31P-NMR分析湖泊植物和藻類有機磷方法優(yōu)化及形態(tài)研究

馮偉瑩,朱元榮,吳豐昌,劉沙沙,張 琛(1.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院,北京 100875；.中國環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點實驗室,北京 10001)

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31P-NMR分析湖泊植物和藻類有機磷方法優(yōu)化及形態(tài)研究

馮偉瑩1,2,朱元榮2*,吳豐昌2,劉沙沙1,2,張 琛2(1.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院,北京 100875；2.中國環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點實驗室,北京 100012)

摘要：應(yīng)用不同的提取劑和固液比提取湖泊水生植物和藻類中的藻類有機磷(Po),并進(jìn)一步采用液態(tài)核磁共振(31P-NMR)技術(shù)分析其組成特征.結(jié)果表明:采用0.5mol/L NaOH+25mmol/LEDTA提取劑,并控制固液比為1:60可獲得最優(yōu)的Po提取效果;31P-NMR分析測試過程中,設(shè)置延遲時間(D1)為5s,掃描分析時間為15h(約掃描24000次)可獲得較好的譜圖.通過以上實驗方法,分析水生植物和藻類中磷均由正磷酸鹽、單酯磷、二酯磷及焦磷酸鹽組成,其中Po可分別占總磷(TP)的34.21％～53.36％和31.27％～72.96％.單酯磷是水生植物和藻類Po的主要組分,其平均含量可占Po的92％和83％;二酯磷含量均較少,占TP的0～6.65％;藻類體內(nèi)焦磷酸鹽含量可達(dá)水生植物的35倍.

關(guān)鍵詞：湖泊；水生植物；藻類；有機磷；31P-NMR

* 責(zé)任作者, 助理研究員, zhuyuanrong07@mails.ucas.ac.cn

磷是水生生態(tài)系統(tǒng)關(guān)鍵的限制性營養(yǎng)元素之一,過量的磷導(dǎo)致藻類大量生長繁殖,引起水質(zhì)惡化并危害生態(tài)系統(tǒng)安全[1].外源輸入和內(nèi)源循環(huán)是導(dǎo)致湖泊水體磷大幅度增加的主要因素.近年來,包括生活污水、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、土壤徑流等過程攜帶的外源磷輸入得到了一定的控制,湖泊內(nèi)源磷的釋放成為引起湖泊水質(zhì)進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵因素[2-3].沉積物釋放是湖泊內(nèi)源磷污染重要的來源之一[4],但富營養(yǎng)化湖泊中廣泛存在的水生植物和藻類,其死亡腐爛分解后的產(chǎn)物可能是湖泊內(nèi)源磷另一個重要的來源[5-8].例如,太湖東南部草型湖灣(東太湖)水體表面覆蓋著高達(dá)東太湖總面積70％以上的水生植物,在藻類爆發(fā)期間,太湖北部(如梅梁灣)水體表面將會覆蓋著大量藻類,且藻類爆發(fā)后,產(chǎn)生藻毒素危害生態(tài)系統(tǒng)健康,引起一系列環(huán)境問題[9].這些水生植物和藻類死亡腐爛分解后,又會對水體造成二次污染,其中磷的釋放率遠(yuǎn)高于碳和氮,半個月內(nèi)磷的釋放量就可高達(dá)70％[10].因此,針對湖泊水生植物和藻類來源磷的研究十分重要.有機磷(Po)是水生植物和藻類中磷的重要組成部分,例如滇池水生植物中的Po可以占到其體內(nèi)總磷(TP)的50％以上[11].另外,已有研究表明Po在水生生態(tài)系統(tǒng)的磷循環(huán)中扮演重要角色,一些Po組分可通過酶水解轉(zhuǎn)化為生物可利用性活性磷酸鹽,進(jìn)而成為富營養(yǎng)化湖泊藍(lán)藻水華持續(xù)暴發(fā)的重要磷源[12-14].

