謝玉球,時(shí) 曉,周二干,苗秀珍,朱 超,葛向陽(yáng)(.江蘇洋河股份有限公司,江蘇宿遷3800;.江南大學(xué),江蘇無(wú)錫4)
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洋河大曲中糖化酶高產(chǎn)霉菌的篩選鑒定及固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化
謝玉球1,時(shí)曉1,周二干1,苗秀珍1,朱超1,葛向陽(yáng)2
(1.江蘇洋河股份有限公司,江蘇宿遷223800;2.江南大學(xué),江蘇無(wú)錫214122)
摘要:從洋河酒廠中高溫大曲中利用透明圈初篩得到5株霉菌,通過(guò)固態(tài)發(fā)酵測(cè)定酶活復(fù)篩的方法分離出1株產(chǎn)糖化酶且酶活性較高的霉菌菌株(編號(hào)YH-01),根據(jù)其形態(tài)特征和ITS序列分析,該菌株為米曲霉(Aspergillus oryzae)。以該菌株為出發(fā)菌株,通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件,測(cè)得糖化酶在料水比5∶3、裝料量40 g/500 mL、發(fā)酵時(shí)間6 d時(shí)活力最高。
關(guān)鍵詞:微生物;洋河大曲;糖化酶;篩選;鑒定;固態(tài)發(fā)酵
糖化酶是淀粉糖化酶(Glucoamylase EC.3.2.1.3)的簡(jiǎn)稱,又稱為γ-淀粉酶(γ- amylase),因發(fā)酵工業(yè)中大量用作淀粉糖化劑,習(xí)慣上簡(jiǎn)稱糖化酶。糖化酶能從淀粉非還原性末端依次切下一個(gè)葡萄糖單位,將淀粉水解成葡萄糖,因此,它廣泛運(yùn)用于酒精、白酒釀造、抗生素、氨基酸、有機(jī)酸、甘油、紡織、日化等生物工業(yè)中[1]。糖化酶是我國(guó)產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的酶制劑之一。在傳統(tǒng)的釀酒工藝中,采用的是自然接種,網(wǎng)羅自然界中的微生物[2],不同微生物最佳生長(zhǎng)和產(chǎn)酶條件不同,而制備強(qiáng)化大曲能夠有效的提高原料利用率、降低生產(chǎn)成本、縮短生產(chǎn)周期等。本實(shí)驗(yàn)利用傳統(tǒng)的分離方法和分子生物學(xué)相結(jié)合,篩選出糖化酶活性強(qiáng)的菌種,為葡萄糖生產(chǎn)或制備強(qiáng)化大曲應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
1.1材料、試劑與儀器
1.1.1材料
大曲樣取自江蘇洋河酒廠股份有限公司制曲廠房。
1.1.2主要藥品與試劑
硫酸銅(CuSO4·5H2O),次甲基藍(lán),酒石酸鉀鈉,氫氧化鈉,亞鐵氰化鉀,0.1 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,2 %可溶性淀粉溶液,醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH4.6),1 mol/L氫氧化鈉溶液,TE溶液,溶菌酶,SDS,蛋白酶K,飽和酚-氯仿,無(wú)水酒精,10×PCR緩沖液,dNTPs,Taq DNA聚合酶。
1.1.3儀器及設(shè)備
恒溫振蕩搖床,恒溫培養(yǎng)箱,數(shù)字滴定器,離心機(jī),顯微鏡,恒溫振蕩水浴鍋,PCR擴(kuò)增儀。
1.1.4培養(yǎng)基
分離培養(yǎng)基:可溶性淀粉0.5 g,硝酸鈉3.0 g,磷酸氫二鉀1.0 g,氯化鉀0.5 g,硫酸鎂0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,蔗糖30.0 g,曲藥浸汁(取曲藥200 g,加入1000 mL水煮沸30 min,4層紗布過(guò)濾后抽濾至澄清)200 mL,瓊脂20.0 g,蒸餾水800 mL,氯霉素105 U,去氧膽酸鈉30.0 mg,pH6.0±0.2,0.1 MPa,121℃條件下滅菌20 min,冷卻至約50℃,倒6~7塊平板/100mL,冷卻備用。
圖1 初篩后各霉菌PDA平板菌落形態(tài)
PDA培養(yǎng)基:200 g土豆,洗凈去皮切成小塊,加水1000 mL,煮沸20 min,紗布過(guò)濾,濾液加水補(bǔ)足1000 mL,再加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂,在0.1 MPa,121℃條件下滅菌20 min。
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮∶水=5∶3,攪拌均勻后取分裝到500 mL三角瓶中,每瓶45 g/500 mL,在0.1 MPa,121℃條件下滅菌20 min。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1初篩
稱取5 g大曲粉,放入盛有45 mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中。振搖10 min,振蕩混勻后靜置,吸取上清液1 mL加入9 mL無(wú)菌水試管中,依次進(jìn)行梯度稀釋,制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的溶液,吸取各梯度溶液0.1 mL于分離培養(yǎng)基上涂布均勻,置于30℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)3~4 d。觀察分離培養(yǎng)基平板長(zhǎng)出的菌落周圍有無(wú)透明水解圈,取水解圈較大者接種于PDA平板上劃線分離至純種,菌種試管斜面保存。
1.2.2復(fù)篩
初篩中選擇水解圈較大的5株菌,進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn),取直徑1 cm的各菌株霉菌瓊脂小塊放入霉菌固體培養(yǎng)基中搖晃均勻后,在30℃下培養(yǎng)3~7 d至長(zhǎng)出孢子。
