IL-6對Raji和OCI-LY8細胞生長影響的分子機制*＊?

楊文秀，李品浩，陳　琴，裴媛媛

(貴州醫(yī)科大學病理學教研室，貴州貴陽　550004)

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IL-6對Raji和OCI-LY8細胞生長影響的分子機制*＊?

楊文秀，李品浩，陳琴，裴媛媛

(貴州醫(yī)科大學病理學教研室，貴州貴陽550004)

［摘要］目的:觀察白介素-6(IL-6)對伯基特淋巴瘤(BL) Raji細胞和彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL) OCILY8細胞生長的影響，探討信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄活化-3(STAT3)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)分子在BL和DLBCL中發(fā)生發(fā)展的作用及其相互關(guān)系。方法:用不同濃度的IL-6(0、50、100、150及200 μg/L)分別培養(yǎng)Raji細胞和OCI-LY8細胞24 h、48 h及72 h(分別為對照組和不同濃度IL-6試驗組)，用MTT法檢查2株細胞生長情況，用RT-qPCR檢測培養(yǎng)48 h時2株細胞STAT3、TIMP-1的mRNA表達，用Western blot檢測100 μg/L IL-6培養(yǎng)48 h時Raji細胞的STAT3、p-STAT3及TIMP-1蛋白的表達，流式細胞技術(shù)檢測100 μg/L IL-6培養(yǎng)48 h 時2株細胞的細胞周期變化。結(jié)果:與相應(yīng)的對照組比較，不同濃度IL-6試驗組2株細胞在A490nm處OD值明顯降低，呈現(xiàn)藥物濃度依賴關(guān)系(P＜0.01) ; 2株細胞內(nèi)的STAT3，TIMP-1的mRNA表達明顯升高(P＜0.05)，呈現(xiàn)出藥物濃度依賴關(guān)系(P＜0.05)，2株細胞內(nèi)TIMP-1與STAT3的mRNA表達呈正相關(guān)關(guān)系(r =0.982，P = 0.018) ; IL-6組Raji細胞中p-STAT3、STAT3和TIMP-1蛋白表達增高; IL-6組Raji和OCI-LY8細胞的G1期細胞都明顯減少、S期細胞明顯增多(P＜0.05)，G2-M期的Raji細胞無明顯變化而OCI-LY8細胞則明顯增多(P = 0.037)。結(jié)論: IL-6對Raji細胞和OCI-ly8細胞生長有明顯作用，STAT3活化及其下游靶基因TIMP-1的上調(diào)表達可能是IL-6影響2株細胞生長的重要分子機制。

［關(guān)鍵詞］淋巴瘤，B細胞;伯基特淋巴瘤;細胞培養(yǎng);信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄活化子-3;基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1;白細胞介素-6

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2016－02－23網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1909.022.html

信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄活化子3(single transducer and transcription activater-3，STAT3)是STATS家族的重要成員，多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤中STAT3活性均發(fā)生高頻率的異?；罨?，且活化程度與患者的預(yù)后呈顯著負相關(guān)［1－4］。STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道的匯聚焦點［5］，阻斷STAT3傳導通路可以阻斷多種腫瘤發(fā)生的機制。近年來，以STAT3為靶點的腫瘤治療研究逐漸成為腫瘤基因治療研究的熱點。有文獻報道，伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma，BL)和彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)中存在STAT3分子的異常，但其活化對BL和DLBCL影響的分子機制尚未完全清楚［6－7］。本研究觀察了STAT3激動劑白介素-6(interleukin-6，IL-6)對BLRaji細胞和DLBCL-OCI-LY8細胞生長的影響，并進一步探討了STAT3和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1 (tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1)的活化是否是藥物作用的分子機制，為臨床治療BL和DLBCL尋找可能的基因靶點提供實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗材料

BL-Raji細胞株購自中國科學院上海細胞庫，DLBCL-OCI-LY8細胞株由復旦大學腫瘤醫(yī)院周曉燕教授惠贈。細胞培養(yǎng)基RPMI1640購自Hyclone公司，總RNA試劑盒購自上海碧云天公司，RTPCR試劑盒購自Invitrogen公司，抗STAT3(單克隆抗體)、抗TIMP-1和抗β-actin抗體購自Santa Cruz公司，抗p-STAT3抗體購自CST公司，IL-6購自Pepro TECH公司，PCR引物由上海生工合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和分組分別將Raji細胞和OCI-LY8細胞置于RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素)及混合培養(yǎng)基(含 10%胎牛血清、90% IMDM和1%雙抗)中，在37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，待細胞計數(shù)＞1×106/mL時，按1∶2～1∶3傳代培養(yǎng)。收集細胞并調(diào)節(jié)濃度為2× 105/mL，2株細胞分別加入不同濃度的IL-6(0、50、100、150及200 μg/L)，分別為對照組和不同IL-6濃度試驗組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72 h。