由于分析測試方法的限制,對湖泊水生植物和藻類中Po化學(xué)結(jié)構(gòu)和形態(tài)等的研究還十分有限[11],多數(shù)研究一般僅限于有機磷總量的分析.然而,自Newman等[15]1980年將液相31P核磁共振(31P-NMR)技術(shù)首次應(yīng)用土壤提取液中磷的分析,該分析方法很大程度上提高了我們對環(huán)境樣品中Po組成結(jié)構(gòu)和特征的認(rèn)識.目前,該分析方法已成為表征環(huán)境中Po組成特征的強有力工具[16-18],但是主要集中于土壤[15]、沉積物[19]及腐殖質(zhì)[20]等物質(zhì)的研究.因此,本研究選擇湖泊具有代表性的水生植物和藻類,優(yōu)化其Po的提取方法和31P-NMR測定過程中的參數(shù)設(shè)置,并分析其組成結(jié)構(gòu)特征,這對探索湖泊水生植物和藻類Po在水華爆發(fā)過程中所做的貢獻(xiàn)以及湖泊內(nèi)源磷循環(huán)及機理具有重要科學(xué)意義.

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

典型的水生植物包括狐尾藻、蘆葦、輪葉黑藻,均采自太湖.太湖是是中國第三大淡水湖,也是典型的富營養(yǎng)大型淺水湖泊,位于30°55′40″～ 31°32′58″N,119°52′32″～120°36′10″E之間,水面面積為2250km2,湖泊平均水深1.9m,最大水深2.6m[21].近年來,由于人類活動強度的增加,太湖水質(zhì)不斷惡化,水化學(xué)環(huán)境也發(fā)生了重大的變化[9].2007年5月,太湖北部梅梁灣發(fā)生大規(guī)模水華事件;2008年,太湖北部竺山灣和西部沿岸湖區(qū)發(fā)生“黑水團(tuán)”事件;2009～2010年,監(jiān)測數(shù)據(jù)表明太湖水華爆發(fā)期間產(chǎn)生大量危害動植物健康的藻毒素[22].采集太湖水生植物全株,裝入密封袋并冷藏保存;藻類樣品包括微囊藻、小球藻、螺旋藻和念珠藻購買于武漢水生生物研究所,其中微囊藻是引起太湖藍(lán)藻水華的主要藻種.所采集樣品冷凍干燥后充分研磨,過2mm篩,4℃冷藏保存?zhèn)溆?

1.2 樣品中磷基本組成分析

總磷(TP)、無機磷(Pi)和Po的測定應(yīng)用SMT分析方法[18,23].簡述如下:準(zhǔn)確稱取0.5g水生植物和藻類粉末樣品兩份(每份3個平行),一份于馬弗爐中450℃煅燒3h,樣品降至室溫后轉(zhuǎn)移至離心管中,加入20mL 3.5mol/L HCl振蕩16h,離心分離后磷鉬藍(lán)[18,23]分光光度法分析上清液中磷濃度,即TP含量;另一份樣品置于離心管中,加入20mL 1mol/L HCl振蕩提取16h,離心后測定磷濃度,即Pi含量,最后由TP和Pi相減獲得水生植物和藻類Po含量.提取液用0.45μm濾膜過濾留取上清液,取適量提取液稀釋后用于提取液TP和提取液Pi分析.提取液TP測定需要首先利用5％過硫酸鉀121℃消解30min,提取液中Po為提取液TP和提取液Pi的差值,采用磷鉬藍(lán)法[18,23]在Agilent8453紫外分光光度計上測定.

