MIF基因多態(tài)性與剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥遺傳易感性相關(guān)性研究

林蓉蓉，谷杭芝，周星星，鄭飛云（.溫州醫(yī)科大學(xué)　第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江　溫州　505；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　婦科，浙江溫州　505；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　檢驗(yàn)科，浙江　溫州　505）

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MIF基因多態(tài)性與剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥遺傳易感性相關(guān)性研究

林蓉蓉1，谷杭芝2，周星星3，鄭飛云2
（1.溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江溫州325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，浙江溫州325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江溫州325015）

[摘 要]目的：研究巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）啟動子上游的rs2012133G/C、rs4822443A/G和rs4822446G/A位點(diǎn)基因多態(tài)性與剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥易感性的關(guān)系。方法：收集60例經(jīng)病理確診的剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥患者作為病例組，同期選取109例健康志愿者作為對照組，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法對MIF基因多態(tài)性進(jìn)行分析，分析基因型的分布及其與剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。結(jié)果：rs2012133G/C SNP的CC、CG、GG基因型頻率在病例組和對照組2組中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032）；C、G等位基因頻率分布2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.031）。與CG+CC基因型相比，攜帶GG基因型可明顯增加子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病風(fēng)險（OR=2.284，95%CI：1.200～4.345）。而rs4822443A/G、rs4822446G/A SNP的基因型頻率在病例組和對照組中的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：MIF rs2012133G/C位點(diǎn)基因多態(tài)性與剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的易感性有關(guān)，GG基因型是子宮內(nèi)膜異位癥的易感基因型。

[關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜異位癥；巨噬細(xì)胞移動抑制因子；基因多態(tài)性；剖宮產(chǎn)

子宮內(nèi)膜異位癥為婦科常見疾病，傳統(tǒng)上將其分為卵巢型、腹壁型和深部浸潤型。近年來無產(chǎn)科指征剖宮產(chǎn)及社會因素剖宮產(chǎn)逐年增加，剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病率也呈上升趨勢，逐漸引起婦產(chǎn)科醫(yī)師的重視。巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種可溶性淋巴因子。已有研究證實(shí)MIF水平在子宮內(nèi)膜異位癥患者的外周血及腹腔液中呈明顯升高的趨勢[1]。MIF基因多態(tài)性在子宮內(nèi)膜異位癥中已有研究[2-4]，而MIF基因啟動子上游的rs2012133G/C、rs4822443A/G和rs4822446G/A位點(diǎn)的基因多態(tài)性與剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系尚未見報道，故本研究擬用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）技術(shù)，探討MIF基因多態(tài)性與剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥易感性的關(guān)系，進(jìn)一步闡明剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的分子機(jī)制。

1　資料和方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2015年7月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科收住的剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥患者共60例為病例組，年齡24～44歲，平均（33.48±6.93）歲。最短發(fā)病年齡為剖宮產(chǎn)術(shù)后4個月，最長為剖宮產(chǎn)術(shù)后5年。所有病例術(shù)后病理診斷為腹壁子宮內(nèi)膜異位癥。隨機(jī)選取同時期本院109例健康體檢者為對照組，年齡22～50歲，平均（31.25±7.17）歲，2組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。2組受試者彼此之間無血緣關(guān)系，家族史中無遺傳病，無肝炎、結(jié)核等感染性疾病，無糖尿病、甲狀腺功能異常等內(nèi)分泌疾病，無婦科良、惡性腫瘤，無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他自身免疫性疾病，3個月內(nèi)未服用過激素類藥物。對照組均通過腹部B超檢查及外周血CA125測定，排除腹壁子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌病。以上標(biāo)本采集均由受試者本人及其家屬知情同意。

1．2方法

1．2．1 DNA提?。呵宄靠崭箺l件下抽取2組受試者外周靜脈血3 mL，加入內(nèi)置有0.85 mL枸櫞酸鈉的試管中，使用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細(xì)胞DNA。

1．2．2 基因多態(tài)性檢測：MIF-rs2012133G/C、rs4822443A/G和rs4822446G/A基因型檢測采用PCRRFLP方法。PCR反應(yīng)體積為20 μL，其中模板DNA 1 μg，2X Taq PCR Mastermix 10 μL（北京天根生化科技有限公司），primer1（10 μmol/L）1 μL，primer2（10 μmol/L）1 μL（所有引物均由primer premier 5.0設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成，引物及退火條件見表1），雙蒸水補(bǔ)足至20 μL；酶切反應(yīng)體系10 μL，其中PCR產(chǎn)物4 μL，限制性內(nèi)切酶（北京NEB有限公司）0.2 μL，10X NEBuffer 1 μL，雙蒸水補(bǔ)足至10 μL，37 ℃水浴4 h。酶切產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。通電，穩(wěn)壓110 V，電泳以溴酚藍(lán)指示劑至膠2/3處停止。