1.2.2檢測細胞活力用MTT法對細胞生長活力進行檢測。分別于培養(yǎng)24、48及72 h后收集對照組和不同IL-6濃度試驗組的Raji和OCI-ly8細胞，再于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，同步化后于96孔板布板。每孔加入0.5% MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入三聯(lián)溶劑(SDS 10 g +異丁醇5 mL + 10 mol/L HCl 0.1 mL，用雙蒸水溶解配成100 mL溶液) 150 μL，置搖床上低速振蕩10 min。鏡下觀察結(jié)晶物充分溶解后在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值A(chǔ)。每組5個復孔，實驗重復3次。

1.2.3檢測STAT3和TIMP-1的mRNA按試劑盒說明提取細胞mRNA，檢測mRNA 260/280光密度比值。RT-qPCR擴增檢測STAT3和TIMP-1的mRNA相對表達量。PCR循環(huán)參數(shù): 95℃10 min、90℃15 s、60℃1 min，40個循環(huán)。結(jié)果用2－ΔΔCT表示，以β-actin作為內(nèi)參照。mRNA相對表達量2－ΔΔCt= 2－［實驗組(Ct目的基因－Ct管家基因)－對照(Ct目的基因－Ct管家基因)］。PCR引物序列和產(chǎn)物見表1。

表1　RT-qPCR引物序列及相應(yīng)產(chǎn)物Tab.1　The sequences of the primers for RT-qPCR and corresponding products

1.2.4 STAT3、p-STAT3和TIMP-1蛋白表達IL-6的最佳作用濃度取100 μg/L，收集該濃度下培養(yǎng)48 h足量的Raji細胞，用PBS洗滌3次后，加入一定量的細胞裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上不時振蕩充分裂解30 min，12 000 r/m離心5 min后取上清液。蛋白樣品采用BCA法進行定量后，進行PAGE凝膠電泳，每孔上樣30 mg，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5% BSA封閉p-STAT3、5%脫脂牛奶封閉其他目的蛋白后，分別加一抗孵育過夜(稀釋度:抗STAT3、抗p-STAT3、抗TIMP-1均為1∶500，抗β-actin為1∶1 000)，二抗稀釋比例為1∶5 000，洗膜，加辣根過氧化酶偶聯(lián)的二抗孵育1.5 h、再洗膜。加ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光，得到STAT3、p-STAT3和TIMP-1的條帶膠片，膠片掃描后用Gelpro32軟件分析。

1.2.5檢測細胞周期分別將Raji細胞和OCILY8細胞以70 000 mL接種于6孔板中，加入最佳作用濃度(100 μg/L)的IL-6培養(yǎng)48 h后，收集Raji細胞和OCI-LY8細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包。STAT3，TIMP-1 的mRNA及蛋白表達水平采用兩獨立樣本t檢驗，藥物作用的多組間比較采用單因素方差分析，多組間均數(shù)的兩兩比較采用SNK q檢驗，多組均數(shù)與一個對照樣本均數(shù)比較采用Dunnett t檢驗。各藥物濃度組間兩分子表達之間的關(guān)系及分子表與藥物濃度的相關(guān)性關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1細胞活力

與相應(yīng)的對照組比較，Raji細胞及OCI-LY8細胞490 nm處吸光度值在加入IL-6培養(yǎng)后顯著增高(P＜0.05)。Raji和OCI-LY8細胞吸光度值與IL-6呈現(xiàn)出藥物濃度依賴關(guān)系，r和P依次為0.966、0.008及0.959、0.010。見圖1。

2.2 STAT3 mRNA和TIMP-1mRNA

各組細胞mRNA的A260/A280光密度比值為1.8～2.0，符合后續(xù)試驗要求。RT-qPCR結(jié)果顯示，與相應(yīng)的對照組比較，2株細胞的試驗組STAT3，TIMP-1的mRNA表達明顯升高，不同IL-6濃度試驗組Raji細胞和OCI-LY8細胞之間STAT3 和TIMP-1的mRNA表達均有顯著差異(P＜0.05)，且2種基因mRNA表達都呈現(xiàn)出藥物濃度依賴關(guān)系(Raji細胞IL6與STAT3 r = 0.979，P = 0.021，IL-6與TIMP-1 r = 0.981，P = 0.019; OCILY8細胞IL6與STAT3 r = 0.996，P = 0.004，IL-6 與TIMP-1 r =0.973，P =0.027)。2株細胞TIMP-1與STAT3的mRNA表達呈正相關(guān)(r = 0.961、0.998，P =0.039、0.002)。見表2。