1.3 有機磷提取

表1　不同提取條件的實驗設(shè)計Table 1 Experiment designing of different extraction conditions

提取劑及提取比例的不同將影響提取液中磷含量、組分以及結(jié)構(gòu)的檢測[24].有研究報道,水、NaAs-SD、弱酸、NaHCO3、H2SO4、NaOH、NaOH+EDTA等均可作為環(huán)境樣品中Po的提取,但在湖泊環(huán)境中,多采用NaOH和NaOH+EDTA作為Po的提取劑[16,25],因此本研究選擇(0.1,0.25, 0.5)mol/L NaOH+(0,10,25,50)mmol/LEDTA相互組合,1:30和1:60兩種提取比例尋找適合湖泊水生植物和藻類Po的最優(yōu)提取方法,設(shè)計編號為A-L(表1).

1.4 液體31P-NMR分析

取0.5g待提樣加入一定量的提取劑,室溫下振蕩提取16h,4℃條件下,8000×g離心30min后留取上清液,冷凍干燥形成粉末,盡快進(jìn)行31PNMR分析.研究所用核磁共振儀為BRUKER AV400M,瑞士BRUKER公司.31P-NMR分析前,將粉末樣品用0.6mL 10mol/LNaOH重新溶解, 以8000×g離心15min,加入0.2mLD2O鎖定信號,采用BRUKER標(biāo)準(zhǔn)腔5mm BBO探頭,31P的共振頻率為161.98Hz,測定溫度為20℃,譜峰寬度為5Hz,AQ為0.2102s.另外,NMR參數(shù)中延遲時間(D1)的設(shè)置分為2,5,15s,分析測試時間相應(yīng)為12,15,49h,掃描次數(shù)均為24000次.參照文獻(xiàn)[3,26]確定不同化學(xué)位移磷的組成.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑組成及提取劑比例

如圖1,A～C組實驗采用1:30提取比例,提取劑分別為0.1,0.25,0.5mol/L NaOH,TP提取率分別為41.79％,48.27％和49.18％,Po提取率分別為34.38％,42.60％和47.62％.表明采用0.25mol/L和0.5mol/LNaOH作為提取劑,TP和Po提取率明顯高于0.1mol/L NaOH.張文強等[27]報道pH＞12時,磷組分提取率較高.因此,0.1mol/LNaOH 提取條件下,pH值條件可能未滿足最佳提取環(huán)境,導(dǎo)致一些磷組分未獲得充分的提取.

D～F組實驗采用1:60提取比例,提取劑分別為0.1,0.25,0.5mol/LNaOH,則TP提取率除D組(0.1mol/LNaOH)以外,E組和F組TP提取率明顯高于B組和C組,分別為69.57％和70.35％.同時,Po提取率也明顯高于B和C組,分別為74.56％ 和79.39％.另外,固液比為1:30的提取比例會導(dǎo)致提取液過于黏稠,固液分離效果差,而提取比例為1:60時,提取液既能充分與樣品粉末融合又不會過于黏稠且易分離,提取率更高.這表明采用固液比為1:60的提取比例更適合磷組分的提取.因此,湖泊水生植物和藻類Po的提取固液比例確定為1:60.

另外,從B～C組和E～F組實驗中,均表明0.5mol/LNaOH提取劑比0.25mol/LNaOH提取磷組分略微偏高.然而,70％左右的提取率并未達(dá)到最佳的提取效果.其他環(huán)境樣品(如土壤、沉積物等[3,25])中Po提取劑一般采用NaOH與EDTA混合液,其中EDTA與金屬離子螯合并進(jìn)一步釋放磷,可提高磷的提取效率,且EDTA可與順磁性金屬離子(如Fe和Mn)螯合,提高后續(xù)核磁共振分析的分辨率.因此,進(jìn)一步將0.25mol/L NaOH和0.5mol/L NaOH溶液分別與10,25,50mmol/L EDTA溶液相互組合,利用這6 種NaOH-EDTA提取劑進(jìn)一步提取并分析提取效果(G～L組,表1).

