結(jié)直腸癌患者腫瘤組織及血清ADAM10的表達(dá)

鄭佳，盛顯倉（臺州市第一人民醫(yī)院　消化內(nèi)科，浙江　臺州　318020）

?

結(jié)直腸癌患者腫瘤組織及血清ADAM10的表達(dá)

鄭佳，盛顯倉
（臺州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江臺州318020）

[摘 要]目的：檢測結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和血清中解離素金屬蛋白酶10（ADAM10）的表達(dá)，分析其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及臨床病理特征間的聯(lián)系。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測59例結(jié)直腸癌組織、30例結(jié)直腸息肉組織及30例正常對照人群腸黏膜中的ADAM10的表達(dá)情況，采用雙抗體夾心ELISA方法檢測上述3組人群血清中的ADAM10表達(dá)水平。結(jié)果：結(jié)直腸癌患者組織和血清中ADAM10的表達(dá)水平顯著高于結(jié)直腸息肉組和正常對照人群（P＜0.001）；伴隨著腫瘤Duke分期的增加，結(jié)直腸癌患者組織和血清中ADAM10表達(dá)水平進(jìn)行性升高。癌組織和血清中的ADAM10表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織類型無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Duke分期有關(guān)（P＜0.01）。

結(jié)論：ADAM10在結(jié)直腸癌患者癌組織和血清中高表達(dá)，且和結(jié)直腸癌的重要臨床病理特征相關(guān)，在結(jié)直腸癌的診斷中具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]結(jié)直腸腫瘤；病理分析；解離素金屬蛋白酶10

結(jié)直腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生和個(gè)人遺傳、飲食、環(huán)境等諸多因素有關(guān)。在我國隨著生活習(xí)慣的改變，發(fā)病率日益增高。解離素金屬蛋白酶10（adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）是一種跨膜金屬蛋白，通過調(diào)節(jié)Notch[1]、上皮細(xì)胞型鈣黏蛋白、表皮生長因子、表皮生長因子受體2和炎性細(xì)胞因子等，參與腫瘤的形成，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。大量研究表明，ADAM10在肝癌、前列腺癌[3]、黑色素瘤[4]、結(jié)腸癌[5]和口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌[6]等多種腫瘤中過表達(dá)，并在腫瘤的形成過程中起重要作用[7]。本研究通過檢測ADAM10在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和血清中的表達(dá)情況，探討其和臨床病理特征的關(guān)系，為進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制、腫瘤治療、推測預(yù)后提供依據(jù)。

1　資料和方法

1.1 一般資料 收集結(jié)直腸癌患者59例，其中男39例，女20例，年齡38～89歲，平均（63.3±12.8）歲，所有患者術(shù)前均未行放化療，病理結(jié)果證實(shí)為結(jié)直腸癌。結(jié)直腸息肉患者30例，其中男18例，女12例，年齡25～79歲，平均（47.2±13.7）歲，病理結(jié)果證實(shí)為結(jié)直腸腺瘤性息肉。正常對照人群30例，其中男17例，女13例，年齡21～66歲，平均（41.2±10.4）歲，腸鏡檢查陰性，各項(xiàng)生化指標(biāo)均正常。研究對象為2012年6月-2014年6月在臺州市第一人民醫(yī)院就診的門診、住院患者和健康體檢者。

