RP- HPLC法測定牛黃上清丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、小檗堿的含量

楊小軍，丁永輝西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州7304；甘肅食品藥品監(jiān)督管理局

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RP- HPLC法測定牛黃上清丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、小檗堿的含量

楊小軍1，丁永輝2
1西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州730124；2甘肅食品藥品監(jiān)督管理局

［摘要］目的：建立牛黃上清丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和小檗堿的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜（RP-HPLC）梯度洗脫，在不同波長下測定含量。色譜條件:Zorbax Ecl i pse XDB-C(18)鍵合硅膠(4.6 mm× 150 mm，5 μm)，流動相乙腈為0.2％磷酸水梯度洗脫，流速1.0 mL/mi n，柱溫為20℃，檢測波長分別為240 nm(梔子苷、芍藥苷)，275 nm(黃芩苷)，350 nm(鹽酸小檗堿)。結(jié)果：梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿分別在0.112～0.84μg(r=0.9998)，0.20～1.50μg(r=0.9992)，0.208～3.64μg(r=0.9990)，0.232～2.32μg(r=0.999 7)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為98.62％，100.30％，99.80％，98.92％，RSD分別為1.66％、1.93％、0.94％、0.95％。結(jié)論：該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，精密度高，重現(xiàn)性良好，可用于同時(shí)測定牛黃上清丸(大蜜丸)中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量，可為提升、完善牛黃上清丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及含量測定的方法提供科學(xué)依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］RP-HPLC;牛黃上清丸;梔子苷;芍藥苷;黃芩苷;鹽酸小檗堿

Determination of Jasminoidin,Peoniflorin,Baicalin and Berberine Hydrochloride in NiuHuang ShangQing Pills by RP-HPLC

YANG Xiaojun1,DING Yonghui2
1 Chemical Engineering Institute of Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730124,China;2 Gansu Food and Drug Administration

Abstract Objective:To establish the method for content determination of jasminoidin,peoniflorin,baicalin and berberine hydrochloride in NiuHuang ShangQing pills.Methods:RP-HPLC was adopted for gradient elution,and the contents were detected under different wavelength.Chromatographic conditions:Zorbax Eclipse XDB-C18bonded silica gel chromatographic column(4.6 mm×150 nm,5μm),mobile phase:acetonitrile:0.2％ phosphoric acid solution,gradient elution,flow rate was 1.0 mL/min,column temperature was 20℃,detection wavelengths were 240 nm (jasminoidin,peoniflorin),275 nm (baicalin) and 350 nm (berberine hydrochloride).Results:Jasminoidin,peoniflorin,baicalin and berberine hydrochloride presented better linear relationship in the ranges between 0.112 and 0.84 μg(r=0.999 8),0.20 and 1.50μg(r=0.999 2),0.208 and 3.64μg (r=0.999 0),0.232 and 2.32 μg(r=0.999 7),average recovery rates were 98.53％,100.30％,99.80％ and 98.62％ respectively.RSD were 1.66％,1.93％,0.94％ and 0.95％.Conclusion:The method,easy to operate,accurate and reproducible,couldbe usedto determine the contents of jasminoidin,peoniflorin,baicalinand berberine hydr ochloridein NiuHuang ShangQing pills simultaneously,and it could provide scientific evidence for improving quality control and content determination methods of NiuHuang ShangQing pills.

Keywords RP-HPLC;NiuHuang ShangQing pills;jasminoidin;peoniflorin;baicalin;berberine hydrochloride