分析0.25mol/L NaOH與EDTA提取效果:G 組TP和Po提取率分別為73.27％和56.90％;H 組TP提取率略低于G組,為69.98％,但Po提取率略高于G組,為62.80％;I組TP和Po提取率分別為71.97％和80.74％(圖1).這表明對于植物和藻類樣品而言,添加EDTA后的提取效率比單獨使用NaOH作為提取劑的提取效率高,但TP提取率仍不超過75％.由于環(huán)境樣品提取液中較低的TP含量,將直接影響其他磷組分的表征,間接影響31P-NMR檢測的靈敏度[24,28],因此提取劑仍需優(yōu)化.

進(jìn)一步分析0.5mol/LNaOH與10,25, 50mmol/LEDTA溶液相互組合(圖1):J組TP和Po提取率分別為92.51％和79.51％,TP提取效果較好,Po提取率略低;K組TP和Po提取率為96.16％和90.06％;L組TP和Po提取率為92.30％ 和81.73％.其中K組(0.5mol/LNaOH+25mmol/ LEDTA)對植物和藻類TP和Po的提取效果最優(yōu).因此,選擇1:60固液提取比,0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA溶液組合為最優(yōu)提取劑,提取湖泊水生植物和藻類樣品中Po,并進(jìn)行接下來的31P-NMR分析.

圖1　不同提取條件的湖泊水生植物和藻類磷組分提取率Fig.1 Recovery of phosphorus from aquatic plants and algae by different extraction conditions　A～F分別代表提取比例為1:30和1:60時,提取劑分別為0.1,0.25, 0.5mol/L NaOH的TP、Po提取率;G～L分別代表提取比例為1:60時,提取劑分別是(0.25,0.5) mol/L NaOH+(10,25, 50)mmol/L EDTA的TP、Po提取率,詳見表1.不同提取條件的提取率差異性極顯著,P<0.01

2.231P-NMR分析及其延遲時間的設(shè)定

樣品31P-NMR分析過程中參數(shù)設(shè)置,如延遲時間(Delaytimes,D1)、分析測試時間等對于譜圖分辨率以及樣品中各磷的組分的的定性和定量十分重要[29].不同研究中所采用的參數(shù)也存在差異,如Read等[29]選擇4.5s的延遲時間對河流與湖泊中磷組成進(jìn)行了分析,而Zhang等[25]和張文強等[27]采用2s的延遲時間進(jìn)行巢湖和海河沉積物樣品中Po進(jìn)行了分析.另外,一些環(huán)境樣品31P-NMR分析過程中還有采用4.32s、8s甚至更長延遲時間[30]. 在同等掃描次數(shù)條件下,延遲時間越長則樣品分析需要的時間越長.

圖2　湖泊藻類磷組分不同延遲時間的液態(tài)31P-NMR圖譜Fig.2 Solution31P-NMR spectroscopy of phosphorus from algae with different delay times (D1)

以小球藻NaOH-EDTA提取液的31P-NMR分析為例,分別設(shè)置延遲時間D1為2s、5s和15s,其他參數(shù)設(shè)置相同,分析結(jié)果如圖2和表2.實驗結(jié)果表明隨著測試時間的增長,單酯磷和二酯磷含量及積分比例均降低,正磷酸鹽和焦磷酸鹽含量及積分比例均上升.D1從2s到5s時,單酯磷含量降低4.71％,二酯磷含量降低不足0.5％,而相應(yīng)的正磷酸鹽和焦磷酸鹽分別上升6.36％和1.10％. D1從5s到15s導(dǎo)致分析結(jié)果的變化較為明顯,其單酯磷含量降低6.08％,二酯磷分解的更為劇烈,從424mg/kg降低到107mg/kg,約有75％二酯磷分解了,相應(yīng)的正磷酸鹽和焦磷酸鹽含量分別上升14.55％和7.08％.其中,二酯磷極不穩(wěn)定,可能隨著測試時間的增長而降解為易被生物利用的活性磷組分.因此,為防止Po在分析過程中造成大量的降解,延遲時間不宜過長,測試時間盡量控制在12～15h之間.進(jìn)一步比較D1=2s和5s的圖譜,D1=5s時焦磷酸鹽的峰信號更加尖銳些,而D1=2s的焦磷酸鹽譜峰相對較寬,D1=2s時單酯磷區(qū)域出現(xiàn)6個詳細(xì)尖峰,而D1=5s時檢測出來8個尖峰.因此,從31P-NMR圖譜分辨率的角度考慮,對于植物和藻類樣品,選擇D1=5s時相對較優(yōu).綜上分析,對湖泊水生植物和藻類樣品NaOHEDTA液的31P-NMR分析時,選擇D1=5s,測試時間在15h左右.

