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    白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞線粒體跨膜電位影響研究*

    2016-04-19 09:01:06唐晶姜鮮李茂孫玉紅章卓
    四川生理科學(xué)雜志 2016年1期
    關(guān)鍵詞:白藜蘆醇

    唐晶 姜鮮 李茂 孫玉紅 章卓△

    (1.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室,四川 瀘州 646000;

    2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)教研室,四川 達(dá)州 635000;

    3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,四川 瀘州 646000)

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    白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞線粒體跨膜電位影響研究*

    唐晶1,2姜鮮3李茂1孫玉紅1章卓1△

    (1.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室,四川 瀘州646000;

    2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)教研室,四川 達(dá)州635000;

    3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,四川 瀘州646000)

    摘要目的:探討白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC細(xì)胞活性及線粒體跨膜電位影響。方法:體外培養(yǎng)HUVEC,隨機(jī)分為L(zhǎng)PS組、陰性組、白藜蘆醇160、80、40、20 μg·l(-1)劑量組。其中,LPS組與白藜蘆醇各組分別以1 μg·ml(-1)LPS刺激細(xì)胞24 h后,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,熒光顯微鏡下觀察羅丹明染色后細(xì)胞線粒體跨膜電位。結(jié)果:白藜蘆醇各組均能提高LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞存活率,提高細(xì)胞線粒體跨膜電位,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論:白藜蘆醇能提高LPS刺激HUVEC細(xì)胞活性,提高細(xì)胞線粒體跨膜電位。

    關(guān)鍵詞:白藜蘆醇;HUVEC細(xì)胞;線粒體跨膜電位

    血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cell,VEC)參與了血管通透性,具有參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答,調(diào)節(jié)血管舒張、參與止血和趨化白細(xì)胞的作用[1]。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)屬于革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要成分,可以通過(guò)激活多種細(xì)胞因子損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,引起血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重炎性反應(yīng)[2]。而炎癥所致血管內(nèi)皮損傷是多種疾病和綜合征發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ),比如急性肺損傷、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病、創(chuàng)傷、休克、腫瘤等[2],因此探討尋找保護(hù)內(nèi)皮損傷的措施有重要意義。白藜蘆醇(Resveratro1,Res)是多年生草本植物蓼科蓼屬虎杖的根莖中的提取物,廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等天然食物或藥物中,具有抗炎、抗血小板聚集、抗氧化等生物藥理活性[3-5]。白藜蘆醇對(duì)LPS致HUVEC細(xì)胞凋亡保護(hù)效應(yīng)是否與細(xì)胞線粒體跨膜電位有關(guān)目前仍不清楚。據(jù)此,本文通過(guò)觀察不同劑量白藜蘆醇對(duì)LPS刺激下HUVEC細(xì)胞凋亡保護(hù)效應(yīng),分析其保護(hù)效應(yīng)是否與影響細(xì)胞線粒體跨膜電位有關(guān)。

    1材料與方法

    1.1試劑

    白藜蘆醇(陜西森弗生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20081478,純度98%);LPS(Sigma,L2880);HUVEC細(xì)胞(購(gòu)自武漢大學(xué)CCTCC細(xì)胞庫(kù));羅丹明123(碧云天生物技術(shù)研究所);RPMI1640培養(yǎng)基,胎牛血清(Hyclone,USA);CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

    1.2儀器

    超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司,SW-CJ-1F型);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司,CKX41型);酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司,DNM-9602型);熒光顯微鏡(德國(guó)LEICA公司,DMR型)。