牛黃上清丸(大蜜丸)是中醫(yī)治療實(shí)熱證的經(jīng)典方劑之一，首載于明代著名醫(yī)家李梴的《醫(yī)學(xué)入門》，是《中國藥典》歷年收載的品種［1］，藥方由人工牛黃、梔子、黃連、黃柏、黃芩、大黃、連翹、赤芍等十九味中藥調(diào)制而成。牛黃上清丸具有清熱瀉火、解毒消腫、除煩、疏風(fēng)等功效。牛黃上清丸(大蜜丸)的主要組成藥物為梔子、黃連、黃柏、赤芍、黃芩，梔子苷、鹽酸小檗堿、芍藥苷及黃芩苷。有報(bào)道采用高效液相色譜法對牛黃上清丸中黃芩苷和小檗堿的含量進(jìn)行測定［2-4］，但同時(shí)測定其中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此有必要對其進(jìn)行含量測定，以控制其質(zhì)量。筆者運(yùn)用高效液相色譜法建立同時(shí)測定梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的含量的方法，具有快速、方便、靈敏度高、選擇性好、可同時(shí)分析多種化合物等優(yōu)點(diǎn)，可為提升牛黃上清丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及含量測定的方法提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司提供)，G1322A型配置真空脫氣機(jī)、G1329A型自動進(jìn)樣器、DAD，G1315B型真空二極管陣列檢測器、G1311A型四元泵，Zorbox Eclipse XDB-C18鍵合硅膠色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；Agilent 1200色譜工作站(美國Agilent公司提供)；AB204-S型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司提供)；AP001-0671型抽濾機(jī)；AS3120型雙頻數(shù)控超聲波清洗儀(天津奧特賽斯恩斯儀器有限公司提供)；DFT-200型萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司提供)。甲醇(分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠生產(chǎn))，甲醇(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn))，乙腈(色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn))；磷酸(分析純，煙臺市雙雙化工有限公司生產(chǎn))；水為超純水。梔子苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：749-8801含量測定用)；芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110736-201333)；黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110715-201316供含量測定用)；鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110713-201209供含量測定用)；牛黃上清丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠提供，批號：0015447，0015483，1015268，規(guī)格6 g×10丸)。

2　溶液的制備

2.1對照品溶液的制備分別取梔子苷對照品、芍藥苷對照品、黃芩苷對照品和鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定后，分別置于10 mL容量瓶中，加一定量甲醇(分析純)，搖勻，置超聲儀中超聲至全部溶解，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，即得含梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿濃度分別為0.2、0.32、0.32、0.252 mg/mL。然后分別精確量取上述各對照品貯備液，按體積1∶1混合，充分搖勻，即得含梔子苷0.05mg/mL、芍藥苷0.08 mg/mL、黃芩苷0.08 mg/mL和鹽酸小檗堿0.063 mg/mL的混合對照品溶液。取適量混合對照品溶液，用微孔濾膜(孔徑：0.45 μm)濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用。

2.2樣品溶液的制備取牛黃上清丸約3 g，剪成小塊，精密稱定，置研缽中，以40 mL甲醇分次研磨，定量轉(zhuǎn)移至50 mL具塞容量瓶中，超聲提取1小時(shí)，取出放冷至室溫后加甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜(孔徑：0.45 μm)濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，備用。

2.3陰性對照品溶液的制備牛黃上清丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿分別來自中藥材梔子、赤芍、黃芩、及黃連和黃柏，按牛黃上清丸(大蜜丸)處方組成比例與制備方法，按樣品溶液的制備方法分別配制缺梔子、缺赤芍、缺黃芩、缺黃連和黃柏的陰性對照品溶液。

3　色譜條件

色譜柱：Zorbox Eclipse XDB-C18鍵合硅膠色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：20℃；檢測波長：240 nm(梔子苷，芍藥苷)，275 nm(黃芩苷)，350 nm(鹽酸小檗堿)；流動相：乙腈(A)-0.2％磷酸水溶液(B)；流速：1.0 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度梯度洗脫程序

3.1分離度考察分離度是用來判斷物質(zhì)在色譜柱中的分離情況，常用分離度作為色譜柱分離能力的指標(biāo)，用R表示。其中R=2(tR1-tR2)/(W1+W2)。精密吸取上述牛黃上清丸樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，結(jié)果見表2。

表2　分離度考察結(jié)果

從表2可以看出，梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5，表明4種待測組分均能與雜質(zhì)完全分離，分離效果良好。

3.2專屬性實(shí)驗(yàn)分別取混合對照品溶液、樣品溶液及各陰性對照品溶液，按3項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)行進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μm，記錄色譜圖，結(jié)果如下圖1—3。結(jié)果顯示，在樣品溶液色譜圖中，有與混合對照品溶液梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿保留時(shí)間相一致的特征峰，而陰性對照品無此特征峰，表明其他組分對所測組分無干擾。分析結(jié)果表明，本法的專屬性良好。

