D1/D2、MLST及MALDI-TOF MS在新生隱球菌分類(lèi)中的應(yīng)用*＊?

劉濤華，王顏顏，呂　倩，牟麗麗，陳　燕，康穎倩＊

(貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)　550004)

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D1/D2、MLST及MALDI-TOF MS在新生隱球菌分類(lèi)中的應(yīng)用*＊?

劉濤華＊＊，王顏顏，呂倩，牟麗麗，陳燕，康穎倩＊＊＊

(貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)550004)

［摘要］目的:比較單一D1/D2區(qū)域測(cè)定、多位點(diǎn)測(cè)序分型技術(shù)(MLST)和基質(zhì)輔助激光解吸－飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)在新生隱球菌(Cryptococcus podzolicus)及與之鄰近的其他種屬的分類(lèi)研究的穩(wěn)定性和可靠性。方法:挑選以Cryptococcus podzolicus為主及與之相鄰的其他種和屬的菌株共20株及1株outgroup模式菌株，運(yùn)用酵母菌基因組提取試劑盒提取其DNA，PCR擴(kuò)增5個(gè)管家基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2，tef1)并測(cè)序，以Bayesian法(MrBayes3.2.1)、最大似然法、鄰接法(MEGA 6.0軟件)分別構(gòu)建5個(gè)管家基因及D1/D2基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);應(yīng)用MALDI-TOF-MS采集蛋白指紋圖譜，在BrukerDaltonics數(shù)據(jù)庫(kù)(BDAL)和CBS真菌保藏中心數(shù)據(jù)庫(kù)信息的基礎(chǔ)上，對(duì)20株菌進(jìn)行聚類(lèi)分型，構(gòu)建聚類(lèi)分型樹(shù)狀圖。結(jié)果: 3種方法所得樹(shù)狀圖在種間的層面上，均出現(xiàn)了a、b、c 3個(gè)分支;在種內(nèi)的層面上，特別是a這一分支，均為Cryptococcus podzolicus，單一D1/D2區(qū)域所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分化程度不大，各菌株間無(wú)明顯的分類(lèi)多樣性，而MLST及MALDI-TOF MS所得到的樹(shù)狀圖在種內(nèi)均出現(xiàn)了明顯的分類(lèi)多樣性及親緣關(guān)系的差異性。結(jié)論: MLST及MALDI-TOF MS均可作為隱球菌屬中菌株分類(lèi)鑒別中有效的分子生物學(xué)方法，能可靠地揭示隱球菌屬中各菌種的種間及種內(nèi)的遺傳進(jìn)化關(guān)系，MALDI-TOF-MS比MLST則更為快捷準(zhǔn)確。

［關(guān)鍵詞］多位點(diǎn)測(cè)序分型;基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜;新隱球菌;分類(lèi)法;發(fā)育生物學(xué);進(jìn)化

［筑科合同(2011103) 16號(hào)］;貴州省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目［黔科合外G字(2014) 7006］

＊＊貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

＊＊＊通信作者E-mail: joycekangtokyo@ qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2016－02－23網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.2055.054.html

隱球菌屬(Cryptococcus)屬于擔(dān)子菌門(mén)銀耳綱銀耳目銀耳科，隱球菌屬下約有37個(gè)種，通常棲息在土壤中，屬中的新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)可使愛(ài)滋病患者罹患嚴(yán)重的腦膜炎或腦膜腦炎。對(duì)于Cryptococcus的分類(lèi)研究，傳統(tǒng)的方法主要是根據(jù)菌體的外部形態(tài)特征和生理生化特征，敏感性和特異性差，準(zhǔn)確度不高。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，Cryptococcus podzolicus在進(jìn)化樹(shù)附近出現(xiàn)了一些其他屬的菌，如Bullera和Trimorphomyc。Bandoni和Boekhout等［1－2］發(fā)現(xiàn)Trimorphomyc與Cryptococcus podzolicus除了生殖結(jié)構(gòu)不同外，形態(tài)上也不一樣，而B(niǎo)ullera沒(méi)有這些差異，很難通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的分類(lèi)方法對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)。Keisha Findley等［3］通過(guò)MLST技術(shù)對(duì)致病性格特隱球菌(Cryptococcus gattii)［4］和Cryptococcus neoformans之間的關(guān)系以及其在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的具體位置展開(kāi)了研究?；|(zhì)輔助激光解吸－飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型軟電離生物質(zhì)譜，它能完成菌體多種成分的分析，包括蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其他能被離子化的分子。MALDI-TOF-MS具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、分辨率高、高質(zhì)量檢測(cè)范圍等優(yōu)點(diǎn)，成為臨床診斷、食品生產(chǎn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及軍事領(lǐng)域研究的一種有力手段［5－6］。本研究通過(guò)單一D1/D2區(qū)域測(cè)定、多位點(diǎn)測(cè)序分型技術(shù)(MLST)和基質(zhì)輔助激光解吸－飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDITOF-MS)在Cryptococcus podzolicus及與之鄰近的其他種屬分類(lèi)的比較研究，旨在探討適合Cryptococcus分類(lèi)的分子分類(lèi)方法。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株與試劑