表2　不同延遲時間的藻類磷組分含量(mg/kg)及積分比例(％)Table 2 Concentration and proportion of phosphorus from algae with different delay times

2.331P-NMR與 NaOH-EDTA提取對水生植物和藻類有機磷總量分析

圖3　湖泊水生植物和藻類TP與提取液TP關(guān)系Fig.3 Relationships between NaOH-EDTA extractable TP and TP of aquatic plants and algae

利用優(yōu)化后的方法對湖泊水生植物和藻類中Po進(jìn)行提取,NaOH-EDTA提取液中的TP和水生植物、藻類中的TP呈線性關(guān)系(R=0.997, P<0.01)(圖3);另外,31P-NMR檢測的總Po含量與傳統(tǒng)的磷鉬藍(lán)法分析測定的Po含量也呈線性關(guān)系(R=0.850,P<0.05).這表明本研究優(yōu)化后的提取方法結(jié)合31P-NMR表征可以反映樣品的實際情況,進(jìn)而探討湖泊水生植物和藻類中有機磷的分布和變化規(guī)律.NaOH-EDTA可提取植物和藻類樣品中TP的含量為1184～12419mg/kg,提取率可達(dá)82.94％至99.71％,平均為94.14％.研究結(jié)果表明采用優(yōu)化后的提取液、提取比例以及適合的測試參數(shù)后,液相31P-NMR技術(shù)可以有效且可靠的分析湖泊水生植物和藻類Po,對于后續(xù)研究富營養(yǎng)化湖泊水生植物和藻類Po的動力學(xué)過程和生物可利用性有重要意義[31].

圖4　湖泊水生植物和藻類提取液Po鉬酸鹽分析結(jié)果與31P-NMR分析結(jié)果關(guān)系Fig.4 Relationships between NaOH-EDTA extractable Poand Pocharacterized by31P-NMR in aquatic plants and algae

2.431P-NMR表征水生植物和藻類有機磷組成特征

采用優(yōu)化后的提取方法和檢測參數(shù),分析湖泊水生植物和藻類磷組分的組成特征表明二者均由正磷酸鹽(6×10-6～7×10-6)、單酯磷(4×10-6～ 6×10-6)、二酯磷(-1×10-6～2.5×10-6)、焦磷酸鹽(-4×10-6～-5×10-6)組成[16,21,31].水生植物和藻類31P-NMR分析結(jié)果中Po以單酯磷為主要組成部分.在環(huán)境樣品中,磷組分還包括膦酸鹽(19×10-6～ 24×10-6)和多聚磷酸鹽(-19×10-6～-21×10-6)組分[16,32],但在本研究湖泊水生植物和藻類中未檢測到,可能是由于二者含量較少而低于31P-NMR檢測限,也可能是在采樣以及前處理過程中降解.