2.3 Raji細胞p-STAT3、STAT3及TIMP-1蛋白

與對照組比較，100 μg/L IL-6培養(yǎng)48 h時的Raji細胞p-STAT3及STAT3蛋白升高，P分別為0.026、0.001，見圖2。

2.4細胞周期

Raji細胞和OCI-LY8細胞G0/G1、S、G2-M各周期的細胞百分率差異有統(tǒng)計學意義(P =0.001、P =0.001、P =0.000)。與對照組相比，試驗組Raji和OCI-LY8細胞的G1期細胞都明顯減少(P = 0.031和P = 0.019)，S期細胞明顯增多(P = 0.038和P = 0.034)，G2-M期的Raji細胞無明顯變化(P = 0.63)，G2-M期的OCI-LY8細胞則明顯增多(P =0.037)。見表3。

表2　不同濃度IL-6培養(yǎng)Raji和OCI-LY8細胞48 h時STAT3 mRNA及TIMP-1 mRNA水平Tab.2 The mRNA expressions of STAT3 and TIMP-1 in the Raji and OCI-LY8 cells treated with IL-6 for 48 h

表3　100 μg/L IL-6培養(yǎng)Raji和OCI-LY8細胞48 h時的細胞周期變化(±s)Tab.3 Propotion of the cell cycle in OCI-LY8 and the Raji cells cultured with 100 μg/L IL-6

表3　100 μg/L IL-6培養(yǎng)Raji和OCI-LY8細胞48 h時的細胞周期變化(±s)Tab.3 Propotion of the cell cycle in OCI-LY8 and the Raji cells cultured with 100 μg/L IL-6

(1)與相應(yīng)對照組比較，P＜0.05

細胞　　分組　　細胞周期細胞(%) G1　S　G2/M Raji　 Control 46.51±2.03　 44.31±1.01　 9.18±1 16.59±1.89 .90 IL-6　 40.81±2.29(1)49.94±2.59(1)9.25±1.71 OCI-LY8　 Control 55.74±2.55　 30.42±2.27　 13.88±0.40 IL-6　 49.02±1.91(1)34.39±2.09(1)

圖1　IL-6對Raji、OCI-LY8細胞生長的影響Fig.1　The effects of IL-6 at different concentrations for different times on the growth of the two kind of cells

圖2　100 μg/L IL-6培養(yǎng)48 h時Raji細胞中STAT3、p-STAT3、TIMP-1蛋白表達Fig.2 The protein levels of STAT3，p-STAT3 and TIMP-1 in the Raji cells with 100 μg/L IL-6

3　討論

有研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路持續(xù)激活可導致細胞異常增殖或惡性轉(zhuǎn)化，該通路在侵襲性B細胞淋巴瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［8－10］。用該通路的抑制劑可抑制STAT3在侵襲性惡性淋巴瘤細胞系中的活性。TIMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)家族中的一員。TIMPS是一個多基因家族編碼蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的內(nèi)源性特異性抑制因子。關(guān)于TIMP-1的研究，一方面認為它具有抗有絲分裂的活性，能促進內(nèi)皮細胞增生，能與基質(zhì)膠原酶、基質(zhì)分解素及明膠酶(主要是明膠酶B)形成可逆的復合物，通過抑制MMPs的活化及其對ECM的降解、抑制ECM中相關(guān)凋亡蛋白的釋放，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞凋亡及促進腫瘤細胞生長的功能［11］。還有研究認為，TIMP-1作為一種轉(zhuǎn)錄抑制劑抑制MMPs基因的轉(zhuǎn)錄;另一方面TIMP-1位于JAK/STAT信號通路的下游，其表達受JAK/STAT信號通路調(diào)控。后者可通過上調(diào)TIMP-1的表達而抑制大鼠腎小球系膜細胞凋亡［12］。近年來，在人紅白血病細胞研究中又發(fā)現(xiàn)TIMP-1和JAK/STAT存在雙向調(diào)控作用［13］。在肝的纖維化研究中發(fā)現(xiàn)敲除STAT3基因之后，CCl4導致的肝纖維化中TIMP-1的高表達消失［14］。同時有研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1可以由淋巴瘤細胞自分泌或旁分泌產(chǎn)生，通過B細胞生長分化因子IL-10以及原癌基因bcl-xL來抑制細胞程序性死亡，從而延長正常扁桃體B細胞、Burkitt淋巴瘤細胞的壽命［15］。還有研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1與非霍奇金淋巴瘤的臨床分級相關(guān)。