挑選以Cryptococcus podzolicus為主及與之相鄰的其他種和屬的菌株共20株，包括Cryptococcus podzolicus、Cryptococcus flavus、Cryptococcus paraflavus、Bullera miyagiana、Bullera sakaeratica及Trimorphomyces papilionaceus，由荷蘭真菌多樣性研究中心、日本千葉大學(xué)真菌研究所惠贈(zèng)。在進(jìn)化樹(shù)上所加的outgroup選擇了Cryptococcus neoformans，CBS 132這一模式菌株，其數(shù)據(jù)來(lái)自于GenBank(見(jiàn)表1)。PDA和YPD培養(yǎng)基均購(gòu)自日本W(wǎng)ako Pure Chemical Industries Ltd公司，基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司，PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

表1　21株實(shí)驗(yàn)菌株種名Tab.1　List of 21 strains in the experiment

1.2多位點(diǎn)測(cè)序分型

1.2.1菌株培養(yǎng)及DNA的提取所有菌株均用YPD液體培養(yǎng)基復(fù)蘇，接種在PDA培養(yǎng)基上，溫度為25℃，培養(yǎng)24 h，挑取菌落;參照酵母菌基因組提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA模板。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析擴(kuò)增的5個(gè)基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2及tef1)，PCR反應(yīng)引物見(jiàn)表2，PCR擴(kuò)增條件見(jiàn)表3。將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，100 V穩(wěn)壓20 min，在紫外透射儀下觀(guān)察。PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表2　MLST測(cè)序位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)引物Tab.2 Primers of MLST loci

表3　PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件Tab.3 PCR amplification reaction conditions

1.2.3 DNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)所獲得的序列，以Bayesian法(MrBayes3.2.1)、最大似然法、鄰接法(MEGA 6.0軟件)分別構(gòu)建ITS和5個(gè)管家基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2，tef1)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行比較分析。

1.3 MALDI-TOF-MS檢測(cè)

1.3.1樣品處理取菌株新鮮培養(yǎng)物，在Eppendorf管中加入純凈水300 μL，挑取適量(5～10 mg)菌落混勻，再加入無(wú)水乙醇900 μL，混勻后以12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，加入70%甲酸50 μL混勻，再加入乙腈50 μL混勻，以12 000 r/min離心2 min，吸取上清液，涂布于96孔樣品板上，自然晾干1 h后，用基質(zhì)溶液α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)覆蓋菌苔，每孔1 μL。晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.2數(shù)據(jù)采集將上樣的樣品板小心置于板孔中，有樣品面朝上，蓋上蓋子，抽真空。打開(kāi)儀器控制軟件FlexControl 3.3.108.0，調(diào)好校準(zhǔn)儀器參數(shù)，采集樣品的質(zhì)譜圖，保存數(shù)據(jù)，通過(guò)MALDI-TOF MS Biotyper RTC 3.0軟件進(jìn)行分析。

1.3.3 MALDI-TOF-MS結(jié)果判斷所采集的質(zhì)譜圖與BrukerDaltonics數(shù)據(jù)庫(kù)(BDAL)和CBS真菌保藏中心數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)圖進(jìn)行比對(duì)，鑒定分值≥2.0表示可鑒定到種水平，2.300～3.000表示菌種鑒定的可信度較高，1.700～1.999表示可鑒定到屬，0.000～1.699表示不可信的鑒定。

1.3.4聚類(lèi)分析對(duì)21株菌的蛋白質(zhì)質(zhì)量圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，采用相似分值構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。

2　結(jié)果

2.1分子分類(lèi)

2.1.1單一D1/D2區(qū)域系統(tǒng)發(fā)育將所獲得的序列，以Bayesian法(MrBayes3.2.1)構(gòu)建單一的D1/D2基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖1)，以最大似然法、鄰接法(MEGA 6.0軟件)分別進(jìn)行比較，圖中所示數(shù)值分別表示Bayesian方法的后驗(yàn)概率值，鄰接法的引導(dǎo)百分率和最大似然法的引導(dǎo)百分率。從圖1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)，在種間的層面上，主要出現(xiàn)了a、b、c 3個(gè)分支，而在種內(nèi)的層面上，特別是a這一分支，均為Cryptococcus podzolicus，其分化程度不大，各菌株無(wú)明顯的分類(lèi)多樣性，其親緣關(guān)系無(wú)明顯差異。