圖5　湖泊水生植物和藻類磷組分含量和百分比Fig.5 Contents (a) and proportions (b) of individual P compounds in aquatic plants and algae samples detected by31P-NMR　圖a:磷組分含量,圖b:磷組分百分比,1-3樣品為水生植物(分別為狐尾藻,蘆葦,輪葉黑藻);4-7樣品為藻類(分別為微囊藻,小球藻,螺旋藻,念珠藻)

水生植物Pi占TP的46.64％～65.79％,Po可達(dá)TP總量的34.21％～53.36％;藻類Pi占TP的27.04％～68.73％,而Po甚至可達(dá)TP總量的31.27％～72.96％(圖5).其中,水生植物中單酯磷占TP的31.05％～49.74％,平均含量占Po的92％;藻類單酯磷占TP的19.1％～56.27％,除念珠藻外,平均含量高達(dá)Po的83％.因此,單酯磷是水生植物和藻類中Po的主要組分.當(dāng)然,少量單酯磷也可能在分析過程中發(fā)生降解.例如,由于D1=15s時,測試時間較長(49h),導(dǎo)致了6.08％的單酯磷分解(圖2和表2).值得注意的是,一些二酯磷,例如磷酸酯類易在分析過程中降解為α-甘油酯、β-甘油酯[27];RNA易降解為核苷酸等,由于二酯磷極易降解的特性,在樣品采集、前處理及長時間分析測試過程均可能造成該磷組分的分解.因此,一般來說,用31P-NMR檢測到的二酯磷含量比環(huán)境樣品中的實際含量偏低[17,33].焦磷酸鹽占水生植物TP的0.91％～2.08％,而藻類除微囊藻以外,其他3種藻類平均焦磷酸鹽占TP接近18％,平均含量為1328mg/kg(圖5).其中,藻類焦磷酸鹽含量約為水生植物的35倍.已有研究表明[27,29],焦磷酸鹽具有較高的活性,可以被水生生物等直接吸收利用,是藍(lán)藻水華爆發(fā)的潛在二次磷來源.

3 結(jié)論

3.1 采用0.5mol/LNaOH+25mmol/L EDTA提取劑并控制固液比1:60提取湖泊水生植物和藻類中磷,獲得樣品中TP與Po提取率可高達(dá)90％以上;進(jìn)一步采用液體31P-NMR分析其中Po時,選擇設(shè)置延遲時間(D1)為5s,掃描分析時間為15h左右(掃描次數(shù)為24000次)可獲得較優(yōu)的31P-NMR譜圖,較優(yōu)的提取方法和參數(shù)設(shè)置條件為進(jìn)一步分析湖泊水生植物和藻類Po組成結(jié)構(gòu)特征及其生物地球化學(xué)行為提供科學(xué)依據(jù).

3.2 NaOH-EDTA提取結(jié)合31P-NRM分析表明湖泊水生植物和藻類中磷由正磷酸鹽、單酯磷、二酯磷以及焦磷酸鹽組成,單酯磷均為水生植物和藻類中Po重要組分,其平均含量分別占Po的92％和83％,易降解的二酯磷在水生植物和藻類均較少,占TP的0～6.65％.另外,藻類體內(nèi)焦磷酸鹽含量約為水生植物的35倍.湖泊水生植物和藻類來源的有機磷是藍(lán)藻水華爆發(fā)后潛在的二次營養(yǎng)鹽.

參考文獻(xiàn)：

[1] Baldwin D S. Organic phosphorus in the aquatic environment [J]. Environmental Chemistry, 2013,10(6):439-454.

[2] Zhu Y, Wu F, He Z, et al.Characterization of organic phosphorus in lake sediments by sequential fractionation and enzymatic hydrolysis [J]. Environ. Sci. Technol., 2013,47(14):7679-7687.

[3] 黎 睿,王圣瑞,肖尚斌,等.長江中下游與云南高原湖泊沉積物磷形態(tài)及內(nèi)源磷負(fù)荷 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(6):1831-1839.

[4] Reitzel K, Ahlgren J, Gogoll A, Rydin E.Effects of aluminum treatment on phosphorus, carbon, and nitrogen distribution in lakesediment: a 31P NMR study [J]. Water research, 2006,40(4):647-654.

[5] 李振國,王國祥,馬久遠(yuǎn),等.馬來眼子菜群叢對太湖不同湖區(qū)沉積物磷形態(tài)的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(7):1872-1877.