圖1　240 nm處的色譜圖

圖2　在275nm處的色譜圖

圖3　在350nm處的色譜圖

3.3拖尾因子實(shí)驗(yàn)檢查待測峰的拖尾因子是為了保證色譜柱的分離效果和測定精度。拖尾因子是通過計(jì)算5％峰高處峰寬與峰頂點(diǎn)至前沿的距離來評價(jià)峰形的參數(shù)，用T表示。其計(jì)算公式為：T=W0.05h/2d1。式中W0.05h為5％峰高處的峰寬；d1為峰頂點(diǎn)至峰前沿之間的距離。精密吸取樣品溶液，按3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，結(jié)果見表3。

表3　拖尾因子實(shí)驗(yàn)

從表3可以看出，梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的拖尾因子介于0.95～1.05之間，符合《中國藥典》規(guī)定，峰形良好。

3.4理論板數(shù)計(jì)算理論板數(shù)N用于評價(jià)色譜柱的效能，是色譜的柱效能參數(shù)之一。N取決于固定相的性質(zhì)(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、色譜柱柱長、流動相的種類好流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。若峰形對稱，則N可用下式表示：

N=5.54(tR/Wh/2)2式中tR表示保留時(shí)間，Wh/2表示半高峰寬。精密吸取上述混合對照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，結(jié)果見表4。

表4　理論板數(shù)

梔子苷的理論板數(shù)為17 617，芍藥苷的理論板數(shù)為65 145，黃芩苷的理論板數(shù)為185 695，鹽酸小檗堿的理論板數(shù)為129 346。

4　方法學(xué)考察

4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系考察按3項(xiàng)下的色譜條件，取混合對照品溶液按2、4、6、8、10、15、20、25、30、35 μL分別自動進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，其中梔子苷及芍藥苷的檢測波長為240 nm，黃芩苷與鹽酸小檗堿的檢測波長分別為275 nm、350 nm。分別以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為：

梔子苷：Y=2888X-8.3926，r=0.9998，線性范圍為0.112～0.84 μg；

芍藥苷：Y=831.43X-22.698，r=0.9992，線性范圍為0.20～1.50 μg；

黃芩苷：Y=1885.1X-265.87，r=0.9990，線性范圍為0.208～3.64 μg；

鹽酸小檗堿：Y=4312.1X-415.83，r=0.9997，線性范圍為0.232～2.32 μg。

表明梔子苷，芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的線性關(guān)系良好，見表5及圖4—7。

表5　梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

圖4　梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5　芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6　黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7　鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.2精密度實(shí)驗(yàn)分別取同一混合對照品溶液，按3項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)自動進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜峰面積，結(jié)果見表6。計(jì)算得梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.23％、1.37％、1.19％和1.04％。表明儀器精密度良好。梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.23％、0.93％、1.02％和0.90％。表明儀器精密度良好。

4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號的牛黃上清丸(批號：0015447)6份，每份約3 g，分別精密稱定，按3項(xiàng)下的制備方法平行制備供試品溶液6份，按3項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算各成分含量，測定結(jié)果見表7。梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的平均含量分別為0.584 2、0.755 2、5.672 0、0.628 9 mg/g，RSD分別為1.76％，2.21％，0.58％及0.91％。表明方法的重現(xiàn)性良好。

表6　精密度考察結(jié)果（n=5)

表7　重復(fù)性考察結(jié)果（n=6）

4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取配制好的同一供試品溶液(批號：1015268)，室溫下放置，每個(gè)2小時(shí)進(jìn)一次樣，進(jìn)樣量為10 μL，按3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，并記錄各測定時(shí)間下梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的色譜峰面積，測定結(jié)果見表8。計(jì)算得峰面積RSD依次為1.81％、1.68％、0.58％、1.43％。表明本供試品在24小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

4.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的同一批號(批號：0015483)牛黃上清丸(大蜜丸)6份，每份約3.0 g，按3項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，分別精密量取上述溶液1.0 mL，置于5 mL容量瓶中，分別加入含0.2 mg/mL梔子苷的對照品溶液0.19 mL，含0.32 mg/mL芍藥苷的對照品溶液0.14 mL，含0.32 mg/mL黃芩苷的對照品溶液1.0 mL，含0.252 mg/mL鹽酸小檗堿的對照品溶液0.15 mL，混合均勻，按上述含量測定項(xiàng)下的方法進(jìn)行測定，進(jìn)樣量為10 μL，記錄各色譜峰面積。按下式進(jìn)行回收率計(jì)算，結(jié)果見表9。