    1.3CCK-8法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC后細(xì)胞活性的影響

    將LPS配成10 mg·ml-1母液分裝后-20℃凍存?zhèn)溆?。將白藜蘆醇用DMSO與無(wú)血清培養(yǎng)基配成640 μg·ml-1母液(DMSO濃度小于0.1%)。HUVEC細(xì)胞株采用RPMI1640+10%胎牛血清培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞,按1×105·ml-1細(xì)胞濃度接種于96孔板,每孔90 μl,培養(yǎng)24 h后處理。將細(xì)胞分為L(zhǎng)PS組(1 μg·ml-1LPS+細(xì)胞),陰性組(細(xì)胞+培養(yǎng)基),空白組(僅有培養(yǎng)基無(wú)細(xì)胞)以調(diào)整培養(yǎng)基的顏色誤差,白藜蘆醇分為160、80、40、20 μg·l-14個(gè)劑量組(白藜蘆醇+1 μg·ml-1LPS+細(xì)胞),溶媒對(duì)照組(DMSO+細(xì)胞)加終濃度為0.1%DMSO,處理時(shí)間為24 h,加入CCK-8 10 μl繼續(xù)培養(yǎng)1 h,酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值,以O(shè)D值反應(yīng)細(xì)胞活力。每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔,連續(xù)重復(fù)3次。

    1.4羅丹明染色檢測(cè)線粒體跨膜電位

    細(xì)胞分組同1.4,將不同處理后的HUVEC細(xì)胞用0.25%胰酶消化,收集1×l06個(gè)細(xì)胞,經(jīng)PBS清洗2次,與1 μmol·L-1羅丹明(Rhodamine 123,Rh123)在37℃共同孵育30 min,PBS清洗2次,熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2結(jié)果

    2.1白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC細(xì)胞后細(xì)胞活性影響

    LPS組細(xì)胞活力明顯下降,表明LPS抑制HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)明顯。與LPS組比較,白藜蘆醇160, 80, 40與20 μg·L-1可明顯提高細(xì)胞活力,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01),見(jiàn)圖1。

    圖1 白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC后細(xì)胞活力影響注:同LPS組比較,*P<0.05;**P<0.01

    2.2白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC細(xì)胞后對(duì)線粒體跨膜電位影響

    熒光顯微鏡結(jié)果顯示,LPS組熒光較強(qiáng),表明線粒體跨膜電位較低。陰性對(duì)照組熒光較弱,表明線粒體膜完整,線粒體跨膜電位較高。與LPS組比較,白藜蘆醇160, 80, 40 μg·L-1劑量組熒光強(qiáng)度弱于模型組,提示白藜蘆醇各劑量組能夠提高LPS刺激HUVEC細(xì)胞后的線粒體跨膜電位,見(jiàn)圖2。

    (A)陰性組              (B)LPS組

    (C)Res 160 μg·L-1           (D)Res 80 μg·L-1

    (E)Res 40 μg·L-1          (F)Res 20 μg·L-1圖2 白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC后線粒體跨膜電位影響(×200)

    3討論

    脂多糖致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制復(fù)雜,但主要與脂多糖激活多種細(xì)胞因子,激活NF-κB,改變線粒體跨膜電位有關(guān)[6]。線粒體跨膜電位(△ψm)與細(xì)胞凋亡間關(guān)系密切?!鳓譵是由線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電子的不對(duì)稱(chēng)分布造成。正常生理情況下,線粒體內(nèi)膜通透性很低,僅允許不帶電荷的小分子物質(zhì)通過(guò),是維持電化學(xué)質(zhì)子梯度、進(jìn)行氧化磷酸化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[7]。在細(xì)胞凋亡早期,線粒體外膜對(duì)蛋白質(zhì)的通透性增高,線粒體內(nèi)膜的跨膜潛能降低。線粒體膜電位降低,可引起細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)選擇羅丹明染色后熒光顯微鏡檢測(cè)線粒體跨膜電位。Rh123是一種可透過(guò)細(xì)胞膜的陽(yáng)離子熒光染料,其在正常細(xì)胞中能夠依賴(lài)線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì),熒光強(qiáng)度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時(shí),線粒體膜完整性破壞,線粒體跨膜電位破壞,Rh123重新釋放出線粒體,發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常細(xì)胞熒光較弱,表明線粒體膜完整。LPS刺激后的HUVEC細(xì)胞熒光較強(qiáng),表明線粒體跨膜電位受到破壞。白藜蘆醇干預(yù)后可以明顯看見(jiàn)熒光減弱,提示白藜蘆醇減少HUVEC細(xì)胞凋亡可能是與提高線粒體跨膜電位有關(guān)。