[6] 葉 春,王 博,李春華,等.沉水植物黑藻腐解過程中營養(yǎng)鹽釋放過程 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(10):2653-2659.

[7] 王 智,張志勇,張君倩,等.兩種水生植物對滇池草海富營養(yǎng)化水體水質(zhì)的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2013,33(2):328-335.

[8] 向速林,朱夢圓,朱廣偉,等.太湖東部湖灣大型水生植物分布對水質(zhì)的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(11):2881-2887.

[9] Tao Y, Yuan Z, Fengchang W, Wei M. Six-Decade Change in Water Chemistry of Large Freshwater Lake Taihu, China [J]. Environmental Science and Technology, 2013,47(16):9093-9101.

[10] 李文朝,陳開寧,吳慶龍,等.東太湖水生植物生物質(zhì)腐爛分解實驗 [J]. 湖泊科學(xué), 2001,13(4):331-336.

[11] Qu X, Xie L, Lin Y, et al. Quantitative and qualitative characteristics of dissolved organic matter from eight dominant aquatic macrophytes in Lake Dianchi, China [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2013,20(10):7413-7423.

[12] Da-Peng L, Yong H.Sedimentary phosphorus fractions and bioavailability as influenced by repeated sediment resuspension [J]. Ecological Engineering, 2010,36(7):958-962.

[13] Monbet P, McKelvie I D, Worsfold P J. Dissolved organic phosphorus speciation in the waters of the Tamar estuary (SW England) [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 2009,73(4): 1027-1038.

[14] Wang J, Pant H K. Identification of organic phosphorus compounds in the Bronx River bed sediments by phosphorus-31nuclear magnetic resonance spectroscopy [J]. Environmental Monitoring and Assessment, 2010,171(1-4):309-319.

[15] Newman R, Tate K. Soil phosphorus characterisation by 31P nuclear magnetic resonance [J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 1980,11(9):835-842.

[16] Cade-Menun B J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy [J]. Talanta, 2005,66(2):359-371.

[17] Cade-Menun B J.Improved peak identification in 31P-NMR spectra of environmental samples with a standardized method and peak library [J]. Geoderma, 2015,257-258:102-114.

[18] Zhu Y, Wu F, He Z, et al. Influence of Natural Organic Matter on the Bioavailability and Preservation of Organic Phosphorus in Lake Sediments [J]. Chemical Geology, 2015,397:51-60.

[19] Ahlgren J, Reitzel K, Danielsson R, et al. Biogenic phosphorus in oligotrophic mountain lake sediments: Differences in composition measured with NMR spectroscopy [J]. Water Research, 2006, 40(20):3705-3712.

[20] He Z, Olk D C, Cade-Menun B J. Forms and lability of phosphorus in humic acid fractions of Hord silt loam soil [J]. Soil Science Society of America Journal, 2011,75(5):1712-1722.

[21] Bai X, Ding S, Fan C, et al. Organic phosphorus species in surface sediments of a large, shallow, eutrophic lake, Lake Taihu, China [J]. Environmental Pollution, 2009,157(8):2507-2513.

[22] Otten T, Xu H, Qin B, et al. Spatiotemporal patterns and ecophysiology of toxigenic Microcystis blooms in Lake Taihu, China: implications for water quality management [J]. Environmental Science andTechnology, 2012,46(6):3480-3488.

[23] Zhu Y, Zhang R, Wu F, et al. Phosphorus fractions and bioavailability in relation to particle size characteristics in sediments from Lake Hongfeng, Southwest China [J]. Environmental Earth Sciences, 2013,68(4):1041-1052.

[24] 陸 瑾,王海文,郝 紅,等.31P-NMR分析濕地沉積物有機磷的方法優(yōu)化 [J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2013,33(11):3157-3161.

[25] Zhang W, Tang W, Zhang H, et al. Characterization of biogenic phosphorus in sediments from the multi-polluted Haihe River, China, using phosphorus fractionation and 31P-NMR [J]. Ecological Engineering, 2014,71:520-526.