2.1.2多位點(diǎn)序列系統(tǒng)發(fā)育將所獲得的序列，以Bayesian法(MrBayes3.2.1)構(gòu)建4個(gè)管家基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖2)，以最大似然法、鄰接法(MEGA 6.0軟件)分別進(jìn)行比較，圖中所示數(shù)值分別表示Bayesian方法的后驗(yàn)概率值，鄰接法的引導(dǎo)百分率和最大似然法的引導(dǎo)百分率。從圖2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可見(jiàn)通過(guò)MLST所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)在種間的層面上，均出現(xiàn)a、b、c 3個(gè)分支，而種內(nèi)的層面上，其區(qū)分程度更高，特別是a這一分支，均為Cryptococcus podzolicus，各菌株之間的親緣關(guān)系較大，出現(xiàn)了種內(nèi)的分類(lèi)多樣性。

圖1　基于D1/D2區(qū)域構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 The phylogenetic relationships among species of Cryptococcus inferred from sequences of D1/D2

圖2　基于多位點(diǎn)序列(ITS，LSU，rpb1，rpb2)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2　The phylogenetic relationships among species of Cryptococcus inferred from a five-gene data set including sequences of ITS，LSU，rpb1，rpb2

2.2 MALDI-TOF-MS

對(duì)所有菌株的蛋白質(zhì)質(zhì)量圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，采用相似分值構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，得到MSP聚類(lèi)分析樹(shù)狀樹(shù)。在種間的比較層面，出現(xiàn)a、b、c 3個(gè)分支，a這一分支里面都是Cryptococcus podzolicus，從圖3中可清晰的看到Cryptococcus podzolicus中各菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，出現(xiàn)了明顯的分類(lèi)多樣性，各菌株之間的親緣關(guān)系差異較大。

圖3　MSP聚類(lèi)分析樹(shù)狀樹(shù)Fig.3 Clustering classification tree of 21 srains of Cryptococcus by MALDI-TOF-MS

3　討論

在絕大多數(shù)的真核生物中，表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使親緣關(guān)系非常近，也能顯示不同的進(jìn)化特征，但有的真菌由于進(jìn)化順序、變異等原因，在間隔區(qū)及核糖體大亞基序列上差異性較?。?3］。前期的隱球菌的分類(lèi)鑒定研究發(fā)現(xiàn)，ITS及D1/D2序列雖然在物種屬內(nèi)、近緣屬間乃至科內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究中有一定的價(jià)值，但不適合屬內(nèi)種及種群的分類(lèi)。本研究主要選取了Cryptococcus podzolicus和與之鄰近的一些其他種和屬的菌株，比較分析單一D1/D2區(qū)域、MALDI-TOF-MS及MLST 3種技術(shù)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

在MLST研究方面，本文中所使用的菌株大部分都可得到其目的片段，但還是存在4株菌株的tef1基因片段測(cè)序失敗，可能是該基因序列本身存在問(wèn)題，比較難進(jìn)行PCR擴(kuò)增或者是測(cè)序反應(yīng)，Schoch等［14］在研究過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了這一問(wèn)題，因此本研究構(gòu)建4個(gè)管家基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和單一D1/D2區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行對(duì)比研究。從圖1和圖2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可見(jiàn)均出現(xiàn)a、b、c 3個(gè)分支，各菌株的大體位置相似，但兩者又存在這一些差異。相似的地方是Cryptococcus podzolicus都在同a分支上，b這一分支也相同，不同之處在于MLST所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各菌株間的區(qū)分程度更高，從樹(shù)中更加清晰的了解Cryptococcus podzolicus種內(nèi)菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，另外一個(gè)差異則是Bullera miyagiana的位置，從MLST所得的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)看，其應(yīng)該更靠近b這一分支，由此可見(jiàn)間隔區(qū)及核糖體大亞基在序列上差異性較小，不適合屬內(nèi)種及種群的分類(lèi)，而MLST在隱球菌的種間及種內(nèi)分類(lèi)研究則更加穩(wěn)定和可靠。

在MALDI-TOF-MS研究方面，根據(jù)所得到的MSP聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖與單一D1/D2區(qū)域構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)比較分析，二者均出現(xiàn)了a、b、c 3個(gè)分支，相似的地方是Cryptococcus podzolicus都在同一分支上，b這一分支也相同，不同之處在于MALDITOF-MS所得到的MSP聚類(lèi)分析樹(shù)各菌株間的區(qū)分程度更高，從樹(shù)中更加清晰的了解Cryptococcus podzolicus種內(nèi)菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，還有則是Bullera miyagiawa的位置，其應(yīng)該更靠近b這一分支。由此可見(jiàn)MALDI-TOF-MS相比與傳統(tǒng)的D1/D2區(qū)域分析，在隱球菌的種間及種內(nèi)分類(lèi)研究則更加穩(wěn)定和可靠。