表1　各基因位點(diǎn)的引物、退火條件、產(chǎn)物長度、內(nèi)切酶種類及酶切后片段長度

1．3統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以非條件logistic回歸方法計算等位基因和基因型相對風(fēng)險度的比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1酶切結(jié)果 rs2012133G/C位點(diǎn)GG基因型不能被HpaII酶切，只可見一條793 bp大小的條帶，而CC基因型被HpaII酶切后可見一條209 bp和一條584 bp大小的條帶，GC基因型同時見上述三條條帶。rs4822446G/A位點(diǎn)GG基因型不能被AluI酶切，只可見一條326 bp大小的條帶，而AA基因型被AluI酶切后可見一條200 bp和一條126 bp大小的條帶，GA基因型同時見上述三條條帶。rs4822443A/G位點(diǎn)AA基因型不能被HaeIII酶切，只可見一條326 bp大小的條帶，而GG基因型被HaeIII酶切后理論上將會有一條298 bp和一條38 bp大小條帶，但38 bp的條帶在瓊脂糖凝膠上電泳速度過快，所以在最終曝光的結(jié)果中并不能見到清楚的38 bp條帶，所以GG基因型被HaeIII酶切后可見到一條略低于326 bp的298 bp大小的條帶，AG基因型同時見上述兩條條帶。見圖1。

2.22組研究對象Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 統(tǒng)計學(xué)處理顯示2組MIF-rs2012133G/C、rs4822443A/G 和rs4822446G/A基因型位點(diǎn)的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。

2.32組間多態(tài)性位點(diǎn)基因型、等位基因頻率比較

rs2012133G/C SNP的CC、CG、GC基因型頻率在病例組和對照組中分別是20.0%、25.0%、55.0%和 23.9%、41.3%、34.9%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.032）；C、G等位基因頻率分布在病例組和對照組中分別是32.5%、67.5%和44.5%、55.5%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.031）。使用logistic回歸分析計算結(jié)果顯示，與CG+CC基因型相比，攜帶GG基因型可明顯增加子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病風(fēng)險（OR=2.284，95%CI：1.200～4.345）。rs4822443A/ G和rs4822446G/A SNP的基因型頻率在病例組和對照組患者中的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖1　rs2012133G/C、rs4822446G/A及rs4822443A/G位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳圖

表2　2組研究對象3個基因位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較[n（%）]

3　討論

剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥是一種特殊類型的盆腔外子宮內(nèi)膜異位癥。隨著剖宮產(chǎn)率的逐年增加，其發(fā)生率也在不斷增高。一般認(rèn)為剖宮產(chǎn)瘢痕子宮內(nèi)膜異位癥系活性的子宮內(nèi)膜種植于腹壁剖宮產(chǎn)部位而產(chǎn)生的，屬醫(yī)源性種植[5]。但在實(shí)際觀察中發(fā)現(xiàn)，剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率遠(yuǎn)低于剖宮產(chǎn)切口污染率，可見該疾病發(fā)生與否并不完全由內(nèi)膜種植所致。近年來的大量研究發(fā)現(xiàn)，免疫調(diào)節(jié)異常參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展，免疫機(jī)制在異位內(nèi)膜的種植、定位、增殖及生長過程中起了很大的作用。子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)大量細(xì)胞因子分泌失調(diào)（包括數(shù)量及活性的改變），它們相互之間形成了正反饋，使體內(nèi)的無菌性炎癥反應(yīng)大大增加，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生及發(fā)展。因此，可以把子宮內(nèi)膜異位癥看作是一種免疫缺陷導(dǎo)致的炎癥相關(guān)性疾病。

