇原藥尚不能引起肝臟組織學(xué)改變，僅表現(xiàn)為肝功能的改變，但不排除隨著染毒周期的延長，肝臟會發(fā)生不同程度的病理改變。

綜上，在本實(shí)驗(yàn)條件下，D-松醇原藥經(jīng)口喂養(yǎng)90 d試驗(yàn)中的最大無作用劑量:雄性為30.88 mg/ kg、雌性為33.58 mg/kg。雄性大鼠攝入D-松醇原藥127.06 mg/kg、雌性大鼠攝入D-松醇原藥149.39 mg/kg時(shí)可以引起大鼠肝臟損傷，主要表現(xiàn)為對肝臟合成功能的影響。

4　參考文獻(xiàn)

［1］胡云平，周志俊，孫運(yùn)光，等.樂果對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的毒作用［J］.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2000(4) : 209－211.

［2］徐玉艷，曾奇兵，洪峰.95%氨氯吡啶酸對大鼠肝臟的損害作用［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013(9) : 2041－2043.

［3］王丹丹，陳佳，陳義娟，等.D-松醇原藥及其水劑對黃瓜白粉病的作用方式［J］.農(nóng)藥，2012(4) : 292－295.

［4］Chaubal R，Pawar PV，Hebbalkar GD，et al.Larvicidal activity of Acacia nilotica extracts and isolation of D-pinitol-a bioactive carbohydrate［J］.Chem Biodivers，2005 (5) : 684－688.

［5］國家技術(shù)監(jiān)督局.GB 15670－1995中國標(biāo)準(zhǔn)書號［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

［6］何國平，賈菠，郭昌烜，等.90 d喂養(yǎng)氟磺唑草胺原藥對大鼠毒性作用的研究［J］.毒理學(xué)雜志，2013(4) : 277－279.

［7］劉樹業(yè)，段櫻，李嫻.代謝組學(xué)的進(jìn)展及肝臟代謝組學(xué)［J］.分子診斷與治療雜志，2009(3) : 197－202.

［8］馬曉明，宋祥福，薛茗方，等.碘甲烷對大鼠肝臟合成功能的影響［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013(9) : 19－22.

［9］陳文彬，潘祥林.診斷學(xué)［M］.7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008: 363－365.

(2015－06－18收稿，2015－12－31修回)

中文編輯:戚璐;英文編輯:趙毅

·臨床研究·

D-pinitol Technical Grade Toxicity on Rats Liver

ZENG Qibing，XU Yuyan，ZHANG Ting，TANG Yanming，LI Min，HONG Feng，WANG Rong
(Key Laboratory of Environment Pollution Monitoring and Disease Control，School of Public Health，Guizhou Medical University，Guiyang 550025)

［Abstract］Objective: To investigate D-pinitol technical grade toxicity on rats liver.Methods: Eighty healthy SD rats of 4 to 6 weeks of age (equal male and female number)，randomly divided into D-pinitol technical grade low，medium and high dose groups and control group，with 10 male and 10 female rats each; low，medium and high dose groups were fed with 390.63 mg/kg，1 562.50 mg/kg and 6 250.00 mg/kg D-pinitol technical grade，control group was fed with normal standard stuff，continuous fed for 90 days; observing general condition of 4 groups and weight change; on 90th day，heart blood testing on liver function index of AST，ALT，ALP，TP，ALB，GLO，GLU，CHO，TBLL and CHE.Extracting rats＇liver to calculate liver ratio and liver pathological changes.Results: The actual intoxicated amount of male rats in low，middle and high dose group were 33.58 mg/kg，149.39 mg/kg and 543.98 mg/kg; and the actual intoxicated amount of female rats were 30.88 mg/kg，127.06 mg/ kg，483.88 mg/kg.Globulin (GLO)，total protein (TP) of female rats in high dose group was less than that of control group (P＜0.05).Cholinesterase (CHE) of female rats in middle and high dose group was higher than that of control group (P＜0.05).Conclusion: D-pinitol technical grade fed for 90 days no-effect levels were as follows: 127.06 mg/kg for male rats and 149.39 mg/kg for femal rats of D-pinitol technical grade can would cause liver damage in rats.

［Key words］drug toxicity; pesticide; D-pinitol; rats，Sprague-Danley; liver

*通信作者E-mail: 284497349@ qq.com

［中圖分類號］R595.5

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0190-04