[26] He Z, Honeycutt C W, Griffin T S, et al. Phosphorus forms in conventional and organic dairy manure identified by solution and solid state P-31NMR spectroscopy [J]. Journal of Environmental Quality, 2009,38(5):1909-1918.

[27] 張文強,單保慶,張 洪,等.基于液相31P核磁共振技術(shù)的河流沉積物有機磷提取劑選擇研究 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2014,34(1):194-201.

[28] 白秀玲,周云凱,李 斌,等.利用31P核磁共振技術(shù)優(yōu)化太湖沉積物有機磷的化學(xué)提取方法 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2011,31(5):996-1003.

[29] Read E K, Ivancic M, Hanson P, et al. Phosphorus speciation in a eutrophic lake by 31P NMR spectroscopy [J]. Water Research, 2014,62:229-240.

[30] Giles C D, Lee L G, Cade-Menun B J, et al. Characterization of Organic Phosphorus Form and Bioavailability in Lake Sediments using P Nuclear Magnetic Resonance and Enzymatic Hydrolysis [J]. Journal of Environmental Quality, 2015,44(3):882-894.

[31] Turner B L, Mahieu N, Condron L M. Phosphorus-31nuclear magnetic resonance spectral assignments of phosphorus compounds in soil NaOH–EDTA extracts [J]. Soil Science Society of America Journal, 2003,67(2):497-510.

[32] Johnson N R, Hill J E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis [J]. Soil Science Society of America Journal, 2010, 74(5):1786-1791.

[33] Pinchuk G E, Ammons C, Culley D E, et al. Utilization of DNA as a sole source of phosphorus, carbon, and energy by Shewanella spp.: ecological and physiological implications for dissimilatory metal reduction [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008,74(4):1198-1208.

Optimization of extraction and parameters for31P-NMR analysis of organic phosphorus extracted from aquatic plants and algae.

FENG Wei-ying1,2, ZHU Yuan-rong2*, WU Feng-chang2, LIU Sha-sha1,2, ZHANG Chen2(1.College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China；2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China). China Environmental Science, 2016,36(2)：532～568

Abstract：Characterization of organic phosphorus (Po) from aquatic plants and algae by solution31P-Nuclear Magnetic Resonance (31P-NMR) is important to understand its biogeochemical cycling in lakes. Methods of extraction and selection of parameters for NMR characterization and quantification of Po critical. Various extractants and radio of sample to extractants were applied for 31P-NMR. A mixture of 0.5mol/L NaOH-25m mol/L EDTA with a ratio of sample to extractant of 1:60 was the optimal extraction of Po from aquatic plants and algae. When the extract was analyzed by use of 31P-NMR, the delay time (D1) and scanning time were set to 5s and 15h, respectively, which resulted in approximately 24,000 scans. Based on how Samples were extracted and results of 31P-NMR analysis, P in aquatic plants and algae included orthophosphates, orthophosphate monoesters, orthophosphate diesters and pyrophosphate, of which Po accounted for 34％～53％ and 31％～73％ respectively. Orthophosphate monoester was the predominant constituent of Po, which accounted for 92 and 83％ of plants and algae, respectively. The proportion of orthophosphate diesters was small in aquatic plants and algae and accounted for only 0～6.65％ of the TP. The content of pyrophosphate in algae was approximately 35-fold greater than that in aquatic plants.

Key words：lake；aquatic plants；algae；organic phosphorus；31P-NMR

作者簡介：馮偉瑩(1986-),女,內(nèi)蒙古赤峰人,北京師范大學(xué)與中國環(huán)境科學(xué)研究院聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生,研究方向為湖泊環(huán)境污染與治理.發(fā)表論文9篇.

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(41403094,41430743, 41261140337)

收稿日期：2015-07-15

中圖分類號：X171.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)02-0562-07