稱取相當(dāng)于5.0 g絕干曲的曲粉,放在250 mL三角瓶中,加水(90-5×水分%)mL,緩沖液10 mL,在30℃水浴中浸泡1 h,每隔15 min攪拌1次。然后用干濾紙過(guò)濾,棄去最初5 mL,接收50 mL澄清濾液備用得粗酶提取液后進(jìn)行糖化酶活力的測(cè)定。酶活力越高,生產(chǎn)性能越好。
1.2.3高產(chǎn)糖化酶菌株的鑒定
菌株鑒定采用傳統(tǒng)絲狀真菌形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法,以菌落特征、顏色和顯微形態(tài)為依據(jù)[3-5],同時(shí)以研磨法提取的絲狀真菌染色體DNA為模板,擴(kuò)增待鑒定菌株的ITS序列,采用BLAST搜索程序,把實(shí)驗(yàn)中得到的實(shí)驗(yàn)信息與基因庫(kù)中的基因序列進(jìn)行比對(duì),獲得同源性分析結(jié)果。
1.2.4菌株生產(chǎn)性能的單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化
分別從料水比、裝料量、培養(yǎng)時(shí)間等因素通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行比較后,確定出產(chǎn)酶條件較好的因素水平,采用L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),以確定目標(biāo)菌株的最佳培養(yǎng)條件。
2.1菌株篩選結(jié)果
從洋河大曲中選擇水解圈較大的5株霉菌,圖1為這5株霉菌在PDA平板上分離純化后的菌落形態(tài)。經(jīng)過(guò)復(fù)篩,測(cè)得酶活(見(jiàn)圖2)。YH-01的糖化酶活性在3~6 d內(nèi)為最高,在6 d時(shí)達(dá)到最高,為3683.34 U/g;其次是菌株2-005、0-002、0-001。
圖2 各霉菌糖化酶活力曲線
2.2鑒定
菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快,表面初期呈白色、黃色或淡黃綠色,后變黃褐色,菌絲呈黃綠色,顯微鏡下觀察菌絲有隔膜、分生孢子梗下有足細(xì)胞。初步鑒定為曲霉。菌落如圖1中YH-01,菌絲體、孢子囊見(jiàn)圖3、圖4。
通過(guò)16S rDNA基因序列分析,菌株測(cè)序鑒定blast比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖5。YH-01菌株為米曲霉(Aspergillus oryza)。
2.3不同料水比對(duì)菌株產(chǎn)糖化酶的影響
選取酶活最高的菌株YH-01作為實(shí)驗(yàn)菌株。料水比設(shè)置為5∶1、5∶2、5∶3、5∶4、5∶5,按上述料水比加水,料水混合均勻后,按照45 g/500 mL的裝料量,分裝到500 mL三角瓶中,0.01 MPa滅菌20 min,冷卻后接種,接種量按1.2.2方法進(jìn)行,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d,取樣測(cè)定糖化酶活力,結(jié)果見(jiàn)表1。
圖3 菌絲體
圖4 分生孢子梗及孢子囊
圖5 YH-01的測(cè)序鑒定blast比對(duì)結(jié)果
由表1可以看出,料水比在5∶3時(shí),YH-01酶活最高,微生物的一切生化反應(yīng)都離不開(kāi)水,適宜的水分含量直接影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率,且米曲霉是好氧的微生物,當(dāng)料水比低于5∶3,麩曲中心含有未被消耗的淀粉顆粒,料水比在5∶3時(shí),麩皮濕潤(rùn)疏松,通氣性好,觀察發(fā)現(xiàn)菌絲均勻密集,曲呈棉絮狀,不易搖散,當(dāng)料水比高于5∶3時(shí),原料發(fā)黏,透氣性差,不利于菌絲的生長(zhǎng)。資料表明[6],營(yíng)養(yǎng)菌絲是酶的主要來(lái)源,氣生菌絲或分生孢子梗酶活很低或根本沒(méi)有,因此,曲霉菌絲生長(zhǎng)越旺盛,酶活相對(duì)就會(huì)高些。因此,采用5∶3的料水比做后續(xù)試驗(yàn)。
表1 不同料水比對(duì)YH-01產(chǎn)糖化酶的影響
2.4不同裝料量對(duì)菌株產(chǎn)糖化酶的影響
按照料水比5∶3,分別以35 g/500 mL、45 g/500 mL、55 g/500 mL和65 g/500 mL、75 g/500 mL的裝料量制備成固體培養(yǎng)基,接種后,30℃恒溫培養(yǎng)4 d,取樣測(cè)定糖化酶活力,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 不同裝料量對(duì)YH-01產(chǎn)糖化酶的影響
由表2可以看出,隨著裝料量的增加,目的菌株酶活降低,在沒(méi)用搖床培養(yǎng)的情況下,裝料量越少,越有利于霉菌菌絲的大量生長(zhǎng),但是裝料量太少,原料間距大,不利于菌絲的生成,且浪費(fèi)試驗(yàn)用三角瓶數(shù)量,而裝料量越多易造成菌絲生長(zhǎng)不均勻,浪費(fèi)原料,因此,選擇裝料量為45 g/500 mL。
2.5不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)糖化酶的影響
料水比5∶3,裝料量45 g/500 mL,滅菌冷卻后接種,從第3天開(kāi)始取樣測(cè)定糖化酶活力,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)YH-01產(chǎn)糖化酶的影響
由表3可以看出,從第3天開(kāi)始,YH-01菌株的糖化酶活力在3~6 d內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,糖化酶活力呈直線上升趨勢(shì),于第6天達(dá)到峰值3683.34 U/g干曲,之后隨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗和水分減少及孢子數(shù)增加,酶活力則快速下降。因此,YH-01菌株麩曲培養(yǎng)6 d酶活性最高。