IL-6是IL-6/JAK信號通路的激活劑［16－17］，激活JAK后可促進STAT3的表達及磷酸化，以磷酸化二聚體的形式進入細胞核，與下游凋亡及細胞周期調(diào)控基因、基質(zhì)金屬蛋白酶等靶基因的啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖凋亡和遷移等過程。本研究在培養(yǎng)的Raji和OCI-LY8細胞中分別加入不同濃度的IL-6后，發(fā)現(xiàn)細胞生長活力增強，呈現(xiàn)出藥物濃度依賴關(guān)系。2株細胞G1期均體現(xiàn)出減少的趨勢，S期細胞明顯增多，處于G2-M的Raji細胞無明顯改變，而OCI-ly8細胞明顯增多。這表明JAK/STAT3信號通路對Raji和OCI-LY8細胞的生長可能有明顯的影響。進一步探討IL-6影響2株細胞生長的相關(guān)分子機制，本研究檢測了細胞內(nèi)STAT3和TIMP-1的mRNA及蛋白表達情況。Raji細胞和OCI-LY8細胞內(nèi)STAT3基因的mRNA表達水平隨著IL-6濃度的增加而增高，TIMP-1和STAT3的mRNA表達呈正相關(guān)關(guān)系。在IL-6作用48 h后Raji細胞內(nèi)p-STAT3，STAT3和TIMP-1蛋白表達明顯升高，三者變化趨勢一致。提示IL-6作用下，TIMP-1蛋白的表達可能與STAT3的活化有關(guān)。

綜上，IL6能顯著促進淋巴瘤Raji及OCI-LY8細胞的生長，并促進細胞周期的運行。其作用可能與細胞內(nèi)STAT3分子活化有關(guān)，細胞內(nèi)TIMP-1的上調(diào)表達也可能是IL-6活化STAT3的結(jié)果。2種細胞內(nèi)STAT3的活化及其引起的TIMP-1的表達上調(diào)可能是IL-6影響淋巴瘤細胞生長的重要機制，這可能是Burkitt和DLBCL淋巴瘤治療的新思路。

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(2015－12－20收稿，2015－12－31修回)

中文編輯:戚璐;英文編輯:趙毅

Molecular Mechanism of IL-6 Effect on the Growth of Two Lymphoma Cells

YANG Wenxiu，LI Pinhao，CHEN Qin，PEI Yuanyuan
(Department of Pathology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To observe the effects of IL-6 (interleukin-6) on the growth of Burkitt lymphoma (BL) cell line Raji and Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) cell line OCI-LY8，and to investigate their effect on cellular growth and the relationship between changes of STAT3 (single transducer and transcription activater-3) and TIMP-1 (tissue inhibitors of metalloproteinase-1) expression.

［Key words］lymphoma，B cell; Burkitt lymphoma; cell culture; single transducer and transcription activator-3; tissue inhibitors of metalloproteinase-1; interleukin-6

*［基金項目］國家自然科學基金(No.81160299) ;貴州省優(yōu)秀人才省長基金(No.2011.125)

［中圖分類號］R559; R34

［文獻標識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0125-05

Methods: Raji and OCI-LY8 cells were cultured by varied concentration of IL-6(0 g/L，50 g/L，100 g/L，150 g/L and 200 g/L) for 24 h，48 h and 72 h.Viability of 2 strains of cells was measured by MTT.The mRNA expressions of STAT3 and TIMP-1 of 2 strains of cells were detected by RT-PCR，and p-STAT3，STAT3 and TIMP-1 protein expression of Raji cell cultivated by 100 g/L IL-6 for 48 h were detected by Western blotting.Cell cycle was examined by flow cytometry.Results: Comparing with control group，OD value at 490 nm decreased the two strain of cells treated by varied concentration of IL-6.It was presented concentration-dependence relationship(P＜0.01) ; mRNA expressions of STAT3 and TIMP-1 in both cells exhibited positive correlation (r = 0.982，P = 0.018) ; protein expression of p-STAT3，STAT3 and TIMP-1 of Raji cells in IL-6 groups increased.Cells were distinctly reduced at phase G1 and increased at phase S in two types of cell of IL-6(P＜0.05).The Raji cell atphase G2-M showed no significant change while OCI-LY8 cells increased significantly(P = 0.037).Conclusions: IL-6 has an obvious effect on the growth of Raji and OCI-LY8 cell.The activation of STAT3 and up-regulated expression of TIMP-1 might be important molecular mechanism for promoting the viability of Burkitt and DLBCL cell.