回收率(％)=(測得值-樣品中含量)/加入量×100％

表8　穩(wěn)定性考察結(jié)果

表9　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

計(jì)算結(jié)果得，梔子苷的平均回收率(n=6)為98.53％，RSD=1.66％；芍藥苷的平均回收率為99.38％，RSD=2.43％；黃芩苷的平均回收率為99.80％，RSD=0.94％；鹽酸小檗堿的平均回收率為98.92％，RSD=0.95％。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

4.6樣品含量測定分別取3個(gè)不同批號的牛黃上清丸(大蜜丸)各3份，每份約3 g，精密稱定，按3項(xiàng)下樣品的制備方法平行制備各樣品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量10 μL，在240 nm、275 nm、350 nm波長處分別記錄梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的色譜峰面積，根據(jù)線性回歸方程積計(jì)算牛黃上清丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見下面以批號為1015268、取樣量為3.000 3 g樣品的相關(guān)數(shù)據(jù)為例，分別計(jì)算牛黃上清丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的含量，見表10。

由于樣品中各待測成分濃度均在線性范圍內(nèi)，根據(jù)樣品制備過程和各待測成分的相應(yīng)線性方程計(jì)算。

5　討論

5.1流動相的選擇4個(gè)待測成分中，梔子苷、芍藥苷、黃芩苷屬于苷類化合物，鹽酸小檗堿為季銨生物堿，利用各待測成分的極性不同，因而在色譜柱中的保留時(shí)間不同而將各成分分開。但由于該制劑藥味眾多，干擾大，采用測定其中某一化合物的流動相體系均無法滿足對四種待測成分進(jìn)行有效的分離測定。本實(shí)驗(yàn)過程中考察了一定比例的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲醇-水、乙腈-0.2％磷酸水溶液等流動相體系，但分離效果均不理想，各目標(biāo)成分之間或目標(biāo)成分與雜質(zhì)成分之間無法達(dá)到良好分離甚至無法分離，或是目標(biāo)成分的保留時(shí)間過長。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著流動相中乙腈比例的增大，洗脫能力越強(qiáng)，但當(dāng)乙腈達(dá)到某一比例后，會導(dǎo)致保留時(shí)間縮短，各成分過早出峰，各個(gè)色譜峰不能完全分開。而當(dāng)流動相中的有機(jī)相采用甲醇時(shí)，基線飄移大。通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，以乙腈-0.2％磷酸水溶液作為流動相，采用梯度洗脫的方法，梔子苷、芍藥苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的分離效果最理想。

表10　牛黃上清丸（大蜜丸）含量測定結(jié)果

5.2檢測波長的選擇實(shí)驗(yàn)中通過DAD上得到的梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的紫外吸收光譜圖如圖8—11所示，可知梔子苷在197 nm 和240 nm處有吸收，芍藥苷在195 nm和237 nm處有吸收，黃芩苷在196、215、278 nm及318 nm處有吸收，鹽酸小檗堿在194、231、265 nm及351 nm有吸收。由于該味藥劑中成分多，干擾大，4個(gè)待測成分無法在同一波波長下測定，需采用多波長的檢測方法。梔子苷與芍藥苷在240 nm波長下檢測，黃芩苷在275 nm波長下檢測，而鹽酸小檗堿在350 nm波長下檢測。在此波長條件下，各成分分離度良好，色譜峰不拖尾，并可消除雜質(zhì)峰的干擾。

5.3提取溶劑、提取方法及提取時(shí)間的選擇提取溶劑與處理方法對牛黃上清丸中的梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量測定有較大影響。在選擇溶劑時(shí)，用過甲醇，甲醇-水(90∶10)，甲醇-水(70∶30)，甲醇-水(50∶50)，乙醇，氯仿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效果最好，與其他溶劑相比可提取到較多的有效成分，且操作簡便。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，以甲醇為溶劑，并通過超聲處理，可提取到較大量的有效成分。所以本實(shí)驗(yàn)在制備樣品溶液時(shí)均用甲醇為溶劑并加以超聲處理進(jìn)行提取。另外還對不同超聲處理時(shí)間進(jìn)行了對比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲處理1小時(shí)提取效果最佳，因此選擇超聲處理1小時(shí)用于供試品溶液的提取。

參考文獻(xiàn)

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作者簡介：楊小軍(1982—)，男，碩士學(xué)位，講師。研究方向：藥物分析。

收稿日期：2015-09-20

［中圖分類號］R284.2

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

［文章編號］1004-6852(2016)02-0027-07