2.6目標(biāo)菌株生產(chǎn)性能的正交試驗(yàn)優(yōu)化
通過(guò)單因素發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)確定,在料水比5∶3、裝料量45 g/500 mL、培養(yǎng)時(shí)間為6 d時(shí),米曲霉所產(chǎn)糖化酶活性最大。因此,試驗(yàn)采取不同料水比、裝料量、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素,每一因素選擇3個(gè)水平,以期獲得最佳產(chǎn)酶條件,試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表4、表5。
表4 目標(biāo)菌株產(chǎn)酶條件正交試驗(yàn)因素水平表
表5 目標(biāo)菌株產(chǎn)酶條件正交試驗(yàn)結(jié)果
由表5可知,YH-01產(chǎn)糖化酶最佳工藝組合為:A2B1C2,即料水比為5∶3,裝料量為40 g/500 mL,發(fā)酵時(shí)間6 d。3個(gè)因素對(duì)YH-01產(chǎn)糖化酶活強(qiáng)弱順序依次為A>B>C,即料水比>裝料量>發(fā)酵時(shí)間。
從洋河大曲中分離出5株糖化力較高的菌株,其中酶活最高的菌株YH-01經(jīng)過(guò)分子鑒定為米曲霉,以YH-01作為出發(fā)菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化,該菌株在料水比5∶3、裝料量40 g/500 mL、發(fā)酵時(shí)間6 d時(shí)酶活最高,糖化酶活力為3875.06 U/g干曲。將進(jìn)一步對(duì)該菌株酶的形成條件以及其固體發(fā)酵產(chǎn)酶的溫度、pH值、接種量、翻曲時(shí)間等進(jìn)行條件優(yōu)化,提高產(chǎn)酶率。因米曲霉具有較為豐富的酶系,擁有較高的蛋白酶活性,后續(xù)將研究不同曲料pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響,最終制備強(qiáng)化大曲應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)。
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Separation and Identification of Mold Strain with High-Yield of Glucoamylase from Yanghe Daqu and Optimization of Its Solid-State Fermentation Conditions
XIE Yuqiu1, SHI Xiao1, ZHOU Ergan1, MIAO Xiuzhen1, ZHU Chao1and GE Xiangyang2
(1.Yanghe Distillery Co.Ltd., Suqian, Jiangsu 223800; 2.Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122,China)
Abstract:Five mold strains were separated from Yanghe Daqu by transparent circle primary screening, then a strain YH-01 with high-yield of glucoamylase was separated from the five strains by measurement of enzyme activity after solid fermentation. According to its morphological characteristics and ITS sequence analysis, YH-01 was Aspergillus oryzae. Through single factor test and orthogonal tests, solid fermentation conditions of YH-01 were optimized and summed up as follows: the ratio of bran and water was 5∶3, loading capacity was 40 g/500 mL, and 6 d fermentation time. Under above conditions, the activity of glucoamylase was the highest.
Key words:microbe; Yanghe Daqu; glucoamylase; screening; identification; solid-state fermentation
通訊作者:苗秀珍,碩士,研究方向:工業(yè)微生物育種,E-mail:bilbobaggins@126.com。
作者簡(jiǎn)介:謝玉球(1957-),男,江蘇宿遷人,高級(jí)工程師,高級(jí)評(píng)酒師,國(guó)家白酒評(píng)委,現(xiàn)任江蘇洋河酒廠股份有限公司總工藝師。
收稿日期:2016-02-02
DOI:10.13746/j.njkj.2016040
中圖分類號(hào):TS262.3;TQ925.7;Q93-3
文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
文章編號(hào):1001-9286(2016)04-0039-04
優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間:2016-03-04;地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.ts.20160304.1442.008.html。