    綜上可以看出,脂多糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性影響與線粒體跨膜電位改變有關(guān),白藜蘆醇能夠改善LPS刺激HUVEC細(xì)胞后活性,可能與改變HUVEC線粒體跨膜電位有關(guān)。但由于白藜蘆醇藥理作用較多,涉及作用機(jī)制亦較多,因此白藜蘆醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制以及相關(guān)應(yīng)用尚需進(jìn)一步探討和研究。

    參考文獻(xiàn)

    1Maier JA. Endothelial cells and magnesium: implications in atherosclerosis[J]. Clin Sci (Lond), 2012, 122(9): 397-407.

    2Noratto GD, Angel-Morales G, Talcott ST, et al. Polyphenolics from a?aí(Euterpe oleracea Mart.) and red muscadine grape (Vitis rotundifolia) protect human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC) from glucose and lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammation and target microRNA-126[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59(14): 7999-8012.

    3Gresele P, Cerletti C, Guglielmini G, et al. Effects of resveratrol and other wine polyphenols on vascular function: an update[J]. J Nutr Biochem, 2011, 22(7): 201-211.

    4Zeuke S, Ulmer A J, Kusumoto S, et al. TLR4-mediated inflammatory activation of human coronary artery endothelial cells by LPS[J]. Cardiovasc Res, 2002, 56(1): 126-134.

    5Pirola L, Frojdo S. Resveratrol: one molecule, many targets[J]. IUBMB Life, 2008, 60(5): 323-332.

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    7Li Y, Shibata Y, Zhang L, et al. Periodontal pathogen aggregatibacter actinomycetemcomitans LPS induces mitochondria-dependent-apoptosis in human placental trophoblasts[J]. Placenta, 2011, 32(1): 11-19.

    8Emre Y, Hurtaud C, Nübel T, et al. Mitochondria contribute to LPS-induced MAPK activation via uncoupling protein UCP2 in macrophages[J]. Biochem J, 2007, 402(2): 271-278.

    Effects of resveratrol on mitochondrial membrane potential of HUVEC cells induced by LPS*

    Tang Jing1,2, Jiang Xian3, Li Mao1, Sun Yu-hong1,2, Zhang Zhuo1△(1.Department of Pharmacology, Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000;2.Department of Pharmacy, Dazhou Vocational and Technical College, Sichuan Dazhou 63500;3.Department of Anesthesia, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000)

    AbstractObjective:To investigate the effects of resveratrol on the mitochondrial membrane potential of the HUVEC cells induced by LPS. Methods: HUVEC cells were cultured in vitro and divided into LPS group, normal group, 160, 80, 40, 20 μg·L-1resveratrol group. LPS group and resveratrol groups were stimulated by 1 μg·m l-1LPS for 24 h, cell viability was observed by CCK-8; mitochondrial membrane potential were tested by the fluorescence microscope. Results: Compared with model group, resveratrol at the concentration of 160, 80, 40, 20 μg·L-1could increase the cell viability and increase the mitochondrial membrane potential significantly(P<0.05). Conclusion: Resveratrol could against the apoptosis of HUVEC cell induced by LPS, and the mechanism may be associated with the increasion of the mitochondrial membrane potential.

    Key Words:Resveratrol; HUVEC cell; Mitochondrial membrane potential

    (收稿日期:2015-10-24)

    作者簡(jiǎn)介:唐晶,女,講師,主要從事神經(jīng)藥理研究,Email:498926268@qq.com?!魍ㄓ嵶髡撸赫伦浚?,副教授,主要從事神經(jīng)與免疫藥理學(xué),Email:zhhuozhang100@163.com。

    *基金項(xiàng)目:四川省教育廳課題(編號(hào):14ZA0143)

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