1.2方法

1.2.1樣本采集：①組織采集：腸鏡檢查時(shí)采取新鮮的結(jié)直腸癌組織、腸息肉組織、正常腸黏膜組織，用4%甲醛溶液固定后保存待測；②血清采集：采用EDTA真空采血管分別抽取結(jié)直腸癌、結(jié)直腸息肉患者和正常健康對照者的靜脈血4 mL，以4 000 r/min離心15 min后分離血清，于-80 ℃保存待測。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法：①免疫組織化學(xué)SP法檢測癌組織、結(jié)直腸息肉組織、正常腸黏膜組織中的ADAM10表達(dá)，組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液高壓抗原修復(fù)；3%過氧化氫37 ℃溫箱孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加正常山羊血清37 ℃孵育10 min，滴加1:100的兔抗人ADAM10多克隆抗體，4 ℃冰箱過夜，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃濕盒孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）顯色劑顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精酚化，脫水干燥，中性樹膠封片。以試劑盒中陽性切片作為染色的陽性對照，磷酸鹽緩沖液替代一抗為染色的陰性對照。②ELISA法檢測結(jié)直腸癌、結(jié)直腸息肉患者和正常健康對照者的血清ADAM10的表達(dá)水平，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)正常人群測定結(jié)果確定臨界值范圍（說明書提供），ADAM10 ＜150 pg/mL。ELISA試劑盒、兔抗人ADAM10多克隆抗體均購自上海晶美生物科技有限公司。

1.2.3結(jié)果判斷：ADAM10定位于細(xì)胞漿和胞膜，呈棕黃色細(xì)顆粒狀，胞核不染色，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野，以陽性細(xì)胞比例的平均值定義為該腫瘤的陽性細(xì)胞百分比。細(xì)胞不著色為“-”；陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為“+’’；陽性細(xì)胞數(shù)25%～75%為“++”；陽性細(xì)胞數(shù)＞75%為“+++”。以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，染色的強(qiáng)弱以0～3表示，染色范圍以0～100表示，通過染色強(qiáng)度和染色范圍相乘得到染色積分（0～300），染色積分＞中位數(shù)為高表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果由2位病理科醫(yī)師分別采取雙盲閱片判定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Excel制作統(tǒng)計(jì)圖，計(jì)量資料用±s表示，組間率的比較采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌患者血清中ADAM10的表達(dá) 結(jié)直腸癌患者組ADAM10血清平均濃度為（347.4±32.2）pg/ mL，顯著高于結(jié)直腸息肉組（178.3±14.2）pg/mL和正常對照人群（82.6±10.6）pg/mL（P＜0.01），見圖1。結(jié)直腸癌患者Duke A、B、C、D期患者血清ADAM10水平分別為（195.4±18.6）pg/mL、（267.1± 27.8）pg/mL、（322.9±29.5）pg/mL、（390.6± 30.8）pg/mL。伴隨著腫瘤Duke分期的增加，結(jié)直腸癌患者血清ADAM10水平進(jìn)行性升高，Duke分期A、B、C、D 4期比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖1　結(jié)直腸癌、結(jié)直腸息肉、正常對照人群血清ADAM10水平

圖2　結(jié)直腸癌Duke A、B、C、D 4期血清ADAM10水平

2.2結(jié)直腸癌患者組織中ADAM10的表達(dá) ADAM10主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿和胞膜，細(xì)胞間質(zhì)不染色，見圖3a。ADAM10在結(jié)直腸癌中表達(dá)陽性率為77.97%，在結(jié)直腸息肉組織中及正常腸黏膜組織中表達(dá)陽性率分別為10%和6.6%，結(jié)直腸癌組織中的ADAM10的陽性率顯著高于結(jié)直腸息肉組和正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。伴隨著結(jié)直腸癌患者腫瘤分期的增加，結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中ADAM10表達(dá)陽性率也進(jìn)行性上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.3血清及腫瘤組織中ADAM10表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌患者血清及腫瘤組織中的ADAM10表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織類型無相關(guān)性（P＞0.05）；而與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Duke分期有相關(guān)性（P＜0.01）。見表1。

圖3　ADAM10在結(jié)直腸癌及正常腸黏膜中的表達(dá)（SP法，×400）

表1　結(jié)直腸癌患者血清ADAM10水平及腫瘤組織中ADAM10的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3　討論