目前已有較多研究將關(guān)注點(diǎn)聚焦于MIF，其在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用已日益受到重視。MIF是一種可溶性的細(xì)胞因子，人的MIF基因片段長度小于1 kb，位于22號染色體長臂（22ql1.2）的保守區(qū)內(nèi)，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成[6]。研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位病灶中和外周血中MIF水平明顯升高[1]。雌激素能刺激異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌MIF，而MIF又能反過來刺激雌激素合成過程中的關(guān)鍵酶—芳香化酶的表達(dá)，MIF在環(huán)路中起到了關(guān)鍵作用[7]。檢測子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液中的MIF水平發(fā)現(xiàn)，與對照人群比較其明顯升高[8]。早期的研究發(fā)現(xiàn)腹腔中的MIF主要由腹腔巨噬細(xì)胞分泌[9]，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔的巨噬細(xì)胞活性也發(fā)生了明顯的改變，其MIF的基礎(chǔ)分泌量和脂多糖刺激分泌量都較正常人多[10]。而在癌癥和其他炎癥性疾病領(lǐng)域?qū)IF的研究中發(fā)現(xiàn)，MIF不僅參與感染、自身免疫性疾病的病理生理過程，還可通過刺激細(xì)胞增殖和遷移[11]、促進(jìn)血管生成[12]、影響腫瘤抑制基因p53轉(zhuǎn)錄活性[13]、抑制細(xì)胞周期蛋白G1[14]等影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。MIF的作用似乎都涉及到了子宮內(nèi)膜異位癥形成的過程中的3A程序—黏附、侵襲、血管形成[15]。MIF在子宮內(nèi)膜異位癥無菌性炎癥中可通過抑制局部巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的移行，促進(jìn)其在炎癥部位的聚集、浸潤、增殖，增強(qiáng)其吞噬功能，并可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的釋放[16]。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子之一，同時也是一種有效的血管通透性誘導(dǎo)因子[17]。目前已有大量的研究表明在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程中VEGF是一個重要的因子。在早期子宮內(nèi)膜異位盆腔囊腫形成的過程中，聚集了更多的VEGF[18]，小鼠造模過程中形成的子宮內(nèi)膜異位癥病灶組織中，VEGF及其受體的表達(dá)明顯升高[19]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，腹腔中的VEGF也可以來源于巨噬細(xì)胞[20]。這些炎癥因子之間構(gòu)成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。但關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)高表達(dá)MIF的始發(fā)因素，目前仍未見相關(guān)報道。

本文將MIF基因啟動子區(qū)的MIF-rs2012133G/C、rs4822443A/G和rs4822446G/A三個SNP位點(diǎn)納入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs2012133G/C位點(diǎn)中攜帶GG基因型的女性剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病風(fēng)險增加（OR=2.284），GG基因型是子宮內(nèi)膜異位癥的易感基因型。推測rs2012133G/C位點(diǎn)中攜帶GG基因型的女性，其MIF基因啟動子的活性增強(qiáng)，從而增加MIF的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞在局部種植、黏附、浸潤、生長、病灶形成。而該位點(diǎn)突變的確切功能仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

參考文獻(xiàn)：

[1]MAHDIAN S,AFLATOONIAN R,YAZDI R S,et al.Macrophage migration inhibitory factor as a potential biomarker of endometriosis[J].Fertil Steril,2015,103(1):153-9.e3.

[2]王春平,秦成路,周蕓,等.MIF基因啟動子區(qū)-794CATT微衛(wèi)星多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性研究[J].中國婦幼保健,2011,26(7):1086-108 9.

[3]于雅,袁清連,王春平,等.MIF基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2013,13(5):625 -628.

[4]石瑾秋,張怡.巨噬細(xì)胞移動抑制因子- 173位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥關(guān)系的研究[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2010,26(9):668 -671.

[5]魏薇,盧丹,張建萍,等.剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁子宮內(nèi)膜異位癥手術(shù)119例臨床分析[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2010,19(8):573-579.

[6]BLOOM B R,BENNETT B,OETTGEN H F,et al.Demonstration of delayed hypersensitivity to soluble antigens of chemically induced tumors by inhibition of macrophage migration[J].Proc Natl Acad Sci USA,1969,64(4):1176-1180.

[7]VEILLAT V,SENGERS V,METZ C N,et al.Macrophage migration inhibitory factor is involved in a positive feedback loop increasing aromatase expression in endometriosis[J].Am J Pathol,2012,181(3):917-927.

[8]PIZZO A,SALMERI F M,ARDITA F V,et al.Behaviour of cytokine levels in serum and peritoneal fluid of women with endometriosis[J].Gynecol Obstet Invest,2002,54(2):82-87.

[9]CALANDRA T,BERNHAGEN J,MITEHELL R A,et al.The macrophage is an important and previously unrecognized source of macrophage migration inhibitory factor[J].J Exp Med,1994,179(6):1895-1902.