MALDI-TOF-MS結(jié)合MLST和D1/D2區(qū)域分析可見(jiàn)，圖3中的Ⅰ和Ⅱ簇菌有2株Cryptococcus podzolicus菌成為獨(dú)立的1個(gè)分支，而在圖2中，均出現(xiàn)了同樣的分支，綜合目前荷蘭真菌多樣性研究中心已測(cè)得的生理生化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)第Ⅰ簇的菌株在C23Glycerol和C28D-Glucitol的碳源利用實(shí)驗(yàn)中，其結(jié)果與其他Cryptococcus podzolicus菌株的結(jié)果存在差別，而第Ⅱ簇的菌株在C21Inulin、C28Ribitol和C38DL-Lactate的碳源利用試驗(yàn)及N1Nitrate、N6Creatine和N9Imidazole的氮源利用試驗(yàn)與其他Cryptococcus podzolicus菌株的結(jié)果有所不同，這充分說(shuō)明MALDI-TOF技術(shù)及MLST技術(shù)在種內(nèi)具有較強(qiáng)的區(qū)分能力。第Ⅲ簇的菌株包括了Cryptococcus paraflavus和Cryptococcus flavus兩個(gè)種的分支，在生理生化實(shí)驗(yàn)中也可發(fā)現(xiàn)在C9L-Rhamnose、C11Maltose、C13Me a-D-Glucoside、C15Salicin、C25Ribitol、C29D-Mannitol、C30Galactitol和C31myo-Inositol的碳源利用試驗(yàn)及N2Nitrite、N3Ethylamine和N5Cadaverine的氮源利用試驗(yàn)結(jié)果存在著明顯的差異，這說(shuō)明MALDI-TOF-MS技術(shù)及MLST技術(shù)在種間也具有較強(qiáng)的區(qū)分能力。

綜上，MLST及MALDI-TOF MS均可作為隱球菌屬分類(lèi)鑒別中有效的輔助鑒別的分子生物學(xué)方法，相比于傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)及間隔區(qū)和核糖體大亞基序列比較，二者均可準(zhǔn)確地揭示隱球菌種間及種內(nèi)各菌種的遺傳進(jìn)化關(guān)系，相比于MLST技術(shù)較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期及某些基因擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果的不確定性，MALDI-TOF-MS技術(shù)則更為快捷，成功率更高。

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(2015－08－10收稿，2015－11－23修回)

中文編輯:劉平;英文編輯:劉華

·基礎(chǔ)研究·

Application Research of Phylogenetic Analysis of Cryptococcus podzolicus with D1/D2，MLST and MALDI-TOF MS

LIU Taohua，WANG Yanyan，LU Qian，MOU Lili，CHEN Yan，KANG Yingqian
(Department of Microbiology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To compare and analyze the stability and reliability of multilocus sequence typing (MLST) and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) methods in taxonomic study of Cryptococcus，especially for Cryptococcus podzolicus.Methods: Twenty strains including Cryptococcus podzolicus and its adjacent strains were selected for the evaluation in this study; DNA was extracted using yeast genome extraction kit and 5 genes(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2，tef1) were amplified and sequenced.The phylogeny tree was constructed by Bayesian，maximum parsimony and neighbor-joining analyses.The protein fingerprint acquisition parameters were collected by MALDI-TOF-MS method.Clustering classification was conducted for the twenty strains and the phylogenetic tree was constructed based on BDAL and CBS fungi preservation center database.Results: There existed three clusters(a，b and c) in inter species level that can be observed on the phylogenetic trees made by three different molecular methods; In intraspecific level，all Crypto-book=140,ebook=21coccus podzolicus strains were classified into Cluster a，in which there was no apparent taxonomic diversity for the strains in the phylogenetic tree constructed by D1/D2，while the evolution distances among Cryptococcus podzolicus strains were easily identified by both MLST and MALDI-TOF-MS methods.Conclusion: MALDI-TOF-MS methods can be more effective for identification and classification of Cryptococcus species.Moreover，MALDI-TOF-MS is more efficient and accurate than MLST.

［Key words］multilocus sequence typing; matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry; Cryptococcus podzolicus; classification; developmental biology; evolution

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金(31060006，31260029) ;貴州省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目［黔科合SY字(2011) 3017號(hào)］;貴陽(yáng)市科技局社會(huì)發(fā)展與民生計(jì)劃

［中圖分類(lèi)號(hào)］R379.5

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1000-2707(2016) 02-0139-06