ADAM10具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物功能，成為近年來研究的熱點(diǎn)，其屬于跨膜金屬蛋白酶，具有4個(gè)功能區(qū)域：蛋白水解域、粘連域、融合域和胞內(nèi)信號域，在很多惡性腫瘤中高度表達(dá)，和腫瘤細(xì)胞的復(fù)制、侵襲、浸潤過程有緊密的聯(lián)系[8-9]。研究證實(shí)ADAM10的過表達(dá)能促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌[10]和胃癌的生長，同樣發(fā)現(xiàn)通過干擾ADAM10使之表達(dá)下調(diào)可使腫瘤細(xì)胞減緩增殖，所以ADAM10被認(rèn)為是腫瘤治療的新的潛在靶點(diǎn)[6，11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者的血清ADAM10表達(dá)水平顯著高于結(jié)直腸息肉組和正常對照人群。伴隨著腫瘤Duke分期的增加，結(jié)直腸癌患者血清ADAM10水平進(jìn)行性升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸息肉組織及正常腸黏膜組織中的ADAM10的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中的ADAM10表達(dá)陽性率顯著高于結(jié)直腸息肉組和正常腸黏膜組，提示ADAM10可能參與了從正常-腺瘤-癌的整個(gè)結(jié)直腸癌的演變過程。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)ADAM10表達(dá)主要在細(xì)胞漿和胞膜，細(xì)胞間質(zhì)不染色，進(jìn)一步證實(shí)了ADAM10是一種跨膜蛋白，ADAM10通過對跨膜蛋白的蛋白水解、釋放胞外域的作用，并且還可和許多信號分子和黏附分子等相互作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤的過程。由此，我們推測血清中的ADAM10表達(dá)水平和組織中的ADAM10表達(dá)水平密切相關(guān)，ADAM10表達(dá)水平越高，侵襲性越強(qiáng)。結(jié)直腸癌細(xì)胞通過大量表達(dá)ADAM10來水解細(xì)胞外基質(zhì)來促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、浸潤。Murai等[12]在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251研究中表明，ADAM10能裂解黏附分子CD44，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。Schulz等[13]證實(shí)ADAM10有水解細(xì)胞外膠質(zhì)IV型胎盤膠原的作用，推測其可能參與癌細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散。Fogel等[14]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌和子宮癌中，ADAM10介導(dǎo)黏附分子L1釋放，增強(qiáng)細(xì)胞遷移和腫瘤播散。Gavert等[5]研究表明ADAM10的過表達(dá)可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的內(nèi)源性L1-CAM的斷裂和誘導(dǎo)肝轉(zhuǎn)移，同時(shí)也可以提高恒定轉(zhuǎn)染L1-CAM的結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。而本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血清ADAM10表達(dá)水平伴隨著腫瘤分期的增加而進(jìn)行性升高，進(jìn)一步提示ADAM10在腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。結(jié)直腸癌患者血清及腫瘤組織中的ADAM10表達(dá)和結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織類型無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Duke分期有關(guān)（P＜0.01），由此我們可以推測ADAM10的高表達(dá)和結(jié)直腸癌的預(yù)后密切相關(guān)，可以作為預(yù)后的指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)ADAM10在結(jié)直腸癌患者血清及組織中高表達(dá)，而在正常組織中極低表達(dá)，有潛力作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，如果能夠以調(diào)控ADAM10的表達(dá)為目標(biāo)，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，有希望為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]GIBB D R,EISHIKH M,KANG D J,et a1.ADAM10 is essential for Notch2—dependent marginal zone B cell development and CD23 cleavage in vivo[J].J Exp Med,2010,207(3):623-635.

[2]MOCHIZUKI S,OKADA Y.ADAMs in cancer cell proliferation and progression[J].Cancer Sci,2007,98(5):621-628.

[3]ARIMA T,ENOKIDA H,KUBO H,et a1.Nuclear translocation of ADAM-10 contributes to the pathogenesis and progression of human prostate cancer[J].Cancer Sci,2007,98 (11):1720-1726.

[4]LEE S B,SCHRAMME A,DOBERSTEIN K,et a1.ADAMl0 is upregulated in melanoma metastasis compared with primary melanoma[J].J Invest Dermatol,2010,130(3):763-773.