[10]AKOUM A,KONG J,METZ C,et al.Spontaneous and stimulated secretion of monocyte chemotactic protein-1 and macrophage migration inhibitory factor by peritoneal macrophages in women with and without endometriosis[J].Fertil Steril,2002,77(5):989-994.

[11]GUO P,WANG J,LIU J,et al.Macrophage immigration inhibitory factor promotes cell proliferation and inhibits apoptosis of cervical adenocarcinoma[J].Tumour Biol,2015,36 (7):5095-5102.

[12]CHOUDHARY S,HEGDE P,PRUITT J R,et al.Macrophage migratory inhibitory factor promotes bladder cancer progression via increasing proliferation and angiogenesis[J].Carcinogenesis,2013,34(12):2891-2899.

[13]BROCK S E,RENDON B E,XIN D,et al.MIF family members cooperatively inhibit p53 expression and activity [J].Plos One,2014,9(6):e99795.

[14]OLIVEIRA C S,DE BOCK C E,MOLLOY T J,et al.Macrophage migration inhibitory factor engages PI3K/Akt signalling and is a prognostic factor in metastatic melanoma[J].BMC cancer,2014,14:630.

[15]DONNEZ J,VAN LANGENDONEKT A,CASANASROUX F,et al.Current thinking on the pathogenesis of endometriosis[J].Gynecol Obstet Invest,2002,54 Suppl 1:52-58; discussion 59-62.

[16]VEILLAT V,CARLI C,METZ C N,et al.Macrophage migration inhibitory factor elicits an angiogenic phenotype in human ectopic endometrial cells and triggers the production of major angiogenic factors via CD44,CD74,and MAPK signaling pathways[J].J Clin Endocrinol Metab,2010,95 (12):E403-12.

[17]LEUNG D W,CACHIANES G,KUANG W J,et al.Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen [J].Science,1989,246(4935):1306-1309.

[18]NISOLLE M,CASANAS-ROUX F,DONNEZ J.Earlystage endometriosis:adhesion and growth of human menstrual endometrium in nude mice[J].Fertil Steril,2000,74 (2):306-312.

[19]MACHADO D E,BERARDO P T,PALMERO C Y,et al.Higher expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor VEGFR-2 (Flk-1) and metalloproteinase-9 (MMP-9) in a rat model of peritoneal endometriosis is similar to cancer diseases[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29(1):1-9.

[20]MCLAREN J,PRENTICE A,CHARNOCK-JONES D S,et al.Vascular endothelial growth factor is produced by peritoneal fluid macrophages in endometriosis and is regulated by ovarian steroids[J].J Clin Invest ,1996,98(2):482-489.

（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

·消息·

Correlation study of single nucleotide polymorphisms in macrophage migration inhibitory factor gene with the risk of abdominal wall endometriosis after cesarean section

LIN Rongrong1,GU Hangzhi2,ZHOU Xinxin3,ZHENG Feiyun2.1.First Clinical Medical College,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 2.Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 3.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Abstract:Objective:To investigate whether polymorphisms of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in promoter region (rs2012133G/C,rs4822443A/G and rs4822446G/A) are associated with hereditary susceptibility of abdominal wall endometriosis after cesarean section.Methods:Sixty patients with abdominal wall endometriosis after cesarean section were selected as case group and 109 healthy volunteers were collected as control group.The genotypes were detected by polymorphism chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis (PCR-RFLP).Results:There were statistical differences in genotype frequencies and allele frequencies between the case group and the control group (P=0.032; P=0.031) in rs2012133G/C site,GG genotype may markedly increase the risk of abdominal wall endometriosis after cesarean section (OR=2.284,95%CI:1.200～4.345).While no significant statistical differences could be found in rs4822443A/G,rs4822446G/ A sites (P＞0.05).Conclusion:The results suggest that MIF rs2012133G/C polymorphism is associated with abdominal wall endometriosis after cesarean section,GG genotype is the risk genotype.

Key words:endometriosis; macrophage migration inhibitory factor; polymorphism; cesarean section

通信作者：鄭飛云，主任醫(yī)生，教授，博士生導(dǎo)師，Email：zfy 5710@163.com。

作者簡介：林蓉蓉（1990-），女，浙江溫州人，碩士生。

基金項目：浙江省臨床醫(yī)學(xué)重中之重一級學(xué)科開放基金（447201 206/002）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20140125）。

收稿日期：2015-12-09

[中圖分類號]R711.71

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.005