[5]GAVERT N,SHEFFER M,RAVEH S,et a1.Expression of L1-CAM and ADAMl0 in human colon cancer cells induces metastasis[J].Cancer Res,2007,67(16):7703-7712．

[6]KO S Y,LIN S C,WONG Y K,et a1.Increase of disintergin metalloprotease10 (ADAMl0) expression in oral squamous cell carcinoma[J].Cancer Lett,2007,245(1-2):33-43.

[7]WU E,CROUCHER P I,MCKIE N.Expression of members of the novel membrane linked metalloproteinase family ADAM in cells derived from range of haematological malignancies[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,235 (2):437-442.

[8]FREESE C,GARRATT A N,FAHRENHOLZ F,et al.The effects of alpha-secretase ADAM10 on the proteolysis of neuregulin-1[J]FEBS,2009,276(6):1568-1580.

[9]KOHUTEK Z A,DIPIERRO C C,REDPATH G T,et al.ADAM-10-mediated N-cadherin cleavage is protein kinase C-alpha dependent and promotes glioblastoma cell migration [J].J Neurosci,2009,29(14):4605-4615.

[10]關(guān)艷,鄺曉聰,姚金光.ADAM10在舌癌中的表達(dá)及其意義[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2011,27(11):98 1-983.

[11]MOCHIZUKI S,OKADA Y.ADAMs in cancer cell prolif-

eration and progression[J].Cancer Sci,2007,98(5):621-628.

[12]MURAI T,MIYAZAKI Y,NISHINAKAMURA H,et al.Engagement of CD44 promotes Rac activation and CD44 cleavage during tumor cell migration[J].J Biol Chem,2004,279(6):4541-4550.

[13]SCHULZ B,PRUESSMEYER J,MARETZKY T,et al.ADAM10 regulates endothelial permeability and T-Cell transmigration by proteolysis of vascular endothelial cadherin[J].Circ Res,2008,102(10):1192-1201.

[14]FOGEL M,GUTWEIN P,MECHTERSHEIMER S,et al.L1 expression as a predictor of progression and survival in patients with uterine and ovarian carcinomas[J].Lancet,2003,362(9387):869-875.

（本文編輯：吳彬）

·臨 床 經(jīng) 驗(yàn)·

·論著·

Study on the expression of ADAM10 in colorectal cancer tissues and serum

ZHENG Jia,SHENG Xiancang.
Department of Gastroenterology,Taizhou First People’s Hospital,Taizhou,318020

Abstract:Objective:To detect the expression of ADAM10 in colorectal cancer tissue and serum,analyze the relationship between colorectal cancer occurrence,development,and clinical pathological characteristics.Methods:Samples of 59 colorectal cancer tissues,30 colorectal polyps tissues and 30 health human of normal intestinal mucosa tissue were collected to detect the expressions of ADAM10 with immunohistochemistry SP.ADAM10 expression in serum of the above three groups was detected with double antibody sandwich ELISA method.Results:The expression level of ADAM10 in serum and tissue in the colorectal cancer patients was significantly higher than that in colorectal polyps groups and normal control groups (P＜0.001).ADAM10 expression levels were elevated in serum and tissue of the colorectal cancer patients with the increase of tumor Duke stage.The expression level of ADAM10 in serum and tissue of the colorectal cancer patients was no relationship with the sex,age,the location of the tumor,tumor size,histological type (P＞0.05),and was correlated with the tumor differentiation,lymphoid node diversion,distant metastasize,Duke stage (P＜0.01).Conclusion:Colorectal cancer patients has higher expression of ADAM10 in cancer tissue and serum,and related with clinical pathological characteristics of colorectal cancer.It has a certain clinical value in the diagnosis of colorectal cancer.

Key words:colorectal neoplasms; athological analysis; adisintegrin and metalloproteinase 10

作者簡介：鄭佳（1980-），女，浙江臺州人，主治醫(yī)師，碩士。

基金項(xiàng)目：臺州市黃巖區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011062-3）。

收稿日期：2015-04-22

[中圖分類號]R735.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.008